Способ синтеза олиго/поли/ нуклеотидов и устройство для его осуществления

Способ синтеза олиго/поли/ нуклеотидов и устройство для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в молекулярной биологии , генной инженерии и медицинр. Сущность изобретения: продукт: ол и г опол ину клеотид состава (GATCCAGTACCTCCCTTTCCACAC GCAACACTCTCTTT-CCCCCAGATCCCTTC TCGATCA), выход 1.20.Е.260 (2 наномоля). Реагент 1:5 -0-защищенным З -Н-фосфонзт нуклеотидного компонента. Реагент 2 хлорангидриды кислот при соотношении 0,9- 1.5 зкв.: 1 экв. нуклеозид-З -Н-фосфоната. Условия реакции: смешивание проводят за 0,01-1,0 с, конденсацию за 0,5-2,5 с при 30- ббЧ причем операции повторяют 2-20 раз. 2 н п ф-лы, 1 ил , 1 табл. (Л С

союз соВетских социАлистических

РЕСПУБЛИК (51)5 С 07 Н 21/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ!

i asst

1 ) бд О

1 и

1О

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4875257/04 (22) 18.10.90 (46) 07.11.92. Бюл. N 41 (71) Кооператив "БИОС" (72) В.П.Кумарев, С.И.Беликов, В,Ф.Кобзев, К.Д.Кузнеделов, Л,В.Баранова и IO.Г.Средин (56) Заявка EP N. 0219342, кл. С 07 Н 21/00 1986.

Заявка ФPГ N 3306770. кл. С 07 С 21/00, 1983.

Патент США N. 4483964, кл, С 12 M 1/00, 1984, ВЛ,lames, 0/,Giles, В.Е,Morrison. Int

Biotechn. Lab, 1987, 5.1.

Изобретение относится к области биорганической химии и может быть использовано в молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине.

Известен способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов и синтезатор, применяемый для реализации этого способа, который включает реактор в виде сосуда проточного типа, внутри которого размещен твердофазный носитель, блок подачи реагентов, блок смешивания мономера и активирующего агента, который выполнен в виде последовательно соединенных емкости, клапана и трубопровода.

Недостатки способа и устройства заключаются в малой производительности изза длительного процесса смешивания и подачи смеси в реактор, а также повышенного расхода реагентов.

Известен способ синтеза полинуклеотидов и устройство для его реализации, взятые Ы«, 177391бА1 (54) СПОСОБ СИНТЕЗА ОЛИГО(ПОЛИ)НУКЛЕОТИДОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (57) Использование: в молекулярной биологии, генной инженерии и медицине.

Сущность изобретения: продукт: оли го пол инуклеотид состава (GATCCAGTACCTCCCTTTCCACAC

G CAACACTCTCTTT-CCCCCAGATCCCTTC

TCGATCA), выход 1.20,Е,260 (2 наномоля), Реагент 1:5 -0-защищенным 3 -Н-фосфонат нуклеотидного компонента. Реагент 2. хлорангидриды кислот при соотношении 0,91,5 экв.: 1 экв. нуклеозид-3 -Н-фосфоната.

Условия реакции: смешивание проводят за

0,01-1,0 с, конденсацию за 0,5-2,5 с при 3065 .",причем операции повторяют 2-20 раз, 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл, эа наиболее близкие. Способ заключается в смешивании 3 -Н-фосфонатов защищенных нуклеозидов с дегидратирующим агентом, конденсации с 5 -0Н-концевой группой защищенного нуклеозида, связанного с твердым носителем, с последующим удалением

5 -О-защитной группы, повторении этих операций до получения полинуклеотида с необходимым числом мономерных звеньев, окислении полинуклеотид-Н-фосфоната и отделении его от носителя.

Синтезатор, с помощью которого осуществляется способ синтеза, включает реактор в виде сосуда проточного типа, внутри которого размещен твердофазный носи-. тель, блоки размещения и подачи основных и вспомогательных реагентов, выполченные в виде сосудов и трубопроводов, клапанов смешивания и газовой системы, Смешивание исходного мономера и активирующего агента осуществляется в канале, 1773916 вход которого связан с выходом блока размещения и подачи реактивов, а выход — с входом реактора.

