Фрагмент днк, кодирующий часть поверхностного белка сд4т - лимфоцитов человека, ответственную за связывание с протеином др120 вируса иммунодефицита человека

Фрагмент днк, кодирующий часть поверхностного белка сд4т - лимфоцитов человека, ответственную за связывание с протеином др120 вируса иммунодефицита человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: молекулярная биология , генноинженерная биотехнология. Сущность изобретения: получена синтетическая ДНК abc с оптимизированным для Е scherichia coli кодоновым составом, кодирующая область ABC: 1-185 поверхностного белка СД4 Т-лимфоцитов человека, ответственная за связывание с гликопротеином др 120 вируса иммунодефицита и ее фрагментов a,b,c, ab, кодирующих соответственно области СД4, А: 1-60, В: 59-110, С: 109-185, АВ: 1-110. Фрагмент а с кодируют два концевых домена СД4 субфрэгмента а - первый центр связывания с гликопротеином др 120 ВИЧ, субфрагмент b - второй центр связывания , субфрагмент с - второй домен белка СД4, субфрагмент ab - оба центра связывания . 1 ил. (Л С xi о 00 О 00

СОЮЗ СОВЕТС ИХ

COl (ИАЛИСТ 1ЧЕ СКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО изОБРетениям и ОткРытиям

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6 (21) 4858313/13 (22) 10.08.90 (46) 15.09.92. Бюл. N. 34 (71) Институт иммунологии (72) Э.Е.Галеев. А.П.Гузаев. Б.К.Чернов.

О Ю.Смирнов, В.М.Абрамов и B.Ï.Çaâüÿëîâ (56) Richardson N.Å., Kowa!ski M.. Brown N,R,.

Chang Hsiu-Ching. Siliciano R.F.. ес. а!.. А

soluble CD4 protein selectively inhibits HIV

replication and syncytium formation. — Nature, 1988, v.331, п.651, р. 78-81.

Arthos J., Оееп К.С,. Chaikin M.À., Fornwald J.А., Sathe G., et. al. identification

of the residues in human CD4 с itical for the

binding of НИ. — Cell. 1989, v.57, и. 3, р.

469-481.

ЕаМао N.R., Warton М., т ittman О.R. The

envelope glycoprotein of the human

immunodeficiency virus binds to the

immunoglobuline-like dom.sin of CD4.—

Nature, 1988, v. 334, и. 6178. р. 159-162.

Sweet R., Arthos J,. Deen К,. Fornwald J„

Chaikin M„et, al. Inhibition of the HIV/SIV

viruses by soluble derivatives of Т4. — J.Cell.

Biochem., 1989, Suppl 13В, р. 241.

Bates P.À., McGregor M,J„ Islam S.À., Sattentau Q.J.. Sternberg М.J.F. А predicted

three-dimensional structure for the human

immunodefiniency virus binding domains of

CD4 antigen. — Protein Engi >ecting, 1989, ч.

З,п.1.р.1321, Klebet-Emmons T., Jameson В,А., Morrow

W. l.W. The др120 CD4 inteiface: structural, immunological and pathological

considerations. — Biochem. Binphys. Ас-а, 1989, ч. 989, и, 3, р. 281-300.

Tabaczewski P,. Schlie. sei G., Weiss

Е.Н., Rieber Е.P,. Riethmulier G.. Ж 1761808 А1 (я)5 С 12 М 15/48, С 12 0 1/68, С 12 Р 19/34

Recombinant C04 polypeptides то characterize functional epitopes of т 1е С04

molecule. — Immunobiology, 1988, v. 178. и

1-2, р.116.

Chao B.Н.. Costopoulos D.S.. Curie) T., Bertonis J.M., Chrisholm P., et. al„— А 113amino acid 1га9глеп1of C04 produced in Е.coli

blocks human immunodeficiency virusinduced сеИ fusion. — J.Biol. Chem.. 1989. v.

264, п.10, р. 5812-5817.

Международная заявка PCTN 88/01304, кл. С 12 О 1/68, 1988. (54) ФРАГМЕНТ ДНК. КОДИРУЮЩИЙ

ЧАСТЬ ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА СД 4 ТЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА СВЯЗЫВАНИЕ С

ПРОТЕИНОМ GP 120 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: молекулярная биология, генноинженерная биотехнология. Сущность изобретения: получена синтетическая

ДНК abc с оптимизированным для Е

scherichia coli кодоновым составом, кодирую ща я область А В С: 1-185 поверх ност ного белка СД4 T-лимфоцитов человека, ответственная за связывание с гликопротеином gp

120 вируса иммунодефицита и ее фрагментов а,b,с, аЬ, кодирующих соответственно области СД4, А: 1-60, В: 59-110, С: 109-185, АВ: 1-110. Фрагмент а с кодируют два концевых домена СД4 субфрагмента а — первый центр связывания с гликопротеином gp 120

ВИЧ, субфрагмент Ь вЂ” второй центр связывания, субфрагмент с — второй домен белка

СД4, субфрагмент аЬ вЂ” оба центра связывания. 1 ил.

