Способ получения лейкоцитарного интерферона

Способ получения лейкоцитарного интерферона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , получение лейкоцитарного интерферона . Сущность изобретения: способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической и биологической активностью ЧеИФН-а. Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ДНК последовательности Z-pBR 322 (Pst) HCIF-4c, Z-pBR 322 (Pst), HIF-2h, Z- pBR 322 (Pst) HclF-SN-35, Z-pBR 322 (Pst) HclF-SN-42, Z-pKT 287 (Pst) HclF-2h-AH6, a также последовательности, которые гибридизуются с изложенными вставками.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ („ (Л

Ж, > Сл) (21) 3233703/13 (22) 08.01,81 (31) 80300079 (32) 08.01.80 (33) ЕР (46) 23.09.92, Бюл, К 35 (71) Биоген Инк (US) (72) Чарльз Вайссманн (СН) (56) Proc. Natl, Acad. Sci., USA 76, р. 640—

644, 1979, (54) СПОСОБ ПОПУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО,ИНТЕРФЕРОНА (57) Использование: генетическая инженеИзобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению человеческого лейкоцитарного интерферона.

Известен способ получения лейкоцитарнэго интерферона, предусматривающий культивирование штаммов культивируемых клеток животных, выделение и очистку целевого продукта.

Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта.

В данном способе осуществлено обнаружение последовательностей ДНК, кодирующих ЧеИФН-а в клетках Е.coll.

С помощью данного способа получают полипептид(ы), проявляющие иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН-а.

Настоящий способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, облада„„!Ж„„1764515 АЗ рия, получение лейкоцитарного йнтерферона, Сущность изобретения: способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической и биологической активностью ЧеИФН- и, Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ДНК последовательности Z-pBR

322 (Pst) НСП=-4с, Z-pBR 322 (Pst), HIF-2h, ZpBR 322 (Pst) HclF-SN-35, Z-pBR 322 (Pst)

HciF-SN-42, Z-pKT 287 (Pst) HclF-2h-АН6, а также последовательности, которые гибридизуются с изложенными вставками, ющий иммунологической или биологической активностью ЧеИ Ф Н-а.

Получены рекомбинантные ДНЕ, содержащие ДНК последовательн: сти ZpBR322/Pst) (HClF4c, Z-pBR332(Pst)/

HclF-2h, Z-pBR322/Pst/HclF-SN 35, Z-pBR

322/Pst/HclF-SN42, Z-рКТ287/Pst/HctF2h-АН6, а также ДНК последовательности, которые гибридизуются с упомянутыми вставками, Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Человеческие лейкоциты стимулируют в течение 5 часов при 37 С вирусом Сендай и экстрагируют с иесь поли(А)РНК, содержащей MPHK человеческого лейкоцитарного интерферона (Ч1ЗИФН-а мРНК). Стимулированные лейкоци, ы собирают и 10 клеток суспендируют в 1 л рас11 твора, содержащего 8 г NaCI, 0,2 г l:CI, 1,15 г NazHP04 2HzO и 0,2 г KHzP04, раггворен1764515

45

55 ных в 1 л воды ("PBS"), и добавляют при интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ

Трис-H CI (p H 7,5), 1 MM Эдтук ("ТЕ"-буфер"), 2% додецилсульфата натрия (ДСН) в делительную воронку емкостью 50 л. Прибавляют проназу к 200,и г/мл и перемешивают раствор в течение 1 ч пои комнатной температуре. Прибавляют 10 отсч./мин,125 I-глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2М

Трис-НС! (рН 9) в количестве, равном 1/20 от общего объема ("1/20 объемн"), и смесь экстрагируют при энергичном перемешивании 15 л повторно перегнанного фенола в течение 10 мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин, После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу, всего 19,1 л объединяют с

60 r ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водной фазы 1/10 объемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5,5) и 2 объемами этанола, После хранения в течение ночи при20 С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито.

Этот материал затем перемешивают с 200 мл THE (50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 100

MMNaCI, 5 мМ ЭДТУК), содержащего 0,5%

ДСН. Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора. Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуге Сорволл RC-3 в течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл THE содержащего 0,5% ДСН, Оба раствора THE объединяют, экстрагируют 3 раза 1 обьемом фенола, 3 раза 1/2 объема эфира и 3 раза 1 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК.

Поли(А) PHK смеси выделяют адсорбцией на олиго(бТ)целлюлозе. Прибавляют

2,7 r олиго(бТ)целлюлозы к 500 мл, После перемешивания в течение часа при комнатной температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(бТ)целлюлозе, центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК, связанных с ней, промывают один раз 50 мл

THE и второй раз 15 мл THE. Затем связанную поли(А)РНК элюируют пятью последовательными промывками 2 мл Н О.

Получают 860,и г поли(А)РНК. Надосадочный раствор PHK из первой адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции, При второй и третьей адсорбциях получают 600,и г и 170,и г PH К.

PHK испытывают на ЧеИФН-а активность путем инъекции в ооциты Xenopus

laevis,РНК растворяют в 15 мл Трис-HCI (рН

7,5), 88 мМ NaCI (ТН К буфер), чтобы получить концентрацию около 1 мг/мл. Инъецируют

50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов.

Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкубированные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастера в трубке для центрифуги Эппендорфа емкостью 1,5 мл в 0 5 мл 52 мМ трис-глицеринового буфера (рН 8,9). Смесь центрифугируют в течение

2 мин в центрифуге Эппендорфа, надосадочный слой сливают и замораживают при

-20 С для испытаний. Одна единица ИФНа снижает количество вируса на пластине на 50%. Активность препарата ИФН-а выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН-а 69/19, Экстракт ооцитов имеет активность 300 IU ИФН-а на ,и r PHK, при этом ооциты инкубируют в течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(А)РНК добавляют 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) к поли(А)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 м М ЭДТУК. Полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом THE-насыщенного фенолом и 5 раз

- равным объемом эфира. Затем его пропускают через колонку с 0,1 мл, нагре гую за 90 с до 100 С, и слоем в 13 мл с градиентом сахарозы 5 — 23%, содержащей 50 мМ TpucHCI (рН 7 5), 1 мМ ЭДТУК, 02 М NaCI. В качестве маркера добавляют 10000 спм 5концевого 32 р-меченых фрагментов ДНК, произведенных при одновременном усвоении pBR 322 и эндонуклеаз Hind III u Pst 1, Центрифугирование проводят в SW 40 роторе при 10 С и 35000 об/мин в течение 16 ч.

Фракции (0,6 мл) собирают с градиентом ($СО коллектором при 1 мл/мин, Испытывают фракции на ЧеИФН-амРНК, их положение по отношению к P-ДНК маркеоам, При зг последующем центрифугировании. фракции, содержащие ЧеИФН-а мРНК, идентифицируют относительно маркеров. Фракции с активностью ЧеИФН-й MPHK содержат 80и г поли(А)РНК. Их смешивают с 2 объемами THE, содержащего 0,5% ДСН и

0,02% поливинилсульфата (в последних приготовлениях поливинилсульфат был исключен), при этом применяют колонку с 50 ,и л олиго(бТ)целлюлозы, После промывки колонки 40,и г смеси PHK элюирук>т 4 промывками 0,6 мл дистиллированной воды, После осаждения этанолом PHК растворяют в 1 мгlмл в 0,5 мМ ЭДТУК, Испытание на активность ЧеИФН-Q мРНК проводят, как описано выше, на порции осадка поли(А)РНК, Он имеет удельную активность 3600 IU интерферона/рг, Следовательно, градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно 10-кратно по отношению к ЧеИФН-и мРНК, Получают приготов1764515

55 ление с примерно 40-кратным обогащением,Синтез с ДНК смеси, содержащей ЧеИФН-а с ДНК.

Поли(А)РНК, обогащенную ИФН-а м Р Н К, испол ьзуют в качестве шаблона (модели) для получения однониточной комплементарной ДН К (сДН К). 800и л реакционной смеси содержит 40 мМ Трис-Н С! (рН 7,5), 30 мМ NaCI, 5 мМ М9С!г, 0,5 мМ ДТТ, 20 мг/мл олиго(с!Т)12 — 18, 5 мМ dGTP, dCTP и dTTP, 5 мМ 32 P-dATP (НЕН, удельная активность

10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(А)РНК и

280 ед. обратной транскриптазы. После инкубации в течение 1 ч при 37 С прибавляют

0,5 М ЭДТУК и 20 ДСН (перекристаллизованного) к 10 MM ЭДТУК и 0,1% ДСН, Смесь экстрагируют 1.объемом фенола (перегнанного). Фенольную фазу промывают 200,и л

200 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 1 MM ЭДТУК и

0,1% СДН, объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс

G-100 в THE. Собирают фракции по 0,1 мл при 0,3 млlмин, Фракции, показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова), объединяют и прибавляют

ЗМ. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С образцы центрифугируют, отбрасывают надосадочный слой.

Осадок растворяют B 180 и л дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа, Прибавляют 20 ,и л 5MNaOH и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин, Прибавляют

20 мл 5М ацетата натрия, 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола, После охлаждения в течение ночи при -20 С собирают полученный осадок центрифугированием при силе, эквивалентной 10000кратной силе тяжести (10000xg) в течение 20 мин при 0 С, Выход однониточной сДНК составляет 10,иг, Однониточный продукт сДНК находится в реальной сложной смеси большого числа различных сДНК, транскрибированных из соответствующих мРНК, имеющихся в смеси поли(А)РНК, Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН-а, например HilFN-асДНК, Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза малого на щелочном 2/,-ном геле агарозы с использованием 30 мМ NaOK, 2мМ ЭДТУК в качестве электролита, P-сДНК имеет зг длину 600 — 1000 нуклеотидов, относящихся к однониточному глобину СДНК, P-меченые фрагменты ДНК используют в качестве маркеров размера.