Недостатком способа и устройства является низкая производительность и повышенный расход исходных компонентов из-за большого времени, предусмотренного для смешивания реагентов и их подачи в реактор.

Цель изобретения состоит в повышении производительности способа и устройства за счет сокращения времени проведения синтеза и экономии используемых реагентов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе синтеза олиго(поли)нуклеотидов, включающем промывку носителя с закрепленным на нем нуклеозидом, смешивание

5 -0-защищенного нуклеозид-У-Н-фосфоната с дегидратирующим агентом, конденсацию с 5 -ОН-группой нуклеозидного компонента, закрепленного на носителе, последующее удаление 5 -0-защитной группы, повторение этих операций до получения полинуклеотид-Н-фосфоната с нужным числом мономерных звеньев, окисление полинуклеотид-Н-фосфоната до полинуклеотида, отщепление его от носителя, в качестве дегидратирующего агента используют хлорангидриды кислот в соотношении

0,9-15 экв. на 1 экв. нуклеозид-3 -Н-фосфоната, их смешивание и подачу на носитель проводят за время t«. = (0,01-1.0) с, а конденсацию — за время (0,5-2.5) с, причем эти операции повторяют 2-20 раз при температуре реагентов на всех стадиях синтеза 30650С, Поставленная цель достигается тем, что устройство для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, содержащее реактор проточного типа, где размещен носитель, связанный с нуклеозидом, блок размещения и подачи основных реактивов, блок размещения и подачи вспомогательных реактивов, блок управления, смеситель, вход которого соединен с выходом блока размещения и подачи основных реактивов, а выход смесителя соединен с входом реактора, запорный клапан, соединенный с,выходом реактора, дополнительно содержит блок нагрева и поддержания заданной температуры растворов реагентов, смеситель содержит камеру и пористую перегородку из нейтрального материала, которая располо>кена непосредственно на входе реактора, причем размеры смесителя соответствуют условию 0,01 Чо = Чсм 1,0 Чо, где VCM — обьем жидкости, который может вместить смеситель, Чв — объем смеси реактивов, подаваемых в реактор за 1 с, выход блока

45 размещения и подачи вспомогательных реактивов соединен с камерой смесителя.

Сущность заявляемых технических решений основана на обнаруженном эффекте, который не мог быть достигнут на основании известных закономерностей протекания химических реакций, Как показали исследования, эффективность проведения синтеза существенным образом зависит от времени, прошедшего после смешивания реагентов, Сокращение времени смешивания и подачи мономеров и конденсирующего агента, а также сокращения избытка конденсирующего агента, приводят к более эффективному образованию ме>кнуклеотидной связи на твердофазном носителе, что позволяет использовать значительно меньшее количество дефицитных реактивов.

Известные технические решения основаны на проведении операции смешивания реагентов в смесительных камерах или трубопроводах с последующей подачей их в реактор. В предло>кенном решении смешивание происходит непосредственно при подаче растворов в реактор, восновном,,на пористом слое из нейтрального материала.

Процесс смешивания происходит за вре ля продавливания растворов через слой из пористого материала весьма эффективно. а подобранные режимы и размеры смесителя, а также размещение слоя из пористого материала в виде перегородки, разделяющей камеру смесителя и рабочий объем реактора, позволило сократить время транспортировки смеси и обеспечить ее быструю подачу на нуклеотидный компонент для конденсации.

Как видно из табл. 1, при задер>кке подачи смеси более 1,0 с эффективность синтеза падает. Время 0,01 с определяет минимальное время, за которое происходит продавливание реагентов через пористый слой.

Рассмотрим требования, предьявляемые к отдельны л узлам устройства, способного реализовать предло>кенный способ.

Чтобы осуществить быстрое смешивание мономера и дегидратирующего агента и подачу смеси в реактор, необходимы определенные соотношения ле>кду характеристиками отдельных узлов синтезатора, в частности, между обьемом смесителя Ч„, и объемо л реагентов, необходимых для проведения процесса конденсации в реакторе

Чконд.

Обозначим через Vo- обьем смеси активированного мономера, подаваемого а реактор непрерывно в течение 1 с, Тогда

1773916 время подачи т 1мп,реагентов обьемом Чкояд будет

1/конд. имп. =Vo

При заданном времени смешивания

tcu.: /конд. тимп. — тсм. ч (2) так как через смеситель должен пройти весь объем Ч <д.

