Способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям

Способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: сельское хозяйство, способы установления потенциальной устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов. Сущность изобретения: способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействия включает получение водного эстракта листьев растений и определение оптической плотности экстракта при 260-280 нм и длине оптического пути 0,5 см. В качестве экстаогента используют раствор с рН 3,0-3,8, полученный мембранным электролизом воды в анодной камере. Экстракцию ведут в течение 25- 35 мин при температуре 19-21° С и весовом соотношении листья:экстрагент 1:10 Сорт считают устойчивым, если оптическая плотность экстракта больше или равна 0,9, и неустойчивым, если она меньше 0,9. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 01 G 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, 4

;0 О

4 (21) 4890422/13 (22) 13.12.90 (46) 15.09.92. Бюл. ¹ 34 (71) Институт физиологии растений и генетики АН УССР (72) И.А. Григорюк, В.Д. Мануильский, М.В. Курик, И,Г, Шматько и С.В, Мануильская (56) Авторское свидетельство СССР № 1371612, кл. А 01 G 7/00, 1988, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К СТРЕССОВЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ (57) Использование: сельское хозяйство, способы установления потенциальной устойчивости растений к комплексу стрессоИзобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам установления потенциальной устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов (водному, низко- и высокотемпературному стрессам) и может быть использовано в практике генетика-селекционных работ при создании высокопродуктивных, устойчивых к факторам внешней среды растений. Для создания новых прогрессивных технологий необходимы сорта, обладающие высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды. В этом плане актуальным является поиск интегральных способов оценки устойчивости растений к экстремальным воздействиям (эасухо-, жара- и морозоучтойчивость). Исходя из экспресс-информации о состоянии фотосинтетического аппарата растений, можно суммировать многие ответные реакции растительного организма, „„Я2„, 1761047 А1 вых факторов. Сущность изобретения: способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействия включает получение водного эстракта листьев растений и определение оптической плотности экстракта при 260 — 280 нм и длине оптического пути 0,5 см. В качестве экстаогента используют раствор с рН 3,0 — 3,8, полученный мембранным злектролиэом воды в анодной камере. Э кстрак ци ю ведут в тече н ие 2535 мин при температуре 19 — 21 С и весовом соотношении листья:экстрагент 1:10.

Сорт считают устойчивым, если оптическая плотность )кстракта больше или равна 0,9, и неустойчивым, если она меньше 0,9. 4 табл, Существует ряд методов, позволяющих определять реакцию растения на воздействие неблагоприятных факторов среды.

Так, в настоящее время известны способа оценки морозоустойчивости озимых зерновых культур путем определения количества калия, перешедшего в раствор после охлаждения (авт. св. СССР ¹ 1207431, кл, А 01 G 7/00, 1986), а также способ

on ределения засухоустойчивости растений по выходу электролитов из листьев пшеницы в раствор в результате его прогрева при 30 — 45 С в течение 4-6 часов (авт, св. СССР ¹ 791328, кл, А 01 G 7/00, 1980). Однако, данные способы позволяют определять морозо- и засухоустойчивость растений лишь в случае воздействия стрессового фактора и возникновения повреждений клеток, в том числе и без оценки степени устойчивости растений в нормаль1761047 ном функциональном состоянии, т. к. выход электролитов из клеток листа усиливается только в условиях летального повреждения, при глубоком обезвоживании мембран и клетки в целом. Кроме того, выход электролитов зависит от уровня оводненности тканей, что при засухе существенно усложняет процедуру измерений, т. к. для объективной оценки требуется регидратация тканей и сопоставление с их устойчивостью, которая при этом возникает (Кожушко Н,Н, Выход электролитов как критерий оценки засухоустойчивости и особенности его использования для зерновых культур // Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным уловиям среды. Всесоюзный НИИ растениеводства им, Н.И. Вавилова. Ленинград, — Колос. 1976, с, 32 — 43).