Пример 2, Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК

5 полимеразой 1. Осажденную однонитевую сДНК растворяют в 200и л НгО, нагретой до

100 С, в течение 2 мин и инкубируют в

500и л 0,1 М нагретого денатурированного калийфосфатного буфера (рН 6,9) 10 мМ

10 М9С!г, 10 мМ ДТТ, 1 мМ каждого из dATP, dGTP и dCTP, 1 мМ Н-бТТР (НЕН, удельная активность 100000 спм/нмоль) и 150 ед,/мл

E=coli ДНК полимеразы 1, После 6,5 ч при

15 С прибавляют 0,5 ЭДТУК и 20% ДСН к 10

15 мМ ЭДТУК и 0,1 ДСН. Затем смесь экстрагируют 500,ил фенола, фенольную фазу повторно экстрагируют 250,ил 20 мМ Трис-HCI (рН 7,5),5 мМ ЭДТУК(ТЕ буфер). Обе водные фазы объединяют и хроматографируют на

20 колонке с 5 мл Сефадекс 6-100 в тех же самых условиях, Прибавляют ЗМ ацетат натрия к 0,3 М и 2,5 объемам этанола, смешивают для осаждения ДНК. Всего собирают

13,иг ДНК, 25 ДНК обрабатывают нуклеазой 1. Осажденную ДНК растворяют в 250 мл буфера (0,2 M NaCI, 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5), 10 мМ сульфата цинка и нагревают при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют 1,5 ил S>

30 фермента (11 единиц/,ил), смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют

ДСН и ЭДТУК к 0,1% ДСН и 5 мМ ЭДТУК и экстрагируют смесь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 ulTE буфера, Объединяют водные фазы и хроматографируют на колонке с Сефадексом G-100 в THE, собирают фракции по 0,1 мл при скорости 0,3 млlмин и определяют радиацию Черенкова для каждой фракции, После осаждения из

4о этанола и ацетата натрия собирают 8 р г двойной спирали ДНК.

Пример 3, Обрабатывают плазмиду (в частности, pBR 322) эндонуклеазой Pst I u добавляют dGMP хвосты концевой трансфе45 разой. dGMP добавляют к 5 концу плазмиды для регенерации Pst I сайта и лигируют с сДНК фрагментом, несущим комплементарные хвосты, Двунитевую сДН К удлиняют при добавлении dCMP хвостов к 3 концевому. Затем плазмиду и сДНК обрабатывают лигазой, чем обеспечивается введение сДНК в подходящий сайт плазмиды и получение гибридной ДНК, Пример 4, Плазмиду рВР322 (20 r) гидролизуют 21 единицами Pst I эндонуклеазы в 150 мл 10 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 6 MM

М9С!г, 50 мМ NaCI, 6 мМ МцС!г, 50 мМ NaCI, 6 MM 2-меркаптоэтанола, 200 мг/,ил бычьего сывороточного альбумина (БСА), После 2 ч

1764515

55 при 37 С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (1:1) и 1 обьемом эфира и осаждают этанолом, Добавление гомополимерных хвостов

dGMP с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансферазы (TdT) осуществляют в

328 мл реакционного объема, содержащего

100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 10 мМ

КаХгРО, 5 мМ МцС!2, 1 мМ dGTP, 50 мгlмл

БСА и 3 — 6 ед. ТбТ(очищенного как указано выше) на 1 мг ДНК. Инкубируют при 37 С в течение 20 мин. Прибавляют ЭДТУК к 10 мМ, смесь экстрагируют как указано выше и диализуют два дня против буфера THE.

Двунитевую ДНК удлиняют остатками

dCMP по стандартной методике, Инкубируют 150 мл двунитевой сДНК, описанной выше, а 8 ил 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 2,5 мМ CoCiz, 50 pr/Mn БСА, 0,2 MM dCTR, содержащего 3 — 6 ед. очищенного TdT на мг

ДНК, в течение 8 мин при 27 С, а затем замораживают при -20 С, Инокулируют одну колонию Е,coli XI776 в 100 мл триптоновой среды с добавкой 100и г/мл диаминопимелиновой кислоты, 10 ,и г/мл налидиксовой кислоты и 10,иг/мл тетрациклина, Выращивают культуру при

37 С до кажущейся оптической плотности

0,6 при 650 нм (ОДем) и охлаждают на льду в течение 30 мин. Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе, клетки промывают 50 мл 10 мМ NaCI, отделяют на центрифуге и повторно суспендируют в 20 мл 100 MM CaClz. Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ

CaClz и хранят на льду в течение ночи для использования, Аликвоты (0,5 мл) хранят замороженными при -70 С.

Смешивают 3 нг dCMP-удлиненной

ДНК с 22 нг dCMP-удлиненной Рзт I, обработанной pBR322 в 50 мл THE-буфера. Инкубируют при четырех последовательных стадиях при 65, 46, 37 и 20 С, Прибавляют

20,ил 100 мМ Трис-НCI (рН 7,5), 100 мМ

СаС!, 100 мМ MgClz и 50,ил THE буфера, смесь охлаждают на льду 20 мин.

Рекомбинантные молекулы PHK добавляют к 100,ил обработанных Са клеток

Е,coli и смесь охлаждают на льду в течение

20 мин, нагревают до 20 С в течение 10 мин и прибавляют 0,6 мл триптоновой среды.

Смесь помещают на 2 пластины с триптоновой агаровой средой, подготовленные как описано ранее. Эффективность трансфекции составляет 3,3 10 колоний на,иг зака4 ленной pBR322 трансфецированной ДНК, нативная pBR322 дает 3 10 колоний на,иг, 5

Так как плазмида pBR322 включает ген устойчивости к тетрациклину, Е.coli реципиент, который был трансформирован плазмидой, будет расти в культуре, содержащей такой антибиотик, в отличие от нетрансформированных таким образом бактерий, Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию организмов-хозяев, трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или рециклизованным вектором.