Сравнивая (1) и (2); находим:

15 (3) VcM = tcM Vo для tc <. - (0,01-1,0) c; VcM = (0,01-1,0)V .

Это соотношение определяет конструк- 20 ционные особенности смесителя предложенного устройства. Так, для режима подачи реагентов Vo = 20-50 мкл/с для режима смешивания tc><, = 0,1 с объем смесителя должен быть 2-5 мкл. Такой объем, смесителя удалось Лолучить, разъединив общие участки каналов подачи основных и вспомогательных реактивов.

Устройство для реализации предложенного способа> представленное на чертеже, 30 состоит из нескольких основных частей: блока размещения и подачи основных реактивов 1, блока размещения и подачи вспомогательных реактивов 2, смесителя 3, . реактора 4, блока 5 нагрева и поддержания заданной температуры реактивов, блока управления 6, Блоки 1 и 2 включают в свой состав системы 7 продавливания растворов, сосуды для растворов 8, запорные клапаны

9, трубопроводы 10. В рабочем объеме 13 проточного реактора 4 размещен носитель с закрепленным на нем нуклеотидом 14, а на выходе реактора — фильтр 15 и клапан 16.

В качестве блока управления 6 могут быть использованы мини-ЭВМ или пер- 45 сональные компьютеры и выходные усилители, связанные с соответствующими. приводами. Клапаны могут быть различными по конструкции. Обычно используют электромагнитные клапаны, предназначен- 50 ные для работы с агрессивными жидкостями. Входы клапанов 9 соединены с выходами сосудов 8, входы которых подсоединены к системе продавливания pacTQQ ров 7, Система 7 включает в себя баллон с инертным газом, наприл1ер гелием, поддавлением, редуктор, клапаны и трубопроводы, позволяющие создать необходимое избыточное давление в полостях сосудов 8, Смеситель 3 имеет полость 11, к которой подведены трубопроводы 10 блоков 1 и 2. Каждый иэ входов трубопроводов 10 подключен к соответствующим выходам клапанов 9.

На выходе смесителя размещен слой из нейтрального пористого материала 12, выполненный в виде перегородки, перекрывающей входное отверстие реактора 4. Размеры полости и проницаемость пористой перегородки выбирают иэ условия, чтобы время контакта смешиваемых компонентов при заданном режиме поступления реагентов в смеситель не превышало 1 с до подачи смеси в рабочий объем реактора. В то же время эффективного смешивания эа время менее 0,01 с не происходит. Поэтому весь объем реагентов, попавших в смеситель, должен быть вытеснен s реактор за время

tcp. = (0,01-1,0) с.

Реактор выполнен в виде цилиндра или воронки, открытые концы которых являются входом и выходом реактора, Корпус реактора выполнен иэ химически стойкого материала: металла, стекла и т,п. Выходное отверстие реактора перекрыто фильтром, удерживающим твердофазный носитель 14 и пропускающим растворы реагентов, Полость реактора 13 заполнена твердофаэным носителем 14, в качестве которого могут быть использованы макропористый селикагель, пористое стекло, и т.п.

Перед началом синтеза эаполняютсосуды 8 соответствующими растворал1и реагентов, задают рабочее давление в этих сосудах, вводят в память блока управления б программу, определяющую последовательность проведения операций.

Сигнал управления сначала подается на привод клапана 9 в блоке 2, который. открываясь, обеспечивает подачу детритилирующего раствора, например, хлористого метилена стрифторуксусной кислотой из сосуда блока 2 через смеситель 3 в полость 13 реактора 4 для промывки твердофазного носителя 14 в течение 2-30 с. После промывки клапан, регулирующий подачу детритилирующего раствора, закрыва от и открывают клапан, обеспечивающий подачу другого растворителя из блока 2 — абсолютного, например, ацетонитрила или хлористого метилена, которым промывают твердофазный носитель от детритилирующего раствора, Одновременно происходит промывка смесителя, Затем этот клапан также закрывают и открывают одновременно два клапана 9 в блоке 1, В зависимости от заданной структуры полинуклеотида в процессе синтеза открывают соответствующую пару, например, клапан для подачи 5 -0-диметокситритил-6-бензоил-3 -H-фосфоната-2-дезоксиаде1773916