1761808

Изобретение относится к молекулярной биологии и генноинженерной биотехнологии и касается получения ДНК, кодирующей часть поверхностного белка CD4 Т-лимфоцитов человека, ответственную за связывание с гликопротеином gp 120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и ее фрагментов, продукты экспрессии которых могут найти применение при исследовании молекулярных механизмов развития синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД), диагностики ВИЧ, терапии и профилактики СПИД.

Известна кДНК, полученная из природной мРНК, кодирующая 374 аминокислотных остатка (АКО) N-концевой области поверхностного белка CD4 Т-лимфоцитов человека, ответственной за связывание с гликопротеином gp 120 ВИЧ.

Недостатком данной ДНК является наличие участков, кодирующих фрагменты белка С04, функционально незначащих для связывания с гликопротеином gp120 ВИЧ, поскольку извес но, что наиболее важной для связывания является область С04 с 1 по

106 АКО, с 37 по 83, с 41 по 55, с 40 по 60, с

36 по 49 и с 81 по 92, существенна для связывания также область с 83 по 159 АКО; отсутствие удобных сайтов рестрикции для уменьшения ее размера.

Известны фрагменты кДНК, полученной из природной мРНК, кодирующие поли пептиды N-концевой области CD4 протяженностью 388, 351, 152 АКО.

Недостатки ДНК, кодирующих первые два полипептида, также заключаются в избыточной протяженности. Недостатки ДНК, кодирующих полипептид протяженностью

152 AKO состоят в том,что они значительно перекрывают участок, минимально необходимый для связывания gp120 и в то же время не включают весь фрагмент, взаимодействующий с gp120.

Известны также фрагмент кДНК, кодирующий полипептид N-концевого района

CD4 протяженностью 113 АКО, соответствующий последовательности первого домена и междоменного участка белка.

Недостатками известного фрагмента являются, во-первых, его кодоновый состав, нехарактерный для прокариотов вообще и

Е.coli в частности, во-вторых, отсутствие сайтов рестрикции, позволяющих уменьшить их размер для локализации минимального фрагмента связывания белка gp120.

Наиболее близкими по сущности и достигаемому результату являются фрагменты кДНК, кодирующие полипептиды N-концевой области С04 протяженнос ью с -23 по

374, с 1 по 111, с 112 по 181, с 287 по 374, и с 182 по 286,АКО.

Общими недостатками этих фрагментов являются: неоптимальный кодоновый состав для экспрессии в прокариотических организмах и, в частности, в Е.coli неоптимальный, избыточный размер фрагментов: фрагмент 1-111 кодирует сразу оба центра связывания с белком gp120, последние два из заявленных фрагментов кодируют полипептиды 287-374 и 182-286, несущественные для связывания с белком

gp120, а первый фрагмент кодирует полипептид -23-374, соответствующий всей растворимой части белка CD4, включающей в себя протяженные области-23-0 и 182-374, также несущественные для связывания. В то же время отсутствуют удобные сайты рестрикции для генноинженерных манипуляций, позволяющих уменьшить размер фрагментов до оптимальных величин, определяемых размерами центров связывания белка CD4. Неоптимальный кодоновый состав для экспрессии в прокариотах и отсутствие достаточного количества удобных сайтов рестрикции обусловлено происхождением фрагментов из кДНК-копии мРНК эукариотического (человеческого) гена CD4.

Целью настоящего изобретения является получение синтетической ДНК, кодирующей часть поверхностного белка CD4

T-лимфоцитов человека. ответственную за связывание с гликопротеином gp120 вируса иммунодефицита человека, кодоновый состав которой оптимизирован для

Escherichia coii.

Поставленная цель достигается получением синтетической ДНК аЬс с оптимизированным для Escherichia coli кодоновым составом, кодирующей область АВС; 1-185 поверхностного белка CD4 Т-лимфоцитов человека, ответственную за связывание с гликопротеином gp120 вируса иммунодефицита человека, и ее фрагментов а, Ь, с, аЬ, кодирующих соответственно области CD4:

А: 1-60, В: 59-110, С: 109-185, АВ; 1-110.

Фрагмент abc кодирует два N-концевых домена CD4, субфрагмент а — первый центр связывания с гликопротеином gp120 ВИЧ, субфрагмент Ь вЂ” второй центр связывания, субфрагмент с — второй домен белка CD4, субфрагмент аЬ вЂ” оба центра связывания.

Ниже приведены нуклеотидные последовательности фрагментов а,Ь,с и фрагментов ah и аЬс.