После 48 ч при 37 С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл триптоновой среды (подготовленной, как описано выше) в углублениях микротитерных пластин, После инкубации при 37 С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40 -ного глицерина. Пластины выдерживают при -20 С и готовят набор из

100000 индивидуальных клонов трансформированной Е,coli Х1776, Пример 4. Рекомбинантные молекулы

ДНК расщепляют, денатурируют и гибридизируют с лейкоцитами поли(А)РНК, содержащими ИФН-амРНК . Гибриды рекомбинантных молекул ДН К-поли(А)Р Н К отделяют от негибридизированной поли(А)РНК (стадия C). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают(стадия Д). Выделенную P H К исп ытывают на активность ИФН-амРНК (стадия

E). Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов, способной гибридизироваться с поли(А)РНК в жестких условиях гибридизации, а также вызывает образование

ИФН-ав ооцитах, Если группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировывают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают, Этот процесс продолжают до тех пор, пока не будет идентифицирован единичный клон, Однако полученные рекомбинантные клоны не содержать полную последовательность с ДНК ИФН-а, Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой.

После инкубации при 37 С каждый клон разрастается в колонию несколько миллиметров в диаметре. Все колонии отмывают с пластин и собирают, получают инокулум, использованный для инокулирования 1 л триптоновой среды, заполнившей, как описано выше, 2 л колбу Эрленмейера. Культуру встряхивают при 37 С до появления ОДыо примерно 0,8 (оценено визуально). Один объем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170,иг/мл прибавляют к культуре, которую снова встряхивают при 37 С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформа

1764515

55 и культуру снова встряхивают 10 мин при

37 С, чтобы уда ить бактерии. Культуру декантируют с хлороформом, клетки собирают центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин при 4 С, Получают примерно 1 — 2 r клеток из каждого литра рецептуры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 MM

Трис-HCI (рН 7,5), центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин и 4 С, повторно суспендируют в 30 мл 50 мМ Трис-HCI (рН 7 5), Прибавляют 0,25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5)), после охлаждения в течение 10 мин при 0 С прибавляют 0,33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-HCl-культур), 0,5

M ЭДТУК (рН 8,0), осторожно перемешивают без встряхивания, Еще через 10 мин при

0 С прибавляют 1/16 объема (снова считая на первоначальный объем) 2 / Тритона Х100, Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0 С в роторе. Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и прибавляют 3 М NaOH при перемешивании до тех пор, пока не будет достигнут рН 12,5, измеряя при 20 С, используя стеклянный электрод и рН-метр, стандартизированный стандартным карбонатным буфером Бекманн рН 10 (N 3505), После перемешивания в течение 10 мин при 20 С устанавливают рН 8,5, После еще 3 мин перемешивания прибавляют 1/9 объема 5М NaCI и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного

9,5 M NaCI) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0 С в течение

10 мин. Надосадочный слой, содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК), осторожно удаляют из промежуточной фазы (которая содержит однониточную ДНК) и 3 раза экстрагируют хлороформом, (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии), Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантные молекулы ДНК (pBR 322-сДНК вставка), первоначально использованные для трансформации этих клеток организмареципиента, которые образуют часть 512 клонов, выбранных для испытания.

Прибавляют панкреатическую РН Казу А (5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85 С) к форме 1 ДНК до концентрации 20и г/мл и инкубируют смесь в течение 60 мин при 37 С. Прибавляют 1/5 объема 5 М NaCI и смесь обрабатывают 30/ полиэтиленгликолем 6000до окончательной концентрации 7,5 / ПЭГ, После 2 — I6 ч.при

-10 С собирают осадок в роторе в течение

20 мин при 8000 об/мин и 0 С, растворяют в 0,075 М NaCI, 0,0075 М цитрата натрия до поглощения 20 при 260 нм и доводят до

0,5 ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при

37 С с 0,5 мг/мл проназы (20 мг/мл, 2 ч при

37 С) и 3 раза экстрагируют 1 объемом перегнанного фенола и 2 раза 1 объемом хлороформа. Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте сахарозы от 5 до 23 в 50 MM Tpuc-HCI (р Н

7,5), 1 мМ ЭДТУК в течение 15 ч при 21000 об/мин и 15 С. Собирают фракции и контролируют ОДыс, Собирают фракции, содержащие ДНК, и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20 — 100,иг смеси ДНК.

20,иг ДНК обрабатывают в 150рл 10 MM

Трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ MgCIz, 50 MM NaCI, 6 MM 2-меркаптоэта нала, 200,иг/мл Б СА или желатина и 20 единиц Hind III. Эндонуклеазой Hind I I I расщепляют плазмиду p B R 322, После 2 часов при 37 С аликвоты (1,) подвергают электрофорезу на 1 агарозном геле в 50 MM трис-ацетате (рН 7 8), 2 мМ

ЭДТУК в течение 1 ч при 50 МА, чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработка не закончена прибавляют еще

Hind Ш и продолжают инкубацию еще 2 ч.

Когда ДНК полностью расщеплена, прибавляют проназу, ЭДТУК и ДСН в количестве

0,5 мг/мл, 10 мМ и 0,57; соответственно.

После 30 мин при 37 С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (1:1).

Промывают 50,ил р-ра 20 мМ Трис-HCI (рН

7,5), 1 мМ ЭДТУК, объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром, фильтруют через колонку 0,1 мл, обработанную ЭДТУК, и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С ДНК собирают центрифугированием, Готовят две гибридизирующие смеси.

