Способ идентификации штаммов гомобазидиальных грибов

Способ идентификации штаммов гомобазидиальных грибов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология, а именно способы определения идентичности мицелиальных культур. Сущность изобретения; способ заключается в скрещивании испытуемых гаплонтов с тестерными гаплонтами базисного штамма. По результатам образования дикариотического мицелия с пряжками устанавливают идентичность штаммов, где у видов с биполярной системой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 50%, а у видов с тетраполярной системой - 25%. 2 з.п.ф-лы.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (t9) (I I) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТКНИ

К ПАТЕНТУ (21) 4756902/13 (22) 03.11.89 (46) 23.10.92. Бюл. Мв 39 (71) Институт ботаники им. Н.Г.Холодного (72} Н,И,Даниляк, О,А.Федоров и С.В.Решетников (73) Институт ботаники им. Н.Г.Холодного (56) Can. T. Bot„1965, v. 33, М 1, р. 10971139.

Studies in mycoiogy, 1978, М 16, р. 1248. (54) СПОСОБ, ИДЕНТИФИКАЦИИ . ШТАММОБ ГОМОБАЗИДИАЛЬНЦХ ГРИБОВ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения идентичности мицелиальных культур, в частности гомобазидиальных грибов.

Определение видовой принадлежности гомобазидиомицетов базируется преимущественно на признаках строения плодового тела грибов. Идентификация культур этих грибов основана на комплексе признаков макро- и микроморфологии, ферментатив- ной активности мицелия (макрохимические цветовые реакции) и линейной скорости роста колонии. Совокупность этих показаталей, однако,.не является надежным критерием для разграничения видов базидиальных грибов, обладающих в отличие от других групп грибов достаточно однотипной структурой вегетативного мицелия.

Имеющиеся ключи для идентификации культур некоторых дереворазрушающих афиллофоральных грибов во многих случаях позволяют провести определение только до рода, или же одно описание соответствует группе близких видов. Аналогич(st)s .С 12 Q 1/68, 1/02, 1/06, 1/34 (57) Использование: биотехнология, а именно способы определения идентичности мицелиальных культур. Сущность изобретения; способ заключается в скрещивании испытуемых гаплонтов с тестерными гаплонтами базисного штамма. По результатам образования дикариотического мицелия с пряжками устанавливают идентичность штаммов, где у видав с биполярной системой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 50%, а у видов с тетраполярной системой — 25%. 2 з.п.ф-лы, М

В ные ключи для агарикальных грибов не разработаны.

Отсутствие надежных видовых, а тем более штаммоспецифичных культуральных признаков гомобазидиомицетов делает актуальным хемотаксономические подходы в систематике этой группы грибов, основанные на определении изоферментных спектров методом гель-электрофореэа.

При решении задачи разграничения штаммов гомобазидиальных грибов наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ определения изоферментного состава глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, в частности показаны различия по данному показателю у четырех штаммов сьедобного культивируемого гриба вешенка обыкновенная. Недостатком данного метода является изменчивость иэоферментных спектров грибов, зависящая.от возраста культуры или связанная с проявлением биоритмов различной длительности, что у баэидиальных грибов выражает. ся в наличии сезон-специфичных изоформ

1771485 некоторых ферментов. Такая вариабельность изоферментных спектров приводит к тому, что этот показатель чаще используется при установлении границ между отдельными видами, например, в роде Agaricus, чем для диагностики штаммов, Целью изобретения является повышение точности идентификации штамма гомобазидиомицета в пределах одного вида.

Поставленная цель достигается благодаря то ф-,.ите Идентификацию основывают на одн зн чном взаимодействии гаплоидных мицелиев,.определяемом экспрессией: штаммоспецифичных аллелей генов системы половой несовместимости, для чего проводят расщепление испытуемого дикариотического штамма на две гаплаидные культуры, осуществляют скрещивание испытуемых гаплонтов с тестерными гаплонтами базисного штамма и по результатам скрещивания, критерием осуществления которого является образование дикариатическаго мицелия с пряжками, устанавливают идентичность штаммов, где у видов с биполярной системой половой несовместимости гаплонты идентичных штаммав имеют частоту скрещивания 50, а у видов с тетраполярной системой половой несовместимости гаплонты идентичных. штаммов имеют частоту скрещивания 250 .

Пример 1; Требуется установить идентичность двух штаммов гомобазидиомицета, имеющего биполярную систему половой несовместимости.