Изобретение осуществляется следующим образом, Твердофазным автоматическим фосфитамидным методом синтезируют олигодезоксирибонуклеотиды

1761808

30

50

55 (1-16), выходы и свойства синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (1-16) и редставпены в таблице.

Ол игодезоксирибонуклеотиды (2,3,5,710,12,14,15) фосфорилируют АТФ по 5 -концу с помощью полинуклеотидкиназы (ПНК) фага Т4. Соединения (1-3, 9-11) ипи (4,5,12,13) или (6-8, 14-16) смешивают в эквимопекулярных соотношениях, нагревают при 95 С в течение 5 мин, охлаждают до комнатнои температуры в течение 3 ч, проводят межнуклеотидную сшивку ДНК-лигазой фага Т4, Продукты соответствующих длин выделяют электрофорезом в ПААГ, получают фрагменты (а) или (b) или (с) соответственно.

Фрагмент (а) смешивают с векторной

ДНК плазмиды pUC19, предварительно ресщепленной рестриктазами Рвт1 и Крп1, а фрагменты (Ь) или (с) — c векторной ДНК плаэмиды pUC18, расщепленной теми же рестриктазами. обрабатывают ДНК-лигаэой фага Т4. Полученными смесями трансформируют клетки E.coll JM103, трансформанты отбирают на селективной среде с ампицилпином. Рекомбинантные ДНК со вставками нужной длины выявляют рестриктным анализом ппазмид, выделенных из полученных клонов, Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов подтверждают секвенированием по методу Сэнгера. Наработкой плазмид, включающих фрагменты заданных нуклеотидных последовательностей, получают рекомбинантные ДН К рРС04а-19, рРС04Ь-1.8, pPCD4c-18 соответственно, содержащие фрагмент(а) и Pst1-Kpn1 — фрагмент вектора р0С19, фрагмент (b) и Pst1-Kpn1 — фрагмент вектора pUC18, фрагмент (c) и Рзт1-Kpn1— фрагмент вектора pUC18.

Для получения рекомбинантных ДНК, содержащих фрагменты (ab) и (аЬс) и Pst1Kpn1 — фрагмент вектора pUC19, рекомби нантную ДНК рРС04Ь-18 расщепляют рестриктазами Во1П и EcoR1 и выделяют фрагмент длиной 177 п.о., смешивают его с векторной ДНК, полученной расщеплением рекомбинантной ДНК pPCD4a-19 рестриктаэами В91П и EcoR1 и обрабатывают ДНКлигазой, Полученной смесью трансформируют клетки Е.coll J M103, трансформанты отбирают на селективной среде с ампициллином. Рекомбинантную

ДНК со вставкой нужной длины выявляют рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных клонов. Нуклеотидную последовательность сты ка подтверждают секвенированием по методу Сэнгера. Наработкой плазмиды, включающей фрагмент заданной нуклеотидной последовательности, получают рекомбинантную ДН К рРС04аЬ-19. содержащую фрагмент (ab) и

Pst1-Kpn1 — фрагмент вектора р0С19. Рекомбинантную ДНК рРС04с-18 расщепляют рестриктазами Pst1 и EcoR1, выделяют фрагмент длиной 251 п.о„смешивают его с векторной ДНК, полученной расщеплением рекомбинантной ДНК pPCD4ab-19 рекстриктаэами Pst1 и EcoR1 и обрабагывают

ДНК-лигазой. Полученной смесью трансформируют клетки Е.coll JM103. трансформанты отбирают на селективной среде с ампициллином, Рекомбинантную ДНК со вставкой нужной длины выявляют рестриктным анализом ппазмид, выделенных иэ полученных клонов. Нуклеотидную последовательность стыка подтверждают секвенированием по методу Сзнгера. Наработкой плазмиды, включающей фрагмент заданной нуклеотидной последовательности, получают рекомбинантную ДНК рРС04аЬс- l9, содержащую фрагмент (аЬс) и Pst1-Крп1 фрагмент вектора pUC19.

Ниже приведена схема получения всех рекомбинантных ДНК, Фрагмент (аЬс) перекпонировапи также в вектор M13mp18. Рекомбинантную ДНК рР CD4ab-19 обрабатывают рестриктазами

HindLLI и EcoR1, выделяют фрагмент длиной

599 п.о., смешивают его с векторной ДНК, полученной расщеплением РФ-ДНК

М13п1р18 теми же рестриктазами, и обрабатывают ДНК-пигазой фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки Е.coll

JM103. Рекомбинантную ДНК со вставкой нужной длины выявляют рестриктным анализом РФ-ДНК фагов, выделенных иэ полученных бляшек. Наработкой ДН К, включающей фрагмент длиной 599 п.о., получают рекомбинантную ДНК М13С04аЬс, содержащую фрагмент (abc) и EcoR1-HlndLL1 — фрагмент вектора M13mp18.

Сущность предлагаемого изобретения раскрывается из рассмотрения следующих примеров.