Смесь I содержит 4,ил 10-кратно концентрирован ного буфе ра (4М Na CI, 0,1 П И П С (р Н

6,4, 1,4-пиперазиндиэтансульфокислота), 50

MM ЭДТУК,.0,5,ил (около 5 нг " J-глобин мРНК (5000 спм) и 6 мл индуцированной лейкоцитарной поли(А)РНК (2,иг/рл). Смесь

Il содержит 10 иг обработанной Hind III ÄÍ Ê и 0,1,иг Pst-Z-pBR322 (НЗ)Вс j3G 4,13 ДНК (производная pBR322, которая содержит последовательность Р-глобина в Hind ill сайте), Обе смеси сушат в парах газообразного азота, Прибавляют 40 мл 80 / формамида к остатку смеси II и денатурируют раствор в течение 10 мин при 100 С и быстро охлаждают на льду. Денатурированный раствор используют для растворения смеси, а полученный раствор инкубируют при 56 С в течение 4 ч, После разбавления до 1 мл холодным

0,9 M NaCI, 0,09 М цитратом натрия и 100//1764515

12 ным формамидом до 4О/, (Ro объему), раствор фильтруют при 0,5 мл/мин через фильтр Миллипор {размер пор 0,45 мм), сначала фильтр испытывают на его способность удерживать гибриды ДНК/РНК, потому что не все фильтры, полученные от производителя, в равной мере эффективны, Погружают указанный выше фильтр с гибридами поли(А)РНК в 1 мл 0,15 М NaCI, 0,015 М цитрат натрия, 0,5/о ДСН в течение

10 мин при 37 С, промывают 50 мМ TpucHCI (рН 7,5), 10 мМ М9С!2, 2 мМ CaClz u помещают в 0,6 мл свежего буфера. Добавляют 5и л ДНКазы, обработанной иодацетатом (5 мг/мл). Фильтр инкубируют при 37 С в течение 10 мин, Удаляют фильтр и экстрагируют раствор 1 объемом фенола и 1 объемом эфира и пропускают через колонку с 0,1 мл, Прибавляют к раствору 5,иг PH К-носителя (PHK очищенных дрожжей) и осаждают

PHK ацетатом натрия и этанолом, Осадок собирают центрифугированием и ри

10000xg, растворяют в 100 мл 1 MM ЭДТУК, нагревают 90 с и ри 100 С и прибавляют THE и ДСН до 2 THE и 0,5о/ ДСН, Адсорбируют

PHK на колонке с 100,иг олиго dT/öåëëþëoзы, элюируют четырьмя промывками 0,3 мл дистиллированной воды и осаждают ацетатом натрия и этанолом. После 16 ч при -20 С осажденную PHK отделяют центрифугированием и растворяют в 2 мл буфера ТНК.

Раствор поли(А)РНК, полученный ранее, инъецируют в 40 ооцитов (примерно 5 нл в ооцит). Ооциты инкубируют при 23 С в течение 24 — 48 ч, гомогенизируют и центрифугируют (или инкубируют собранную среду) и испытывают, как описано ранее для

И Ф Н-а.

Проводят большинство последующих опытов с рекомбинантной молекулой ДНК из одного клона с ДНК, связанной с бумагой

ДВМ или ДРТ, Бумага ДРТ дает меньший фон, Листы ватмановской бумаги 540 (20 г) перемешивают 16 ч при 20 С со смесью 70 мл 0,5 М NaOH, 2 мг/л ИаВН4 и 30 мл 1,4-бутадиендиглицидилового эфира. Затем бума"гу переносят в раствор 10 мл

2-аминотиофенола в 40 мл ацетона и перемешивают 10 ч. Отмывают ацетоном, 0,1 н.HCI, H20, 0,1 í.HCI, Н О, сушат, Бумагу

APT диазотируют до бумаги ДРТ.

ДНК (до 15,иг) связывают на 50 мм диазотированной АВМ (ДВМ) или диазотированной APT (ДРТ) бумаги, Гибридную плазмиду ДНК гидролизуют

Pstl, обрабатывают 500,иг проназы на мл

0,5/ ДСН и 10 мМ ЭДТУК в течение 30 мин при 37 С, экстрагируют фенолом и эфиром, пропускают через колонку 0,1 мл и осажда55

R р и м е р 6. Так как первичные клоны из трансформированных клеток иногда содержат более одного вида рекомбинантных молекул ДНК, Hif-4c выделяют из Е.coll

XI776 (Hif-4C) клонов и очищают. Образцы

kif-4C и pBR322 гидролизуют Pstl и аналиют этанолом. Инкубируют денатурированную нагреванием ДНК (до 5,иг с малыми количествами добавленной P-ДНК в каче- 32 стве метки) при 0 С в течение ночи с 1 см

5 бумаги ДВМ или ДРТ в 200,ил 25 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5), фильтры промывают 3 раза по 5 мин при комнатной температуре 50 мМ калийфосфатным буфером (рН 6,5), 1/ глицина и 3 раза 99,— ным

10 перекристаллизованным формамидом. Далее инкубируют в 99О/ формамиде в течение

2 мин при 68 С, потом 3 раза промывают в

50 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,5) при

20 С и два раза промывают в 0,4М NaOH

15 при 37 С в течение 10 мин. На фильтрах остается около 40 — 60 радиоактивности, Фильтры инкубируют 3 ч при 38 С в предварительно гибридизованной среде А, заполненной 1 / глицина, используя 330 ил на