15

30

40

55 нозина и клапан для подачи раствора дегидратирующего реа гента хло ран гидрида. Растворы реагентов поступают в камеру смесителя, где происходит их предварительное смешивание, Из-за малого време- 5 ни перемешивания растворы смешиваются неравномерно. Равномерная смесь, обеспечивающая эффективность использования реагентов, образуется на слое из пористого нейтрального материала. Проходя через поры этого слоя, смесь реагентов поступает в полость реактора 13 до заполнения рабочего объема, в котором размещен носитель 14, после чего клапаны закрывают. Выходным клапаном 16 регулируют время нахождения растворов и слива их из рабочего обьема реактора 13, Эти операции повторяют заданное число раз. Затем по сигналу с блока .управления открывается клапан блока 2, обеспечивающий подачу кэпирующего раствора, например, с изопропилфосфитом, которьил обрабатывают полость реактора с носителем. После закрытия этого клапана аналогичным образом смеситель 3 и рабочий объем реактора 13 промывают абсолют- 25 ным растворителем.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1, Синтез 60-членного полинуклеотида следующего состав . (ОАТССАОТАССТСССТТТСГЯСДСОСААСА

СТСТСТТТСССССАОАТСССТТСТСОАТСА).

Для синтеза применяли установку, изготовленную в соответствии с чертежом. Реактор был выполнен в виде воронки, В качестве твердофазного носителя использовали CPC-1350 (фирма Serva, ФРГ) с емкостью нуклеозида 10 мкмоль/г. Объем реактора 5 мкл. Пористая перегородка меж- ду камерой смесителя и реактором была выполнена из двух сеток, между .которыми находились частицы фторопласта. Режим срабатывания электромагнитных клапанов задавали с помощью ЭВМ Электроника-60.

Перед началом синтеза заполняли сосуды необходимыми реагентами, Блок термоста- 4 тирования обеспечивал температуру реагентов на всех стадиях синтеза с точностью (1-2) С.

Детритилирование проводили раствором 1%-ной трифторуксусной кислоты в дихлорметане, Промывку проводили ацетонитрилом.

Ввод растворов мономера и конденсирующего агента и реакция конденсации:

t смешивали 0,01-0,03 М нуклеозид-3-Н-фосфонат и 0,01-0,03 M пивалоилхлорид в смеси ацетонитрилпиридин, Подачу проводили импульсами при одновременном открывании клапанов, управляющих подачей растворов мономеров и конденсирующего агента. Таких чередующихся импульсов и пауз было 5. Время импульса 0,1 с, пауза между импульсами — 2 с. Общее время реакции конденсации 10,5 с. Время конденсации определялось суммой времен импульсов и пауз между ними, Затем промывали систему ацетонитрилом.

Таким образом, общее время цикла синтеза составило 16,5 с, а средний выход на стадию присоединения одного мономерного звена (определяли по поглощению диметокситритильного катиона при rl, = 400 HM)

99%.

Необходимо отметить, что задание одинакового температурного режима при быстром синтезе на всех его стадиях имеет важное значение, Это связано с тем, что при малых временах конденсации поступающие в реактор порции смеси не успевают прогреться и охлаждают носитель, что ухудшает эффективность. синтеза. Поэтому нами было применено термостатирование емкостей с реагентами и всех узлов, через которые эти . реагенты проходят.

Все операции проводили при термостатировании используемых растворов и реактора (40 С).

В таком режиме были проведены последующие 59 циклов синтеза.

Окисление проводили в течение 5 мкл смеси, полученной при смешивании насыщенного раствора йода в ледяной уксусной кислоте и пиридине (в соотношении 1:1), затем промывали 200 мкл пиридина.

Снятие полинуклеотида с твердого носителя. После окисления реактор промывали 25%-ным водным раствором аммиака (1 мл) в течение 30 мин. Собранный раствор выдерживали 1 ч при 100 С и выделяли полинуклеотид известными способами: высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке с обращенной фазой или электрофорезом в денатурирующем полиакриламидом геле.

Выход 60-членного полинуклеотида—

1.2 О.Е.мво (2 наномоля). При этом расход реагентов и растворителей сократился более чем в 10 раз, по сравнению с известным решением.