Наиболее близким по технической сущности является выбранный авторами в качестве прототипа способ определения засухоустойчивости многолетних растений (авт. св, СССР N 1371612, кл. А 01 G 7/00, 1988) путем измерения буферности рН водной вытяжки растительной ткани, при этом чем выше буферность рН водной вытяжки, тем устойчивее растение к засухе, Данный способ осуществляется следующим образом.

Отбирают среднюю пробу или побегов, или почек, или листьев у многолетних растений, произрастающих на фоне недостаточной влагообеспеченности (засухе). Для этого навеску 1 кг 10 в 5-кратной повтор-з ности тщательно растирают в ступке с дистиллированной водой и переносят в ячейку для измерения рН. Общее количество воды

10 м, После замера рН в ячейку для измерения с пробой добавляют 5 10 м 0,1 н.

НС), перемешивают и снова замеряют. По разнице в значениях рН до и после добавления кислоты устанавливают процент сдвига рН.

Однако, хотя этот способ и исключает предварительное воздействие стрессового фактора, но он дает лишь одностороннюю, приблизительную и не точную информацию о степени устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, т, к, в течение онтогенеза растения находятся в зоне действия комплекса неблагоприятных факторов — в летнее время они подвергаются губительному действию почвенной засухи и высоких температур воздуха, а в зимний период — низких температур, Наряду с этим величина рН в интервалах, измеряемых авторами, в значительной степени зависит от многих физических (температу5

55 ра, качество электродов, степень гомогенности среды и др.) и химических (диссорциация ионов, скорость растворения. плотность среды, скорость диффузионных процессов и др,) показателей. Поэтому получение незначительных различий в величинах рН не всегда будет определяться экстрагированием веществ из клеток и тканей растения.

Предложенный авторами физико-биохимический показатель, основанный на установлении процента сдвига рН, является попыткой выявить значительные количественные изменения только лишь малых сдвигов рН и не является достаточно корректным и точным при проведении расчетов. Поэтому актуальное значение имеет возможность получения интегральной характеристики устойчивости растений к комплексу стрессовых воздействий.

Целью предполагаемого изобретения является повышение точности способа определения.

Поставленная цель достигается тем, что способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям предусматривает погружение сегментов листьев растений в электролит — раствор, полученный мембранным электролизом воды в анодной камере (анолит), с рН 3,0 — 3,8 в течение 25 — 35 мин при температуре 19 — 21 С и измерение оптической плотности экстракта при длине волны 260 — 280 нм с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония).

По этому интегральному показателю судят о степени устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов — почвенной засухе, низким и высоким температурам воздуха, считая сорт устойчивым, если этот показатель составляет 0,9 и более, и неустойчивым, если он менее 0,9, Выбор среды рН, при котором производили экстракцию листьев обусловлен тем, что при данных значениях рН, благодаря явлениям осмоса и денатурации белков, в раствор переходят входящие в плоскость мембраныф липиды, которые связаны с белками, Степень выхода липидов изменяет оптическую плотность раствора и позволячет характеризовать общее функциональное состояние растительного организма, Продолжительность экспонирования листьев в растворе связана с тем, что при коротких экспозициях наблюдается недостаточная чувствительность спектрометра, а при длительных — экстрагируются и другие вещества, которые вносят искажение в спектр поглощения и смещают максимум поглощения среды, Кроме того, при более блительных процессах экстракции водный. 1761047

55 раствор несколько окрашивается за счет извлечения пигментов, что также вносит искажение в показания спектрометра, Проведение измерений в интервале температур среды 19 — 21 С определяется интенсивность перекисного окисления липидов. Более низкие темперетуры среды усложняют измерения, а более высокие— сильно активируют перекисное окисление жирных кислот липидов, что отражается на величине оптической плотности раствора в исследуемом участке спектра, Проведение измерений в полосе спектра 260-280 нм связано с тем, что в этой области спектра происходит поглощение коротковолновой радиации полярными липидами мембран, которые входят в светособирающий комплекс фотосинтетического аппарата листа, а это особенно существенно для характеристики изменений процесса транспорта электронов и возможности их перестройки при неблагоприятных условиях среды.