20 фильтр. Среда А содержит 50 /, формамида, 5хССК, 0,4 поливинилпирролидона, 0,04 / фикола, 0,1/ ДСН, 25,иг поли(А)(Р и 2) и 100 ,иг дрожжевой P H К/ВДН, экстра ги рован на я

6 раз фенолом и осажденная этанолом, 25 Фильтры дважды промывают в среде А, а затем гибридизуют в течение 16 ч при 38 С (поли(А)РНК, как указано, обычно 5 — 8 мг) в среде А в парафиновом масле. Прибавляют

PHK следующим образом; один влажный

30 фильтр ДНК промокают и кладут в стерильную чашку Петри, 20 — 40,ил раствора РНК наносят пипеткой на этот фильтр, а второй фильтр ДНК (или дубликат или контроль) кладут на верх и сэндвич покрывают сте35 рильным парафиновым маслом, После гибридизации фильтры последовательно промывают в среде А (2 раза) в растворе, содержащем 1хССК, 0,2 /о ДСН, 1 мМ ЭДТУК (3 раза, 10 мин при 20 С каждый, среде А (2

40 ч и ри 38 С) и в 50 формамиде, 5хССК, 0,1 /

ДСН (3 раза, 10 мин при 20 С). Гибридизованную PHK элюируют при нагревании в течение 1 мин при 100 С в 200 ил 10 мМ

Трис-НС! (рН 7,4), 1 мМ ЭДТУК и 0,1 / ДСН.

45 Отбирают клон Ш-4-С, который содержит рекомбинантную молекулу ДНК, способную гибридизовать ИФН-аи PHK.

Рекомбинантная молекула ДНК в этом клоне обозначена: 2-pBR322(PstllHcIF50 4c/Hif-4c), а бактериальный штамм, содержащий ее: Е,coli XI776 (Z-pBR322)Pst

Н с! Е04С(Е.coli Hif-4c), 1764515

13

1 мкг этой PHK дает 4600 IU /мл

** Надосадочный ооцит после 4В ч инкубации, анализ по снижению цитопатического эффекта

Пример 7, Вставка сДНК в рекомбинантной молекуле Hif-4c составляет только 40 около 320 вр или треть от оценочного размера ИФН-амРНК. Описанный выше очищенный фрагмент Hif-4c используют в качестве зонда для отбора бактериальных клонов, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, 45 зируют электрофорезом на 1% агарозном геле.

Е.coli НВ101 трансформируют Hif-4C

ДНК. Отбирают 6 клонов трансформированных бактерий, стойких к тетрациклину, выделяют из них ДНК, очищаюти анализируют с помощью Pstl гидролиза, электрофорезом на агарозном геле, Одну ДНК обозначают

2-pBR322/Pst (HciF-4c (Hif-4C) и используют.

Хif-4С и вставку гибридизуют с ИcDH-а и РНК, подвергают гидролизу 125 единицами Pstl, эктрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом, Аликвоту (10,иг растворяют в 100,ил 50 мМ Трис-HCI (рН

7,5), пропускают его через 0,1 мл колонку и обрабатывают его 0,6 единицами бактериальной щелочной фосфатозы в течение часа при 65 С, Добавляют 10 кратно концентрированный буфер THE (40 мл) и раствор экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола и 3 раа

1 объемом хлороформа, ДНК осаждают 2 объемами этанола при -20 С в течение ночи и собирают центрифугированием. Для дальнейшей очистки образец в 0,5 мл ТНА адсорбируют на 0,25 мл ДЕАЕ целлюлозы, которую предварительно промывают 2 мл

150 мМ NaCI, 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 2 мМ

ЭДТУК (Н ЕТ-буфер), промывают 2 мл Н ЕТ буфера, элюируют 0,4 мл 1,5 М NaCI, 20 мМ

Трис-HCI (рН 7,5), 2 мМ ЭДТУК и осаждают этанолом, ДН К инкубируют с у P-АТФ (удельная активность около 5000 кюри/ммоль) и полинуклеотидкиназой, и очищают хроматографически на 3 мл колонке Сефадекс

G-50 в ТНЕ. Элюированные фракции собирают и осаждают P-ДНКэтанолом.

Смешивают 90,иг немечен ной расщепленной Pstl Hif-4c ДНК с 6 10 дпм P-ме5 32 ченной расщепленной Pstl Hif-4c ДНК и роводят электрофорез через 10х20х0,7 см, 2% горизонтальный агарозный гель в 50 мМ трис-ацетатно го буфера (р Н / 7,8), испол ьзуя гель 2,5 см. Пленку на геле экспонируют

Х-лучами и определяют положение фрагмента 320-вр. Полосу геля, содержащую радиоактивную полосу (1,3 10 дпм), вырезают, измельчают, продавливая через

2 мл пластиковый шприц, и экстрагируют в течение ночи при 4 С при перемешивании

10 кратным по отношению к объему геля объемом буфера НЕТ. ДНК адсорбируют на

0,1 мл колонке гидроксиапатита, предварительно промытой 1 мл НЕТ буфера. Колонку промывают 1 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 7,5) и элюируют ДНК 0,2 мл 1 М калийфосфатного буфера(рН 7,5). Элюат разбавляют 10-кратным объемом стерильной дистиллированной воды и адсорбируют

ДНК, и элюируют из ДЕАЕ, осаждают этанолом. Такая ДНК называется "Hif-4c фрагмент".