Пример 1. Синтез опигодеэоксирибонуклеотида 13.

Синтез олигодезоксирибонукпеотида

13 проводят твердофазным амидофосфитным методом на синтезаторе 380В (Applied

Biosyster s, США) в шкале 0,2 мкмоль с испольэов- гм широкопористой матрицы (намина .;: д,аметр пор 800 А) по следующей программе: промывка и подготовка мономеров 23 с, конденсация 80 с, кэпирование 30 с, окисление 40 с, промывка 106 с, детритилирование 60 с, промывка 65 с. В качестве мономеров используют N-ацил-5

-О-диметокситритип-3 -О-((2-цианоэтил)N,N-диизопропиламидофосфит)-2 -дезокси1761808 рибонуклеоэиды, причем если рибонуклеозид = аденозин или цитидин, то ацил = бензоил, если рибонуклеозид = гуанозин, то ацил = изобутирил, если рибонуклеозид = тимидин, то ацил отсутствует, В качестве активатора межнуклеотидной концентрации используют тетразол, детритилирующего агента 2 -ный раствор трихлоруксусной кислоты в дихлорметане, окислителя 0,1 M раствор иода в смеси пиридин-вода-тетрагидрофуран 2:20:75, кэпирующих реагентов: равные объемы реагента И (уксусный ангидрид-2,6-лутидин-тет рагидрофуран 10:10;80) и реагента В (1-метилимидазол-тетрагидрофуран 16:84), растворителя для промывки и конденсации — ацетонитрил. После завершения последнего шага наращивания цепи

5-О-диметокситритильную группу не удаляют, готовый олигодезоксирибонуклеотид от-" щепляют от матрицы 30%-ным раствором аммиака и деблокируют в том же растворе в течение 8 ч при 60 С, Летучие продукты удаляют в вакууме, остаток растворяют в 1,0 мл воды. целевой продукт выделяют методом

ВЭЖХ на колонке Mucleosil 300-5С18 (4,6х250 мм) в линейном градиенте ацетонитрилв (от 10 до 40 ) в 0,05 M ацетате аммония. Собранную фракцию упаривают досуха, к остатку прибавляли 2 мл 80 -ной уксусной кислоты, выдерживают 20 мин, упаривают досуха. Остаток растворяют в 1,0 мл воды, полностью деблокированный олигодезоксирибонуклеотид выделяют методом ВЗЖХ на той же колонке в линейном градиенте ацетонитрила (от 5 до 30 /) в 0.05

M ацетате аммония. Собранную фракцию упаривают досуха, дважды упаривают с 2 мл воды, растворяют в 1,0 мл воды и регистрировали УФ-спектр для определения выхода соединения 13. Воду упаривают, остаток переосаждают из 2 /,-ного перхлората лития в ацетоне. Получают 1.1 опт.ед. при 1= 260 нм (о.е.), что соответствует 30 мкг олигодезоксирибонуклеотида 13.

Пример 2, Фосфорилирование олигонуклеотида 2 по 5 -концу, Растворяют 200 пмоль олигонуклеотида 2 в 50 мкл буфера. содержащего 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ MgCb. 10 мМ ОТТ, 10 мМ спермидин и

АТФ в концентрации 100 пмоль/мкл, прибавляют ПНК (10 ед) и инкубируют 40 мин при 37 С. Фермент инактивируют прогреванием 65 С в течение 10 мин, Пример 3. Лигирование олигонуклеотидов 4,5,12,13. Получение фрагмента (b), Фосфорилированные олигонуклеотиды

5 и 12 и нефосфорилированные 4 и 13 (по 40 пмоль каждого) смешивают в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ МоС12, прогревают при 95 С в течение 5 мин и равномерно охлаждают до комнатной температуры в течение 3 ч. Прибавляют 30 мкл буфера, содержащего 50 MM Трис-НС!

5 (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 20 MM DTT, 1 мМ спермидин, 1 мМ АТФ, 50 мкг/мл БСА, при бавляют ДНК-лигазу фага Т4 (2,5 ед) и инкубируют при 15 С в течение 16 ч. Продукт лигазной сшивки очищают электрофорезом.

10 в 5 (, ПААГ, Нужную полосу на электрофорезе выявляют при УФ освещении геля, прокрашенного бромистым этидием, Пример 4. Получение рекомбинантной

ДНК, содержащей фрагмент (а) и Pst1-Êðï115 фрагмент вектора pUC 19 (pPCD4a-19).