Сущность предлагаемого способа подтверждается примерами конкретного выполнения, R р и м е р 1. В качестве электролита в опытах использовали анолит — воду, полученную мембранным электролизом обычной воды в анодной камере. рН анолита—

3,0 — 3,8 0,1, Термин "аналит" или "анодная жидкость" употребляе-,ся в специальной химической литературе (Химический словарь. Под ред. С, Собецкой, В, Бернацкого, Д, Крыт, Т. Задорожной (при участии

Г. Стиван и Т, Стиван). — Варшава: Научно-техническое издательство, — 1962, с, 32), Электролиз проводили втечение 35 мин при постоянном напряжении 220 В и силе тока

200 мА при обычных условиях. Материалом для катода служила нержавеющая сталь марки ЛХ15Н, содержащая карбид железа (РезС), а анодом — карбид кремния (карборунд, SiC), которые обладают высокими и ротивокоррозионн ыми свойствами. Расстояние между электродами составляло—

40 мм. На катоде происходил процесс восстановления катионов (отдает электроны катионам), а на аноде — процесс окисления анионов (принимает электроны от анионов), Пример 2. Листья озимой пшеницы засухоустойчивого сорта Одесская 51, взятые в фазу трубкования, помещали в кварцевую кювету с раствором, рН которого равно 2,6; 3,0; 3,4; 3,8. 4,2, выдерживали при температурах среды 18 С, 19 С, 20 С, 22 C в течение 30 мин. Затем образовавшийся экстракт переносили в кварцевую кювету толщиной 0,5 см и измеряли оптическую

40 плотность раствора с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония) при длине волны 270 нм. Результаты измерений приведены в табл. 1.

Пример 3. Листья озимой пшеницы засухоустойчивого сорта Одесская 51, взятые в фазу трубкования, помещали в кварцевую кювету с раствором, рН которого

3,4, и выдерживали при температуры среды

20 С в течение 20, 25, 30, 35 и 40 мин. Затем образовавшийся экстракт переносили в кварцевую кювету толщиной 0,5 см и измеряли оптическую плотность раствора с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония), при длине волны 250 нм, 260 нм, 270 нм, 280 нм, 290 нм. Результаты измерений приведены в табл. 2.

Как следует из данных, приведенных в табл. 1 и 2, наиболее оптимальными условиями для экстракции веществ из листьев растений является рН раствора 3,4, температура среды 20 С, продолжительность процесса экстрагирования 30 мин и измерение оптической плотности раствора при длине волны 270 нм.

Для проверки эффективности способа проводили опыты с сортами растений, различающихся по своей устойчивости к стрессовым воздействиям.

Пример 4. В опыте использовали сорта озимой пшеницы Одесская 51, Ровенская 49, Мироновская 808, Кишиневская ранняя, Чайка и Белоцерковская 47, а также сорта картофеля Темп, Прикарпатская, Гатчинский и Мавка. С этой целью готовили водные экстракты листьев пшеницы на фазе появления 4-го листа, а картофеля — на фазе начала цветения в растворе с рН 3,5 при температуре 20 С и продолжительности процесса экстракции — 30 мин. Оптическую плотность экстрактов листьев определяли при длине волны 270 нм на спектрометре

356 фирмы "Хитачи" (Япония), Параллельно в опыте определяли оптическую плотность экстрактов по заявляемому нами способу и с помощью стандартной буферной смеси раствора, включающего 6,05 мл 0,2 М йагНРО4 и 13,9 мл 0,1 М лимонной кислоты, имеющего диапазон рН от 2,2 до 8,0 при температуре от 15 С до 30 С (Перельман

В,И. Краткий справочник химика. — М.: 1951, с. 498).

В результате экспермиента установлено, что экстрагирование органических и неорганических веществ из листьев растений по предлагаемому нами способу с помощью электролита — раствора, полученного мембранным электролизом воды в анодной камере (анолит), является существенно более

1761047 эффективным, чем буферной смесью растворов (табл. 3), Следовательно, применение буферной смеси растворов не позволяет выявить достоверные различия между исследуемыми сортами в коэффициентах оптической плотности, Это обусловлено тем, что химические вещества буферного раствора могут образовывать нерастворимые соединения и комплексы и давать нежелательные реакции со срезой (Бейтс P.