Фрагмент Hif-4c (120 нг) связывают с бумагой ДРТ (0,5х0,5 см). Для контроля 120 нг фрагмента Р-глобина сДНК обрабатывают с Hind lil из гибридной плазмиды RcP

G-4,13 2-pBR322 и обрабатывают аналогично, Гибридизацию двойных фильтров к поли(А) PHK (В 20 мкл), промывку фильтров и выделение PHK с фильтров проводят как описано выше. После введения s ооциты определяют следующие значения активности ИФН-а: имеющие родственные вставки гисридной

ДН К.

Описанные выше 64 бактериальных клона, составляющих подгруппу il-ill, дробят на миллипористой мембране (диаметр 8 см), помещают на пластинку агара (с добавкой диаминопимеллиновой кислоты, налидиксовой кислоты и тетрациклина, как

1764515

40

50 указано выше) и инкубируют в течение 24 ч при 37 С. Фильтр помещают на 0,75 мл каплю 0,5 M раствора NaOH и через 2 — 3 мин переносят на бумажное полотенце, чтобы удалить избыток жидкости, эту стадиют повторяют. Фильтр нейтрализуют, используя буфер 1,5 M Tpuc-HCI (рН 7,5) и промывают смесью 1,5М NaCI-0,5 М Трис-HCI (рН 7,4) и высушивают на воздухе. Фильтр окунают в

0,3 М раствор NaCI, высушивают на воздухе и нагревают в вакууме 2 ч при 80 С.

Фрагмент Hif-4c Pst(30 нг) метят изотопом - P посредством трансляции метки, используя / P МАТФ и а Р бЦТФ (удельная активность, 40 Кюри/ммоль для каждого), Фильтр, несущий Л-Ill колонии, предварительно гибридизуют в 4 х СЕТ (СЕТ-это 0,15

М NaCI, 30 мМ Трис-HCI (рН вЂ” 8), 1 мМ

ЭДТУК). 0,1% (вес/объем) фиколла, 0,1% поливинилпирролидина, 0,1% (вес/объем) альбумина бытьей сыворотки (АБС) 0,5%

ДСН и 200 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося в течение 7 час при 68 С и гибридизуют с 2 10 срм меченого P фрагмента Hif-4c в 4 х

СЕТ, 0,02% (вес/объем) фиколла, 0,02% поливинилпирролидина, 0,02% (АБС, 0,5%

ДСН и 2300 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосоля при 68 С в течение 16 час), Фильтр промывают смесью СЕТ-0,5% ДСН при комнатной температуре, промывают 2 х

СЕТ-0,5% ДСН в течение 5 ч при 68 С, заменяя один раз раствор, и 3 MM основания

Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч, заменяя один раз раствор, После высушивания фильтра рентгеновскую пленку экспонируют этим фильтром в течение 80 ч, применяя экран. Три колоннии дают сильный положительный сигнал, а именно Л-III70 Л-III-2H и iL-III-4с, и две колонии — слабый сигнал, а именно Л-ШНЕ и Л-ill-3D. z

Малые культуры готовят из родственных Hif-4с клонов, форму 1 ДНК очищают, расщепляют с Pstl и анализируют посредством электрофореза на геле агарозы, Все формы 1 ДНК создают большой фрагмент (плазмидная pBR 322 функциональная группа) и малый фрагмент (гибридная вставка), Молекулы рекомбинантной ДНК Л-III-2H содержат наиболее крупную вставку, а именно приблизительно 990 млрд.ч, Эту молекулу рекомбинантной ДН К обозначают

Z-pBR 322 (Pst)/HCIF-2Í/(Hif-2H), а ее вставку "Hif-2H фрагмент", Определяют спсообность Hif-2Н связывать ИФН-амРНК посредством гибридизации по отношению к поли(А) PHK (0,3 мкг/мкл).

В последующем эксперименте готовят дополнительнь и набор клонов Е,соИ, содержащих молекулы рекомбинантной ДНК, и определяют гибридизацию колоний к меченому фрагменту Hif-4с, Для того, чтобы обеспечить высокий выход плазмид с длинными вставками сДНК, часть меченной Р лейкоцитной сДНК, полученной энзиматически из лейкоцитной поли(А) РНК, фракционируют по размеру посредством центрифугиования через градиент плотности сахарозы, ипользуя методику, аналогичную описанной для центрифугирования поли(А) РНК. Фракции, содержащие сДНК, со скоростью седиментации, соответствующей 600 млрд.ч. фрагмента ДНК или более, объекдиняют и после осаждения этиловым спиртом выделяют сДНК. Эту сДНК удлиняют остатками dCMP. pBR322, удлиненную

dGMP, расщепляют Pstl и гибридную ДНК используют для трансформации штамма

Е.coli НВ101. Бактерии наносят на миллипористые фильтры диаметром 8 см, помещают на пластинки агара триптоновой среды (содержащие 10 мкг/мл тетрациклина) и выращивают, пока не появляются малые колонии. Фильтр реплики готовят прессованием свежего, влажного миллипористого фильтра на фильтр, содержащий колонию, помещают его лицевой стороной наверх агаровой пластины, содержащей 4,4% глицерина, и инкубируют его, пока не появились малые колонии, Этот содержащий колонии фильтр покрывают дополнительным миллипористым фильтром, замораживают при55 С и хранят. Готовят 18 фильтров, содержащих в общем около 5000 колоний.