10 пмоль фрагмента (а) смешивают в эквимолекулярном соотношении с векторной ДНК pUC 19, предварительно расщепленной рестриктазами Pst1 и Крп1, в 20 мкл

20 буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС1(рН

7,5), 10 мМ MgC1z, 20 MM DTT, 1 мМ спермидин, 1 м Vl АТФ, 50мкг/мл БСА, прибавляют

ДНК-лигазу фага Т4 (2,5 ед) и инкубируют при 15 С в течение 16 ч. В качестве контроля

25 используют лигирование той же векторной

ДНК на себя. Опытную и контрольную пробы осаждают зтанолом, растворяют каждую в 20 мкл буфера, содержащего 10 мМ NaC1, 5 мМ Трис-HCI (ðH 8,0), 10 мМ М9С12 и обра30 батывают рестриктазой BamH1, сайт узнавания которой локализован только в полилинкере pUC 19 между сайтами Pst1 и

Крп1. Полченной смесью трансформируют компетентные клетки Е,со11 JM103 и высева35 ют на чашки с ампициллином. Получают 10кратное превышение количества клонов в опыте над контролем. Наличие клонированногофрагмента BbfABnAIQT рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных

40 клонов (пример 6), а его структуру подтверждают секвенированием (пример 7). Плазмиду pPCD4a-19, содержащую фрагмент (а) и Pst1-Крп1-фрагмент вектора pUC 19, нарабатывают как описано в примере 6.

45 Пример 5, Получение рекомбинантной

ДНК, содержащей фрагмент (b) и Pst1-Êðï1фрагмент вектора pUC 18 (pPC04b-18).

10 пмоль фрагмента (Ь) смешивают в эквимолекулярном соотношении с вектор50 ной ДНК pUC 18, предварительно расщепленной рестриктазами Pst1 и Kpnl, в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НО (рН

7,5), 10 мМ Мо С1г, 20 мМ DTT, 1 мМ спермидин, 1 мМ АТФ, 50 мкг/мл БСА, прибавляют

55 ДНК-лигазу фага Т4 (2,5 ед) и инкубируют при 15 С в течение 16 ч. В качестве контроля

0 используют лигирование той же векторной

ДНК на себя. Опытную и контрольную пробы осаждают этанолом, растворяют каждую в 20 мкл буфера, содержащего 10 мМ NaCi.

1761808

5

NaCI, 5 MM Tpuc-HCI (рН 8,0), 10 мМ MgCI2 и обрабатывают рестриктазой BamH1, сайт узнавания которой локализован только в полилинкере pUC 18 между сайтами Pstl u

Крпl. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coli JM103 и высевают на чашки с ампициллином, Получают 15кратное превышение количества клонов в опыте над контролем. Наличие клонированного фрагмента выявляют рестриктным анализом плазмид, выделенных из полученных клонов (пример 6), à его структуру подтверждают секвенированием (пример 7), Плазмиду pPCD4b-18, содержащую фрагмент (в) и Pstl-Kpnl-фрагмент вектора pUC 18, нарабатывают как описано в примере 6.

Пример 6, Выделение плазмидной

ДН К.

Плаэмидные ДНК выделяют методом экстракции фенол/хлороформ. Для этого 3 мл культуры Е.coli, содержащей плазмиду

pPCD4c-18 выращивают в течение ночи на качалке (200 об/мин) в бульоне Хоттингера, клетки осаждают центрифугированием в центрифуге Eppendorf (4 мин при 4000 об/мин), Осадок суспендируют в 200 мкл раствора, содержащего 2,5 M 0С!, 50 мМ

Трис-HCI (рН 8,0), 4 ч/ч Triton Х-100, 62,5 мМ Na ЕОТА, к полученной суспенэии добавляют 200 мкл смеси фенол/хлороформ/иэоамиловый спирт (25/24/1) и интенсивно перемешивают в течение 15 с.

После центрифугирования в течение 10 мин при 14000 об/мин переносят водную фазу в новую пробирку и разбавляют в 3 раза водой. ДН К селективно осаждают центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин непосредственно после добавления в пробирку 200 мкл 40 ПЭГ 8000 и интенсивного перемешивания. Промывают осадок плазмиднойДНК80 этанолом, высушивают в вакуумном эксикаторе и растворяют в воде. Полученную таким образом ДНК

pPCD4c-18 используют для рестриктного анализа, секвенирования по методу Сэнгера (пример 7) и для дальнейших генноинженерн ых мани пуля ций (примеры 8,9), Пример 7. Секвенирование методом

Сэнгера.