Определение рН, Теория и практика. — Ленин рад, отд., Химия, 1972. — Изд. 2-е, с, 114), подавлять синтез многих ферментов и вызывать дезорганизацию структуры и функций мембран растительной клетки (Гизе А. Физиология клетки. — М.; Изд. ИЛ,—

1959, с. 43 — 54; Гродзинский А.M., Гродзинский Д.M. Краткий справочник по физиологии растений. — Киев: Наук. думка, 1964, с. 301), Среды обычных растворителей вода отличается наиболее высокой диссоциирующей (ионизирующей) способностью (Кульман А.Г, Общая химия, — M. Изд. с.-х. литературы, журналов и плакатов. 1961, с.

217; Бейтс Р. Определение рН. Теория и практика. — Ленинград, отд„Химия, 1972,— изд. 2-е, с, 162) и, по сравнению с буферными смесями растворов, является нетоксичным, сравнительно энергетически дешевым и легко регенирируемым экстрагентом (Химический энциклопедический словарь. — M.:

Советская энциклопедия, Гл, ред. И.Л, Кнунянц. — 1983, с, 693).

Таким образом, можно сделать заключение, что для осуществления предлагаемого нами способа какой-либо раствор веществ любой концентрации с низкими значениями рН неприемлем, поскольку стандартные буферные смеси растворов оказывают ингибирующее влияние на процессы экстракции веществ из листьев растений и не могут использоваться для определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям, Пример 5, В опыте использовали сорта озимой пшеницы Одесская 51, Ровенская 49, Мироновская 808, Кишиневская ранняя, Чайка и Белоцерковская 47, а такуже сорта картофеля Темп, Прикарпатский, Гатчинский и Мавка. С этой целью готовили водные экстракты листьев исследуемых сортов растений (для озимой пшеницы на фазе появления 4-го листа, для картофеля на фазе начала цветения) в водном растворе с рН 3,5 при температуре 20 С и продолжительности процесса экстракции 30 мин. Оптичес кую плотность экстракта определяли при длине волны 270 нм на спектрометре 356 фирмы "Хитачи" (Япония). Параллельно в

55 опыте определяли степень устойчивости растений озимой пшеницы и картофеля к стрессовым воздействия по способу-прототипу (табл. 4), Полученные экспериментальные данные по способу-прототипу свидетельствуют, что по разнице в значениях рН до и после добавления кислоты не возможно установить существенные достоверные различия и точно оценивать степень устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов среды, Для подтверждения целесообразности предложенного нами способа в опыте определяли снижение продуктивности исследуемых растений под воздействием стрессовых факторов(почвенной засухи, низких и высоких температур воздуха).

С этой целью активно вегетирующие растения подвергали воздействию низко-, высокотемпературного и водного стрессов в камерах искусственного климата ВКШ-73 и

КНТ-1; низкотемпературный стресс создавали путем промораживания растений до

-15 С в течение 2-х суток, высокотемпературный стресс создавали путем выдерживания растений при температуре +40 С в течение 4-х часов, а условия почвенной засухи создавали путем прекращения полива растений в течение 12 суток, При этом влажность почвы в сосудах снижалась до 25 от ее полной влагоемкости, а водный дефицит листьев увеличивался до 45,6 .

Результаты исследований показали (табл, 4), что у сортов растений, обладающих устойчивостью к комплексу стрессовых факторов среды, оптическая плотность экстракта существенно увеличивается -от

091 до 1,12 (т. е. составляет 0,9 и более).

Напротив, для неустойчивых сортов растений к комплексу стрессовых факторов среды характерно существенное снижение этого показателя от 0,86 до 0,75 (т. е, менее 0,9).

Следует отметить, что способ-прототип предназначен для оценки устойчивости растений только к засухе и не пригоден для определения и оценки устойчивости их к комплексу стрессовых факторов среды.