Споры- из базидиоспорового отпечатка

Phlebia merismoldes Fr, суспендируют в стерильной водопроводной воде и готовят из нее в малых химических пробирках с 5 мл стерильной водопроводной воды 3-5 последовательных. разведений 1;10. Разведенную суспензию базидиоспор высевают по 0,5 мл в чашки Петри на агаризованное пивное сусло (S по Баллингу, рН 5,5) и равномерно распределяют по поверхности ага,.ра микробиологической петлей или шпателем, Через 24ч чашки помещают под световой микроскоп с объективом х10 и находят.проросшую спору. Убедившись в отсутствии в поле зрения других проросших или непроросших базидиаспар, выводят найденную проросшую спору в центр поля зрения микроскопа и полностью закрывают полевую диафрагму микроскопа. При этом в толще агара высвечивается световой столбик, на вершине которого находится необходимый праростак, Паварачива ат в сторону револьвер с объективом и вырезают из чашки агаровый столбик со спорой, обрезанной медицинской иглой с заточенными краями. Диаметр иглы подбирают

25 несовместимости. Любая из гаплоидных культур данной группы может быть

35

40 водят расщепление испытуемого штамма на два гаплонта, Для этого мицелий испытуеного жидкого пивного сусла 4 по Баллингу, 45 рН 5,5. Выращивание проводят при 25 С в стационарных условиях. Выросшую биомассу отделяют от культуральной жидкости, пе. реносят в стакан гомогенизатора типа 302 (ПНР), доводят да KoltTp0flbHOA метки сте50 рильнай водопроводной водой и измельчают при 10 тыс. оборотов в минуту в течение

5 мин. Гамогенат содержит фрагменты мицелия длиной не более 500 мкм, состоящие из нескольких клеток гифы. Полученный го55 могенат разводят стерильной водопроводной водой 1:100 и используют в качестве инокулюма (0,5 мл) на 50 мл среды следующего состава, г(л: глюкоза 20,0; глицин 5,0; мясной пептан 10,0, Среду указанного состава стерилизуют в колбах Эрленмейра ем5

15 меньше поля зрения микроскопа, но больше диаметра светового пучка при закрытой полевой диафрагме. Возвращают объектив в исходное положение и контролируют точность вырезания споры. Медицинскую иглу подсоединяют к стерильному шприцу и выдувают агаравый столбик с проросшей спорой в чашку Петри со свежей сусло-агаровай средой. На одну чашку помещают около десяти выделенных спор. Выросшие колонии микроскопируют и те, которые не имеют пряжек, отсевают на скошенный агар в пробирки. Отбор комплементарных гаплонтов проводят на сусло-агаровой среде в чашках

Петри, размещал тестируемые пары гаплонтов на расстоянии 2 см друг ат друга. В случае мицелиального контакта двух колоний через 7 — 10 сут микроскопируют мицелий, образующийся в зоне контакта, и при наличии пряжек отмечают такие кроссы как положительные (табл, 1).

Выявленные группы гаплонтов противоположнага типа спаривания маркируют (произвольна) как группу с А1 и А2 фактором тест-культурой для сконструированного дикариона. Например, для дикариана, составленного из гаплонтов 2 и 7, отличающегося среди других дикарионов наибольшей целлюлазной активностью, в качестве тесткультур данного дикариотического штамма могут выступать не только гапланты 2 и 7, но и другие гапланты, несущие A) и Az факторы половой несовместимости.

Для установления идентичности дикариотического штамма Р. merismoides 27(составлен из гаплантав 2 и 7) с другим дикариатическим штаммом этого вида промого штамма вносят в колбы Эрленмейра емкостью 0,5 л, содержащие 0,15 л стериль1771485

35

50 костью 0,5 л 15 мин при давлении пара

0,1 мПа. По мере роста глубинных шариков мицелия периодически проводят микроскопирование краевых гиф мицелия на наличие пряжек. Через 7 — 10 сут выращивания на качалке, когда мицелиальные шарики достигнут размера 2-4 мм и большинство иэ них не будет иметь краевых дикариотических гиф, биомассу отделяют от среды и проводят повторную гомогенизацию в указанном выше режиме. Полученный гомогенат разводят стерильной водопроводной водой 1;10 и высевают по 0,5 мл на агариэованное пивное сусло в чашки Петри. Выросшие колонии проверяют под микроскопом на отсутствие пряжек и отсевают в качестве испытуемых гаплонтов, Один иэ произвольно выделенных гаплонтов скрещивают с

5-6 другими гаплонтами или с большим числом до тех пор, пака не обнаружится комплементарный гаплонт, формирующий дикариотический мицелий. Отобранные два комплементарных гаплонта испытуемого штамма скрещивают с тестерными гаплонтами базисного штамма. Если частота скрещивания между ними равна 50 j, то сравниваемые дикариотические штаммы идентичны. При всех других значениях частоты скрещивания дикариотические штаммы имеют различное происхождение (табл. 2).

Пример 2. Требуется установить идентичность двух штаммов гомобазидиомицета, имеющего тетраполярную систему половой несовместимости.

