Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии

Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в области биологии и медицины и предназначено для создания равномерной электропроводности ткани перед ее исследованием в растровом электронном микроскопе. Сущность изобретения: биологическую ткань фиксируют и затем обрабатывают в течение 10-15 мин смесью, содержащей следующие компоненты , мас.%: CuS04 5Н2О 5-6; 7Н2О 7-8; 25% аммиака 12-15; диет, вода - остальное, а затем в 2-2,5% растворе Na2S ЭНзО на дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин. При этом время подготовки образцов сокращается в 2 раза и полностью исключается применение драгоценных металлов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ . РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4863832/14 (21) 31.08.90 (46) 30.10.92. Бюл, N. 40 (71) Киевский научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной хирургии (72) Е.Б. Медвецкий и Е,П. Тумасова (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1168818, кл. G 01 N 1/28, 1985. Бюл. N. 21. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ К РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ (57) Использование: в области биологии и медицины и предназначено для создания равномерной электропроводности ткани

Изобретение относится к области био. логии и. медицины и предназначено для создания равномерной электропроводности ткани перед ее исследованием в растровом электронном микроскопе.

В настоящее время существует несколько способов придания свойств электропроводности биологическим тканям: покрывают их тонким слоем металлов (золотом, платиной, палладием, осмием), напыляют углеродом с последующим нанесением слоя блугородного металла. Обрабатывают в растворе четырехокиси осмия с последующей пропиткой иодидами металлов и ацетатом свинца, выдерживают в тиокарбогидразиде или таниновой кислоте, а затем обрабатывают четырехокисью осмия.

Наиболее близким по технической сущности и принятым за прототип является способ придания злектропроводности тканям в растворах солей благородных металлов.

<в> .Жпи 1772749 А1 (я)з 6 01 и 33/48//G 01 N 1/288 перед ее исследованием в растровом электронном микроскопе. Сущность изобретения: биологическую ткань фиксируют и затем обрабатывают в течение 10-15 мин смесью, содержащей следующие компоненты, мас.)(,: Cu$04 5Н О 5 — 6; ZnS04 .

7НгО 7 — 8; 25% аммиака 12 — 15; дист. вода — остальное, а затем в 2-2,5% растворе Na S . 9Н20 на дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин. При этом время подготовки образцов сокращается в 2 раза и полностью исключается применение драгоценных металлов.

Основным недостатком этого способа является длительное время подготовки тканей к исследованию, а также использование драгоценных металлов.

Целью изобретения является сокращение времени подготовки материала и повышение экономичности способа.

Указанная цель достигается тем, что в способе подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии, включающем фиксацию препарата и обработку солями металлов, согласно изобретения, после фиксации проводят обработку солями металлов в растворе, содержащем;

CuSO4 . 5Н20 — 5 — 6 мас.

ZnS04 Hz0 — 7-8 мас.%

25% аммиака — 12 — 15 мас.% вода дист. — остальное с последующей обработкой в 2-2,5% растворе Ма2$9HzO.

Способ осуществляется следующим образом.

1772749

Образец ткани фиксируют 2-2,5ф,-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере в течение 2-2,5 ч, отмывают от фиксатора в дист, воде и на 10-15 мин при комнатной температуре погружают в раствор, состоящий из;

CuSO4 5НгΠ— 5 — 6 мас. (ZnS04 7НгΠ— 7 — 8 мас.)(257 аммиака — 12 — 15 мас, дист. вода — остал ьное.

Далее объект переносят на 0,5 — 1 мин в горячую проточную воду (55 — 60 С). Затем выполняют сульфидирование ткани в 22,5";ъ раствора йаг$9НгО при комнатной температуре. Промывку производят в проточной воде в течение 0,2 — 0,5 мин, Далее объект обезвоживают одним иэ способов, применяемых в электронной микроскопии и изучают в раствором электронном микроскопе, При этом смесь препаратов готовят следующим образом.