Измеренные нами по способу-прототипу величины не дают возможности выявить достоверные различия между исследуемыми сортами озимой пшеницы и картофеля ввиду низкой точности и незначительной разницы в измеренных значениях рН, В то же время заявляемый нами способ является более эффектвным, чем способпрототип, т. к, позволяет более надежно оценивать непосредственно устойчивость мембранных структур, которые являются адаптивными мишенями клетки и интеграль1761047

55 но отражают потенциальную устойчивость растений к комплексу стрессовых факторов среды. Кроме того, данный способ отличается существенно более высокой точностью, поскольку дает возможность без непосредственного воздействия стрессового фактора характеризовать потенциальную устойчивость и функциональную активность фотосинтетического аппарата растений к водному, низко- и высокотемпературному стрессам.

В предл;"-аемом нами способе впервые предложено экстрагирование веществ из листьев растений с помощью электролита с низкими значениями рН, полученного мембранным электролизом воды в анодной камере с применением специальных некорродирующих электродов. Это позволяет по сравнению со способом — прототипом получать существенно более высокий положительный эффект, который достигается за счет более высокой разности потенциалов, возникающих между внешней и внутренней поверхностью клеточных мембран листьев растений (рН клетки 6,2, слабо кислая реакция) и электролита — раствора, полученного мембранным электролизом воды в анодной камере (анолит, рН 3,5, крайне кислая реакция). Такие существенные различия обеспечивают более полное и равномерное извлечение из листьев не только органических и неорганических веществ, но также и белков и, особенно, липидов, которые регистрируются по спектрам поглощения только при длине волны 260 — 280 нм и измеряются с помощью двухлучевого спектрометра 356 фирмы "Хитачи" (Япония). Важно отметить, что добавление к воде кислоты не дают положительного эффекта, В предлагаемом нами способе экстрагирование веществ из листьев растений происходит за счет осмоса, вызывающего передвижение воды из раствора, имеющего высокий водный потенциал (ВП), в раствор с низким ВП. При осмосе молекулы воды поступают через полупроницаемую мембрану в гипертонический раствор до тех пор, пока ВП с обеих сторон не станет одинаковым (Рейвн П., Эверт P., Айкхорн С. Современная ботаника. — М,:

Мир, ч. 1, 1990, с. 65 — 66).

Таким образом, определение устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов по способу-прототипу является существенно менее точным, чем определение устойчивости растений к комплексу стрессовых факторов по заявляемому нами

35 способу с помощью электролита — водного раствора с рН 3,0 — 3,8, полученным мембранным электролизом воды в анодной камере. Это обусловлено тем, что условия опыта в способе-прототипе не позволяют точно регистрировать с помощью селективного электрода малые изменения рН водного экстракта листьев и вносят существенную погрешность в такой незначительно изменяющийся показатель как измеряемая разница рН, Из литературы (Кульман А,Г. Общая химия, — M. Изд. с.-х. литературы, журналов и плакатов. 1961, с. 226) известно, что чем раствор более кислый, тем выше в нем концентрация водородных ионов и тем меньше рН. Это означает, что активность растворов воды — как амфотерного электролита, зависит от рН. B кислых средах концентрации ионов водорода выше, а в щелочных — наоборот — ниже. (Сена Л.А. Единицы физических величин и их размерности. — М.: Наука.

Главная редакция физико-математической литературы. 1988, с. 431).

Предлагаемый нами способ может быть использован в селекции для отбора и сравнительной оценки степени устойчивости районированных сортов и перспективных линий и форм растений к водному, низко- и высокотемпературному стрессам. Полученные количественные данные по заявляемому способу могут быть также применены при исследовании механизмов. устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным факторам среды при их выращивании в контрастных поч ве н но-кл иматических зонах.

Формула изобретения

Способ определения устойчивости растений к стрессовым воздействиям, включающий приготовление водного экстракта листьев растений и определение физиолого-биохимического показателя экстракта, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, экстракцию осуществляют в течение 25 — 35 мин при

19 — 21 водным раствором с рН 3,0 — 3,8, полеченным мембранным электролизом воды в анодной камере, при массовом соотношении листья: экстрагент 1;10, а в качестве физиолого-биохимического показателя определяют оптическую плотность экстракта при длине волны 260—

280 нм и длине оптического пути 0,5 см и отномят сорт к устойчивому при показателе, большем или равном 0,9, и неустойчивому, если менее 0,9.