Выделяют гаплонты Pleurotus ostreatus (Fr,) Kumm. из базидиоспор, как зто описано в примере 1. Для выделения тестерных гаплонтов производят скрещивание 14-16 культур, выделенных из базидиоспор, как это описано в примере 1 (табл. 3).

Выявленные группы гаплонтов противоположного типа спаривания маркируют (произвольно) как группы с А181, А2В2, А182 и А В факторами несовместимости. B каждой группе из четырех типов спаривания выбирают одну гаплоидную культуру в качестве тестерной. Например, выбраны гаплонты 3, 6, 5, 12 и из первых двух составлен дикариотический штамм 36.

Для установления идентичности дикариотического штамма 36 с другим дикарио5

25 тическим штаммом этого вида производят расщепление испытуемого штамма на два комплементарных гаплонта, как это описано в примере 1. Эти два гаплонта скрещивают с тестерными гаплонтами базисного штамма. Если частота скрещивания между ними равна 25 „то сравниваемые дикариотические штаммы идентичны. При всех других значениях частоты скрещивания дикариотические штаммы имеют различное происхождение (табл. 4).

Таким образом, предлагаемый способ идентификации штамма гомобаэидиальных грибов может быть реализован на основе общепринятых микробиологических приемов обращения с культурами грибов, причем экспрессия уникальных генов системы половой несовместимости скрещиваемых гаплонтов определяется по морфологическому маркеру на гифах мицелия (пряжке) методом световой микроскопии.

Практическая реализация изобретения создает основу для решения проблем правоохранности объекта при внешнеторговой реализации лицензии и осуществлении авторского надзора за штаммом гомобаэидиального гриба.

Формула изобретения

1. Способ идентификации штаммов гомобаэидиальных грибов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности идентификации штамма в пределах одного вида, получают тестерные гаплонты иэ базисного штамма, выделяют гаплонты из исследуемого штамма, скрещивают полученные гаплонты и идентифицируют штамм по частоте скрещивания гаплонтов, которую выявляют по наличию пряжки у дикариотического мицелия.

2. Способ по и. 1, отл ич а ю щи йс я тем, что при идентификации штаммов с биполярной системой несовместимости идентифицируют исследуемый штамм как идентичный базисному штамму при частоте скрещивания гаплонтов 50 $.

3. Способпоп.1,отличающийся тем, что при идентификации штаммов с тетраполярной системой несовместимости идентифицируют исследуемый штамм как идентичный базисному штамму при частоте скрещивания гаплонтов 25 .

1771485

Таблица1

° ° в ° в в ва ав»7«вава«а«авва«ее «в«

6,6 (6 )7 8 1 3 6 I7 L8 5 L2 j6

1 )2

АБ1 1+11

1l 11 мицелий с пряжками; дикариона не

Т а б л и ц а 2 ва ° е

Ытамм имеет обе аллели, отличающиеся от базисного

Итамм имеет одну общую аллель с базисным штамм,, идентичный с базисным а« ю » °. А А,. Я

° е

A5 I Ae

« ° ба в

Тестерные гаплонты базисного дикариона шт.2 А< т.7 А

Частота скрещивания

100 ь

А - фактор системы половой несовместимости, цифра обозначает аллел ьност ь;

"+" - гаплоидные культуры .совместимы, образуется дикариотический мицелий с пряжками;

"-" - культуры несовместимы, контакт .гиф и образование дикариона не происходит

Выявление комплементарных гаплонтов у P.merismoides

+ + - " 1 + + + + +

+ + + + + + + + +

+ + ™ 3 + + + + +

+ + - - 4

+ + ю + + +

+ + - + + 6 +

+ + " " 7 + в + + в ю Q +

°в ав ю в в исходная таблица скрещиваний восьми гаплонтов; преобразованная таблица скрещиваний; культуры совместимы, образуется дикариотический культуры несовместимы, контакт гиф и образование происходит.

Варианты скрещивания тестерных гаплонтов базисного дикариона

Phlebia merismoides с гаплонтами дикарионов, имеющих различные аллели спаривания

2 А„

1

4 A

7 е

1771485

Табл и ца 3

ыявление комплементарных гаплонтов

P.ostreatus

2 l5 (A,В Э

Д 3 12

"+" - культуры совместимые; "-" - культуры несовместимые

Таблица 4

Варианты скрещивания тестерных гаплонтов базисного дикариона Pleurotus ostreatus c гаплонтами дикарионов, имеющих различные аллели спаривания

"+" — культуры совместимы, образуется дикариотический мицелий с пряжками;

"-" — культуры несовместимы, контакт гиф и образование диканриона не происходит

Редактор Г. Бельская

Заказ 3754 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

2 +

6 +

Аа, 8+

l0 +

13 +

Ag q 4

14

Составитель С. Решетников

Техред М.Моргентал Корректор И Шулла