Денатурацию плаэмидной ДНК осуществляют прибавлением 2 мкл B NaOH к раствору 4 мкг плазмидной ДНК в 20 мкл воды и инкубирование в течение 5 мин при комнатной температуре, После завершения инкубации прибавляют 6 мкл 7,5 М ацетата аммония для нейтрализации щелочи, перемешивают, прибавляют 100 мкл этанола, вновь перемешивают и замораживают в жидком азоте. Осадок ДНК собирают центрифугированием в течение 10 мин при 14000 об/мин, промывают 80 этанолом и высушивают в вакуумном эксикаторе. Растворяют осадок в 6 мкл воды, прибавляют 1 мкл буфера. содержащего 500 мМ Трис-HCI (рН

8,0), 100 мМ MgCI2 и 1 мкл праймера с концентрацией 0,2 ое/мл. Отжиг проводят l5 мин при 56 С. После завершения отжига в пробирку добавляют 2 мкл смеси, содержащей 25 мк Ки (Р)бАТР и 1,5 ед фрагмента

Кленова, аликвоты по 2,5 мкл переносят в пробирки с предварительно внесенными в них 2 мкл аликвотами терминирующих смесей и инкубируют 15 мин при 37 С. В пробы прибавляют по 1 мкл формамидной краски, прогревают 10 мин при 95 С и наносят пробу на структурный гель. Радиоавтограф экс- понируют на рентгеновскую пленку PM-В.

Пример 8, Получение рекомбинантной

ДНК, содержащей фрагмент(аЬ) и Pstl-Êðï 1 фрагмент вектора pUC 19 (pPCD4ab-19).

Рекомбинантную ДНК pPCD4b-18 расщепляют рестриктазами Bgl1 l и EcoR1 и выделяют электрофорезом в ПААГ фрагмент длиной 177 п.о. Выделенный фрагмент смешивают с векторной ДНК, полученной расщеплением pPCD4a-19. этими же рестриктаэами и очищенной электрофорезом в 1 агарозном геле, в 20 л1кл буфера, содержащего

50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 10 MM MgCI2, 20

MM DTT, 1 мМ спермидин, 1 мМ АТФ, 50 мкг/мл БСА, прибавляют ДНК-лигазу фага

Т4 (2,5 ед) и инкубируют при 15оС в течение

16 ч. В качестве контроля лигируют векторную ДНК на себя. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки

Е.coli JM 103 и высевают на чашки с ампициллином. В опыте получают 8-кратное превышение количества клонов над контролел1.

Наличие клонированного фрагмента выявляют рестриктным анализом плаэмид, выделенных из полученных клонов (пример 6), а структуру стыка подтверждают секвенированием (пример 7).

Пример9. Получение рекомбинантной

ДНК, содержащей фрагмент (абс) и HindlllEcoR1 фрагмент вектора М13 mp18 (M13 CD4a bc).

Рекомбинантную ДНК pPCD4abc-19 расщепляют рестриктазами Hindltl и EcoR1 и выделяют электрофорезом в ПААГ фрагмент длиной 599 п.о. После этого данный фрагмент смешивают с векторной Д Н К, noiiученной расщеплением РФ-ДНК фага М13

mp18 этими же рестриктазами и очищенной от короткого фрагмента линкера электрофорезом в 1 g, агарозном геле, в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 10

MM MgCI2, 20 мМ DTT, 1 мМ спермидин, 1

1761808

Формула изобретения

la+mb+nc, Т HTTARCRARHTTHTTCTHHHTAAAAARHGTHRCACTGTTGAACTGRÑÒÒHÑACÒ лсятласллт GTTтсАлсллалссслттfтттсслстатялсАлстталстяллсатаА

Бстт(,т hGARAAAATcTëòccÀGTòcchcTGGëhëÀRñòcT Ahccfялтсллллтсстя

cGRh;ERG с г и TT TAHhThGGTcAAGH1 алссттттталялттаатстлаттттлаалс аатллссля сгтстттссталстлллаатссатстлллсталлсалссясястялстст сслттцатсс RHAAAGGACTHATTTCCAHHCAGATTTGACTTGCTGGCHCHACTHAHA

АялляАтстатсалсатАс тсттстлалсляста нуклеотидная последовательность b:

БЛТСТ,TGTHGGACCAGGGTAACTTCCCGCTHATCATCAAAAACCTG

hCGTCTAGAGACACCCTGGTCCCATTGAAGGGCGACTAGTAGТТТТТааАС ллллтсзллялстсталслсттлслтстасяллаттяллялссляллляллялляттсля

TTTTRHcTTcTHhHAcòGTGAATGòëHëñGñTòchAñòòñòàHòcòòòñòòcòòcAëGTñ

CTGCTHGTòTTCGGTCTHACTHCTAACTñTHACACTCACCTHñTHñAHHTCHhCHTлс ялсалсслллласслялсталсялтталалсTHTGAGTHHAcGAcGTcñAHñòH мМ АТФ, 50 мкгlмл БСА, прибавляют ДНКлигазу фага Т4 (2,5 ед) и инкубируют при

150C в течение 16 ч. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки

Е,соИ JM 103, которые затем высевают в полужидкий агар на индикаторные чашки, содержащие Х-Gal u IPTG. Получают 5-кратное превышение количества бесцветных бляшек над окрашенными. Наличие клонированного фрагмента выявляют рестриктным анализом РФ-ДНК, выделенных из полученных клонов.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать синтетическую