1761047

Таблица!

Влияние рН растворов и температуры среды на оптическую плотность экстракта листьев озимой пшеницы сорта Одесская 51 при длине волны 270 нм

Температура среды,ыС

Варианты опыта

18 19 20

Оптическая плотность экстракта листьев (Kd), в относительных е ини ах

Зкстракция листьев при рН раствора:

2 6

0,39 0,04

0,4180,04

0,53 0>06

0,81 0,07

0,48"0,05

0,78 -0,04

0,37а0,О5

0,47е 0,06

0,42ьО>03

0,61-0,05

0,77 0, 04

0,69 0,06

0,96 -0,06

0,81+ О, 05 0,87+0,07

0,73 -0,02

0,75- 0,06 0,64- 0,04 (0,01

0 58+0 07 сО >01

0,67 0,05 (0,02

0,73 -0,07 с 0,001

Та блиц а2

Влияние длительности экстракции и длины волны на оптическую плотность экстракта листьев озимой пшеницы сорта Одесская 51 при рН раствора 3,4

Варианты опыта

Длина волны, нм

250

Оптическая плотность экстракта листьев (Kd) в относительных единицаК

Длительность экстракции листьев, мин:

0,66-0,07 0,78+0,05

0,74 0,02 0>83+0,07

0,64 0,03

0 7i -О, 03

0,71>0,06

0,79 -0,08

0,87"0>07

0,86 -0,02

0,88 -0,02

0,96 -0,01 0,90 0,03

0,87 0,06

0,74 -0,07

0 83 0,05

0,8040,02

0,79 -О, 01

0,89 0,03

О 7940>02 0>75+0>05 г0,02 (0,01 (0,00! > 0>001, 0,02

Твблицв3

Сравнительные даииыв устойчивости растений к стрессовым воздействиям при экстрагивовании веществ из листьев по заявляемому сгюсобу и с гюмочью бу;>ериой смеси растворов

Исследуемые сорта

Коэффициент оптической пгютиости Е4зтэ (в относительных единицах) при зкстрагироваиии веществ иэ листьев буФерной смесью растворов (рН 3,5), включающей

6,05 ип 0,2 0 Ка>НРОЧ и 1 3,9 мп С,l М пимоииои кисгюты

0,93 O 05

0,86 -С,С4

0,61 С,C3

0,62 С,С2

С,БС О,С1

0,91+ С,С4

0,84 С,С2 хС,СС1

С 59- С,С3, Ю,Сг

3,0

3,4

3,8

4,2

Озимая пшеница

Одесская 51

Ровенская 49

Мироновская 808

Кишиневская ранняя Ьйкв

Белоцерковская 47

Картофель

Темп

Прикарпатский

Гатчинский навив

0,54+ О, 04

0,62 -0,05

0,83-0,04

0>86 -0,07 эпвктролитон-раствором полученном мембранным зпектропиэом воды в аиодиой камере (аиопит, рН 3,5) по заявляемому способу о,96зС,СБ

С,ВБ-С,СБ

1,1 С С, 04

С,82 -С,С3

1,12 0,08

0,75+0,05

40,СС1

D,52>С,С2

С,БС С, С!

С 53 -С 01

С,52-0,С3

С,52- 0,01

0,52-0,82

< 0,05

0,59 -О, 05

0,83ь0,07

0,71+ 0,08 2

0,61 -0,08 (О 001

>Д л

>S (Л л

m z m

S >S о

> . - >

ovo

1- -" 1uQ,o

»Х»

) ;

l2

S т

>S о (о

»

Q} т

)S (Q

Х т

)S о

1о

»> (D

>S Ш д S ш т

> т о

> I—

О О

» о в

)S

l2 >S

S л

Ш

> о т

1- >S о о

» (в о

l с о

К

Q}

lo

ГП

l2

S т

> о

}о

» (D

1 (С» ((} LO»

z o c о s (DO 1ссо (D О I(D O (-L ас с

О

» IО л о х m

Qj с т

Ш >S о () I» с

S о а с

»

LO о о о с о!