В дистиллированной воде (60 мл) растворяют сернокислую медь до полного растворения, затем сернокислый цинк, добавляют 25;ь аммиак, доводят объем до

100 мл дист. водой.

Пример 1, Биопсийный материал в виде кусочка ткани печени был зафиксирован в 2,5 -ном растворе глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере в течение

2 ч, тщательно промыт в дистиллированной воде. Затем на 15 мин при комнатной температуре был погружен в раствор, состоящий из, мас.ф>.

CuS0a 5НгΠ— 5

ZnSOq 7НгΠ— 7

257 . аммиак — 12 дист. вода — остальное.

Далее препарат был перенесен на 1 мин в горячую (60 С) проточную воду. Затем выполняли сульфидирование ткани в 2,5 ном растворе йаг$9НгО при комнатной температуре в течение 1 мин. Промывают

0,5 мин в проточной воде. После этого подготовленный таким образом материал обеэвоживали в спиртах восходящей концентрации от 30 до 100О, наклеивали объект на подложку и изучали в.растровом электронном микроскопе.

Было отмечено, что данная обработка не повлияла на качество изображения исследуемого материала и на получаемую при этом информацию. Качество иллюстраций, полученных предлагаемым способом, не уступает результатам при использовании способа прототипа, 5

Пример 2, Участок подколенной вены фиксировали в течение 2 ч в 2,5 -ном растворе глутарового альдегида, промывали в дист. воде, Погружали на 10 мин при комнатной температуре в раствор, состоящий из, мэс.%I.

Со$0а 5НгΠ— 6

ZnS04 7НгΠ— 8

257ь аммиак — 15 дист. вода — остальное.

Затем препарат перенесли на 1 мин в горячую воду. Сульфидирование выполняли в 2)(,-ном растворе йаг$9НгО в течение

1 мин при комнатной температуре. Промыли

0,5 мин в проточной воде. Далее подготовленный материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации от 30 до 100, наклеивали на подложку и изучали в растровом микроскопе.

Поверхность эндотелия, участка подколенной вени, обработанной данным способом, имеет оптимальный контраст, внутрисосудистые образования, нити фибрина. Для сравнения с прототипом была исследована поверхность биопсийного материала органов пищеварения, сосудов и камней желчного пузыря у 72 больных по предлагаемому способу и способу прототипу.

Исследования проводили при различных увеличениях микроскопа tEM — 100 S c растровой приставкой АЗИД вЂ” 5(Япония) (см. таблицу).

При этом отмечено, что качество иллюстраций, полученных предлагаемым способом, не уступает результатам при использовании способа-прототипа. Кроме того, кристаллические образования выглядят более контрастнее и отчетливее, а время подготовки образцов к исследованию сокращается в 2 раза (беэ учета времени фиксации).

Формула изобретения

Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной- микроскопии путем ее фиксации с последующей обработкой солями металлов, о т л и ч а ю щи йс я тем, что, с целью сокращения времени подготовки и повышения экономичности способа, обработку ткани проводят в течение

10 — 15 мин смесью, содержащей следующие компоненты, мас, CuS04 5НгΠ— 5-6:

ZnSO4 7НгΠ— 7-8; 25 g,-ный аммиак—

12-15 и дистиллированная вода — остальное, а затем в течение 0,5 — 1 мин 2 — 2,5 ным раствором NazS 9НгО.

1772749

Зависимость качества иэображения в растровом электронном микроскопе от концентрации используемых растворов

Кон ент а ия аство в

Реэультаты иэображения

Сернокислвя ме ь

Сернокислый инк

Суяьфид мат ия

Аммиак 25 $

Низкий контраст, наличие бликов

Умеренный контраст, наличие слабых бликов

Оптимальный контраст, блики отсутствуют

Оптимальный контраст, бликов нет

Повышенный контраст, резкость иэображения снижена

Высокий контраст, резкость изоб ажения снижена

1.5

2,5

13-15

Составитель Е.Тумасова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Л,Ливринц

Редактор А.Бер

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3844 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5