ДНК, кодирующую часть поверхностного белка CD4 T-лимфоцитов человека, ответст-. венную за связывание с гликопротеином цр120 ВИЧ и ее фрагменты, отличающиеся оптимизированным для Е.coll кодоновым составом, а также рекомбинантные ДН К, содержащие зти синтетические ДНК и фрагмент вектора, Фрагмент ДНК, кодирующий часть поверхностного белка CD 4Т-лимфоцитов че5 ловека, ответственную за связывание с протеином gp 120 вируса иммунодефицита человека, полученный в результате твердофаэного синтеза амидофосфитным методом с последующей ферментативной сборкой, 10 имеющий следующую нуклеотидную последовательность:

15 где 1,m,ï принимают следующие значения:

1=1, п=0, m=0, 1=1, п=1, m--0, 1=1, п=1, m-=1, 1=0, п=1, m=0, 1=0, п=0, m=1 нуклеотидная последовательность а:

17б1808 нуклсотидная последовательность с

Т(СТ(БСЛЯБЯТСЛЯТСТСТБЛСТСТБАСТ)("ТЯЯЛЛТСТСССССЯБЯТТСТТСТС

ЛСБТЛЯБЛСБТСССЛБТСАБАБАСТБАБАСТЯАЯАССТТАЯАББЯЯБСССААЯААЯАЯБС ЯТТ AGTÃCCÊTCTÑCGCGCGGTАААААСАТССАЯЯБТББТAAAACTCTGTCTGTT

ЛЯЛСАЛ6ТСЛСЯ6СЫЛБАББСЯСЯССАТТТТТЯТАЯЯТСССАССАТТТTGAGACAGA

AAACiTT6AGÒÒÑAAAATC6ATÀTCGTT6TÒCTG6CTTTCCAGÀAÀGÑCTCATCGATT6TC

ТТТСЛЛСТСЗЛБТТТТАЯСТСТAGCAACAAGACCGAAAGGTCTTTCGGAHTAGCTAACAG

БЛСЯТАС

СТБ, ) ((7 ) 1l— 4-- Т " Л Т АСТТС(ЛСТССТТСТСАСА

ACGT4 f«AATTGTTTCÀACiAAG4CCC4 < Т1 Т ) ТС .4 . Т< .Т<".А С А «<"тТСАСТ(".Ah . <,ТСЛССЛАСЛСТСТ

2 < 2 ) АААЛАТСТА 1CCAGTTCCACTGGAAAAACT<". )ÀAC<.AGËTCÀÀAATÑÑÒGGGTÀACÑAGGGTTCTTTCÑÒ

ТТ1 ПАС ЛТАГ«СТСЛАССТСЛССТТТТ i GAi <(T"< G . TC < Ë TTTTA()(ACÑCAÒTGGTCCCÀÀGÀÀÀGGÀ «

1 f)((7 1,.;I

-, )(о) )

СЛСТАЛАССТСССТГГАЛАСТСЛАСГАССГ("., (:ТСАСТСТЛСААСАТСТСТССАССТАС фрагмент (TGATTTCCAGGCAGATTTGhf!TT6 " С<" ".Г< юЛГ (. 1<лЛ)ГТ ((,TAGACAGCT а

))«I ) 4(P!i ) ГАТ(ТСТСТГССАГСА((ССТАА(;ТТССГГС1GATCATCA AАААССТСААААТССАЛСАСТСТСАСА

АССТСТЛСАСАСАСССТГСТСССЛТТСЛАСССССЛСТАСТАСТТТТТССАГТТТТАССТТСТСАСАСТСТ

17(60 ) -Ч

СТТАСАТГТСОСААСТТСААСАССАС444Г«4),< АЛСTTCAGCTGCTGGTTTTCGGÒCÒGÀCTGÑTÀÀÑTÑ

САЛТСТАСАСГСТТСЛАСТТСТССТСТТТС 1 ТСТТСААСТССАССАССААААСССАСАСТСАССАТТСАС

5(йО ) фрагмент в

ТСАСАСТСАССТССТССАССТГСА<:С14С

АСТСТСАСТССАССЛ<".GTCCA«,.Т(;

)."<(05 ) ТСТСЛБСТ6ЯАЛСТЯСЛЛБАСТСTGGTACTTÉGÀCÒÒ6ÑÀÑÒGÒÒÑÒ6ÑÀAAÀÑÑAGAÀÀ

АЯЛЯТСБЛССТТЯАСБТТСТ6АБАССАТБААССТ6ААСЯТБАСАА6АСЯТТТТББТСТТТ

1761808

6<0 )>

ТСГТГСАСССТСАСТСТГТСЛСТСТСю".Т Л Г (:АРТСТГЛ:ССШ."ГГС ТСИ:С(;R TGTTC!C:.