О о }с о о а с

o с»»

}о с

ZOS а о м

С:> о ю

С \

0 (:>

" .1 сч

Ю с»

+1 0 л с» х а

И т (D

z с>) - (4

C) О с> о

+I +I сЧ CO (} лл о о сч

o o

C) C)

+I +!

CO Ю (4 с»

Q} Ш

Х д (}}

z в (>}

Л ГП а (:)

C) .>!

z

Ш с (D

Сс (D а с о

I 1

>Е (2 о i

I- V

О

» а

z (U с (D с (D

CL с о

S

z а с»

m LO а о о

m o

o u

X ((} o

)S )S д

m ) (2

S т ш

> S >S ото (- >Х 1v o o

» (- »

v в

z»z

>Е Ш л

S >

i o

1о о

I- »>

О (D

»вЂ”

)S

Ш

s т

> о

1v

)

О

Ш

S т

> о

I— о

» д

Z l(D О

c o

Q} (Q

I- S (» т а с (D .(». (о

1 о

}о

Ш о

Iо

IZ )S (D О

О

S U

g т

m) 1о с о о с о х л X

z (О л т с s

Q} z

С( о ш СО

О Ю о о

+I (((1

СО л с» ю с)

С:)

+I м

О> с:> ю

Ю

o o

+! О ю л о

-л с» л (:>

+!

Ю 0 .0 ю о

Cl C)

+! 0 0

О} CO

o o

»>

z о

Q} (() (I} о с

:Г

z (D

3 с

)S о

S с!) о

z о с с

-0

l

1Y о е х м0л

&CO С4 л ю

r mю ю

LA СО Ю С

CO - e»

О м с>

00 Ю 2 с о

CL! !

X I л

Ш Ш l оо!

О а о о (D 1-

C}. Y (Q 1

О !

Е

z (D (О ((}

I (I} (= о

Ш о в

Ql — о m

1- o o д Y ) сне о 0 о

+! л

С 4 сЧ ю 0

С» ! )

+l O л

" 01

CO с }

Ю о (Ч +!

С4

Ю

СО юл» л СМ С4

+I +! +! солю

C) CO (.! м с! с:> (4

CV

o o

+I

o o, Ю

С»

4) (о о

S т

)s о

1о

1О о с

z .»

m o

s o

I- О

»>

С.с о

CL с:

« 1

> I

1 (П I

1- !

> !

Q} l

3!

О 1 (D (I} д а р

1- Ш о о а х

I- (I} д (D Ш о(о о

w — o м с(C) О

+I

СО 0

l м л — СЧ л с»вЂ”

+! с» (Ч

«о

СО

СО

Ю

LA

LQ (4 и3 - 3

О С)

+! +! м д.

-> .0 (4

00 -4 Ю л

1 мсч

+! +I +l

С4 СЧ CO

cU mo

--» -! (4 с 4

+l м

C)

LA с:) !

О о х а 0

6 л

:Г -» о сс

Q} ((»

L(»

О> ю а а (»

r(}

Y О

О

О Q}

Q} Ш сс о

О 0

О

1Щ с

CL

Q}

> а s

G; ((>

О

Ш (D а а

z x

3 z>s

S ((} Ш а:Г

Q} л

З

»

С? (D (()

IO CL о о о! (}}

Б с

Б

Y о

S т у

Щ (2

L- Z о (2 СО ою

Z CO о а сс

Б; Ш х л с (D Э. о

>- C а ((} (D

1а ((}

z ш

:Г с>) S

o r

1

1

1

I

1 !

1 (л

1

1

1

I

I

I

I

1

1

1

1

1 !

1 !

I ! !.— ——

1

I

1

1

l ! ! ! !

I

I

1

l

1761047

> > л л

m>s m д S т ш т

> S > о т о

1- >S Iu o u

» I- » (DО В » м сч ооо

О О О С4

+i л! о о юм (4 1 — С4 с» >

o o с» а - . м о о с> л л оооо

>> yl + О л

СО 0 сО о л л

o o с:>