Одну реплику каждого фильтра используют для гибридизации к меченому P Pst Hit-4c фрагменту ДНК. На авторадиограмме идентифицируют около 185 положительных колоний, которые субклонируют на миллипористых фильтрах и идентифицируют повторно посредством гибридизации, 95 клонов, дающих наиболее сильный отклик гибридизации, обозначают от Z-pBR 322 (Pst)/HclF-SNl до SN95 и используют для дальнейших исследований.

Очевидно, при наличии способности

Hif-2 продуцировать полипептид, проявляющий иммунологическую или биологическую активность ЧеИФН, Hif-2h и другие родственные последовательности оснований ДНК, могут применяться в этом пособе отбора клонов, содержащих последовательности основания ДНК, кодирующих интерферон а2.

Пример 8. Расщепленный фрагмент

Z р В 8322(НЗ)Рсфср 4,13 динатурируют в сме17

1764515

18 си 10 мкл 80/ (об.) деионизированного формамида-20 мМ буфера Пайпес (рН 6,4) в течение 10 мин при 80 С, Раствор добавляют в трубку Эппендорфа, в которой высушивают смесь лейкоцитной поли(А) РНК (5 мкг), NaCI (4 мкмоль) и ЭДТУК (10 нмоль), Смесь нагревают в течение 7 ч при 48 С под слоем парафинового масла, охлаждают и разбавляют 20 мкл воды. Два ообразца разделяют на равные части и каждую из них нагревают

30 с при 100 С, Нуклеиновые кислоты осаждают этанолом, растворяют в 3 мкл воды и анализируют на активность ИФН-а мРНК в ооцитах.

При гибридизации Н!1-2h поли(А) PHK ингибируется трансляция ИФН-а мРНК в поли(А) РНК; после денатурирования гибрида, ИФН а мРНК снова может транслироваться, Этот эксперимент подтверждает, что Hif-2h содержит последовательность, комплементарную к ИФН-ймРНК.

Получают плазмидную ДНК и обрабатывают различными рестриктазами за исключением того, что альбумин бычьей сыворотки в ферментном буфере заменяют на 200 мкг-мл желатина, Леаниризованную ДНК (20 мкг) экстрагируют фенолом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 0,05 М растворе буфера

Трис-KCI (рН 8) и пропускают через неболь-! шую колонку. Челекс-100. Фрагменты с 5липкими концами дефосфолируют путем обработки с0,,2 единицами телячьей кишечной щелочной фосфатозы на пмоль концов

5 ДНК в 200 мкл 0,02 M раствора Трис-НС2 (рН 8) в течение 60 мин при 37 С, Фермент дезактивируют нагреванием при 65 С в течение 60 мин. Для фрагментов ДНК с 3-липкими концами используют бактериальную щелочную фосфатазу, с тем исключением, что инкубируют при 65 С в течение 30 мин, фосфорилированную ДНК очищают путем адсорбции и элюирования с ДЕАЕ-целлюлозы или подвергают полиакриламидному гельэлектрофорезу, Фрагменты, выделеные из геля полиакриламида (или агарозы) в

0,15М растворе NaCI, 0,05 М-Трис-HCI (рН

8), адсорбируют на 0,1-миллилитровой оксиапатитовой колонке, промывают 4 раза 1 мл

0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7) и элюируют 0,3 мл 1М калий-фосфатного буфера (рН 7). Раствор разбавляют десятикратно, и адсорбированную на ДЕАЕ-целлюлозе ДНК выделяют, После осаждения этиловым спиртом ,ЦНК метят 5 -терминально с помощью

lY Р)АТР(12 — 34 мкКюри на пмоль 5-концов

ДНК), а полинуклеотидную киназу ДНК не денатурируютдо реакции киназы, Получают

55 удельные активности 1 — 1,5 мкКюри Р фосфата на пмоль концов-5-ДНК, Для определения последовательности аминокислот меченые. фрагменты расщепляют вторым ограничивающим ферментом, и продукты выделяют электрофорезом через 5 -ный полиакриламидный гель в буфер трис-борат-ЭДТУК, Целевые фрагменты экстрагируют из геля и очищают. Различные фрагменты для определения последовательности аминокислотных остатков готовят следующим образом:

1) расщепление Hif-2h с помощью BSpl, выделение BSpl-BSpl-232 и BSpl-BSpl-949 посредством гель-электрофореза через 5 полиакрламида в буфере Доенинга;

2) расщеплеие Hif-2h с помощью BSpl, введение метки, расщепление с помощью

PstI, выделение Bspl*-Pst1-83 и BSpl*-Pst

1-227;

3) Расщепление Hif-2h с помощью Bg ill, введение метки, расщепление с Pstl, выделение Bglllx-Pst 1-336 и Bglll*-Pst1-570;

4) расщепление Hif-2h с помощью

Mb011, введение метки, гидролиз с помощью Pst1 и Hindll, расщепление фрагмента pBR322, 350 млрд.ч., выделение

Mbo11*-Pst 1-519 и МЬо11*-Pst 1-351;

5) Расщепление Hif-2h с помощью

EcoR1, введение метки, расщепление с

Рзс1, выделение EcoR1*-Pst 1-707 и

Есо R l*P stl-198;

6) расщепление Hif-2h с помощью Pst1, введение метки, расщепление с Bglfl. выделение Pst1*-Bglo-570 и Pst1*-Вц)П-336;

7) рас