ЛССТЛСгАССТССГАСТСАГА(.;АСТСЛГ (СТС Л:.-А(-. :ттАГА (, Г,GCC(.А а ГЯ АСаСССИ.;АСААСтСА

11(76 )

СССССТСТССССССССТАЯЯАЯСАТС(. А(СЯ РЛ А А А А("(С1 G1 CTGTÒTCTÑËGCTGGAACTGCAAGA

СССССАСАССССССССАТТТТТС ТАССТСГГАССЛТТТЛ.;A(ACAGACAAAGAGTCGACCTTGACGTTCT

7(92 )

CTCTGGTACTTGGÀÑTTGCACTGTTCTGCAAËA(CA(A(AAAAGTTGÀGTÒÑAÀÀÀÒCGAÒÀÒCGTÒGÒT

СЛСАССАТСАЛССТСААССТГЛСААСАС Т1 ТЯ ТСГП"(ТТСАЯСТСААСТТТТАССТСТАССААСАА

)—

15(62 )

6(60 )

CTGGCTTTCCAGAAAGCCTCAÒÑGÀÒTGTCG «;(TA(".

САСССАААССТСТТТСССАГТЛ(.*СТААСЛГСТ

1б(84 )

Т,GTTA ACA AAGTTGTTCТЯ СТААААААГ СТСЛСАСТ< ТТСААСТСАСТТСсСАСТССТТС1

АССТА С АТТГТТТСААСААСАСССАТТТТТТССАСТГТСАСААСТТ(:АСТСААССТСАСГААСАь (СТ

АААААТСТАТССАСТТССАСТС(АААААСТСТААССАГАТСЛАААТССТСССТААССАСС(ТТСТТТСС1

TTTTTAGATAGGTCAAGGTGACCTTTTTGAGATTG(.ТГТАС ТТТТАССАСССАТТССТСССААГАААС(А

САСТАААССТСССТСТАААСТСААССЛССССССТСАСТСТАСААСАТСТСТСТСССАССАСССТААСТТС

СТСАТТТССАГС;САСАТТТСАСТТ(СТССССССАСТСА(АТСТТСТАСАСАСАСССТССТСССАТТ(ААС

CCGCTGATCATCAAAAACCTGAAAATCGAAGACTCTGACACTTACATÑTGCGÀÀGTTGAAGÀÑÑAGAAAG

ССССАСТАСТАСТТТТТССАСТТТТАССТТСТСАСАСТСТСААТСТАСАСССТТСААСТТСТС(ТСТТТС

AAGAAGTTCAGCTGCTGGTTTTCGGTCTGACTCCTAACTCTGACACTСАССТССТССАССТССАССТАС

ТТСТТСАА(ТССАССАССААААСССАСАСТСАССЛТТСАСЛСТСТСАСТС(АССАССТССАССТС

18

17

1761808

TCGTT AACAAAGTTGTTCTGGGTAAAAAAGGTGACACTGTTGAACTGACTTGСАСТ

ACGTAGCAA TTGTTTCAACAAGACCCATTTTTTCCACTGTGACAACTTGACTGAACСТСА

GCTTCTCAGAAAAAATCTATCCAGTTCCACTGGAAAAACTCTAACCAGÀTCÀÀÀÀÒÑÑÒG

CGAAGAGTCTTTTTTAGATAGGTCAAGGTGACCTTTTTGAGATTGGTÑTAGTTTTACGAC

GGTAACCAGGGTTCTTTCCTGACTAAAGGTCCGTCTAAACTGAACGAССССССТСАСТСТ

CCATTGGTCCCAAGAAAGGACTGATTTCCAGGCAGATTTGACTTGCTÑÑÑÑCÑÀÑÒÑÀÑÀ

AGAAGATCTCTGTGGGACCAGGGTAACTTCCCGCTGATCATCAAAAAССТСААААТССАА

TCTTCTAGAGACACCCTGGTCCCATTGAAGGGCGACTAGTAGTTTTTССАСТТТТАССТТ

GACTCTGACACTTACATCTGCGAAGTTGAAGACCAGAAAGAAGAAGTÒÑÀÑCÒÑCÒÑÑÒÒ

CTGAGACTGTGAATGTAGACGCTTCAACTTCTGGTCTTTCTTCTTCAÀÑÒCÑÀCÑÀÑÑÀÀ

TTCGGTCTGACTGCTAACTCTGACACTCACCTGCTGCAG GTCGACGTAC

AAGCCAGACTGACGATTGAGACTGTGAGTGGACGACGTC CACCTG

17б1808 рис(в

CEIZIlP pntt бис В и

-->, coÕ/

Fcoppp

Hind ppp — 81Внр гдг и- игираданцг

Составитель А,Гузаев

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Король

Редактор Н.Соколова

Заказ 3236 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина. 101

1 2 рИСЕ рз/

iipnl

3а Ь и я