В таблице приведены примеры для различных значений основных параметров синтеза олиго(поли)нуклеотидов на присоединение одного мономерного звена. условия проведения синтеза такие же, как в примере 1, Как видно из таблицы, увеличение времени конденсации более 2,5 с и увеличение количества циклов более 20 не повышает эффективность, но удлиняет время синтеза

1773916

10 и тем самым снижает производительность способа и устройства.

В синтезаторе-прототипе время одного цикла существенно больше, чем в предложенном решении (240 и 15-30 с соответственно), что при синтезе многочленного полинуклеотида дает значительный выигрыш в производительности.

Экономия реагентов и растворителей при применении предложенного способа и устройства возникает из-за быстрого смешивания в компактно выполненной системе смешивания и подачи реагентов малыми порциями.

Формула изобретения

1. Способ синтеза олиго(поли)нуклеотидов на, твердофазном диспергированном носителе, вкл|очающий промывку носителя с закрепленным на нем нуклеозидом, смеI l шивание 5 -.0-защищенного 3 -Н-фосфоната нуклеотидного компонента с дегидратирующим агентом, конденсацию с 5-OH-группой нуклеоэидного компонента, закрепленного

I на носителе, последующее удаление 5 -0-защитной группы, повторение этих операций до получения олиго(поли)нуклеотида с нужным числом мономерных звеньев. окисление олигЬ(поли)нуклеотид-Н-фосфоната, отщепление олиго(поли)нуклеотида от носителя, о т л и ч а ю щ и и сятем,,что,,с целью повышения производительности способа путем сокращения времени синтеза и экономии используемых реагентов, в качестве дегидратирующего агента используют хлорангидриды кислот в соотношении 0,9-1,5! эквивалента на " эквивалент нуклеозид-3-Н-фосфоната, их смешивание и подачу на носитель проводят за время ted< =- (0,01-1,0) с, а конденсацию — за время t«

5 с, причем эти операции повторяют 2-20 раз при температуре реагентов на всех стадиях синтеза Т = (30-65) С.

2. Устройство для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, содержащее реактор про10 точного типа, в рабочем объеме которого размещен носитель, связанный с нуклеозидным компонентом, блок размещения и подачи вспомогательных реактивов, блок управления, смеситель, вход которого сое15 динен с выходом блока размещения и подачи основных реактивов, а выход смесителя соединен с входом реактора, запорный клапан, соединенный с выходом реактора, о тл и ч а ю щ е е с я TGM, что, с целью повыше20 ния производительности путем сокращения времени синтеза и экономии используемых реагентов, оно дополнительно содержит блок нагрева и поддержания заданной температуры растворов реагентов на всех ста25 диях синтеза, смеситель состоит из камеры на входе и пористой перегородки из нейтрального материала, которая расположена непосредственно на входе реактора, причем размеры смесителя соответствуютусло30 еи ю V@M = (00110) Vo, где V

177391б

tt л/и

Время сметя>вания с»> >с

Время конОтновение конденсирукщего реагента к мономеру

Колииество

Температура синтеза, С

Эффективность син теаа, денсации с"> >с циклов

Составитель Ю.Средин

Техред M.Mîðãåíòàë

Редактор

Корректор С.Пекарь

Заказ 3907 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент™, г. Ужгород. ул,Гагарина, 101

0>1

2 Îit

3 0>1

4 0,1

5 0>1

6 0,1

7 0,1

6 0,1

9 0,1

10 0,1

11 0,1

12 0>01

13 0,05

14 0>1

15 0,5

16 1,5

17 2,0

16 3,0

19 01

20 0,1

21 0,1

22 01

23 О,t

24 0,1

25 0,1

26 0>1

27 О,t

28. 0,1

29 О, l

0,8

0i9

1,0

1,5

2,0

1>0

1,0

liO

1,0

1,0

tiO

1 0

1,0

1,С

1,0

1,0

l>O

1,0 .

li0

1,0

1,0

1,0

l>0

1i0

1,0

1,0

1,0

l>0

1,0

5О

2

2

2

2

2

2

2

2.

2

2

2

2

0,5

0,3

2,5

7

7

7

7

7

7

7

7

7

1

5

7

7

98

99

99

86

96

98.

98 о6

98

99

99

99

8S

99