Способ получения эритроцитарного диагностикума

Способ получения эритроцитарного диагностикума

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: медицина для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения. Цель изобретения - повышение чувствительности диагностикума. Сущность изобретения, проводят сенсибилизацию формализированных отмытых эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде HBSAg или антителами гепатита В в присутствии коньюгирующего агента в виде хлорида хрома, затем отмывают сенсибилизированные эритроциты физиологическим раствором, добавляют защитную среду до получения 5% всвеси эритроцитов и лиофилизуют. Сенсибилизацию проводят при 54-57°С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава , мас.%: 0,3%-ный р-р СиЗОз 0,25-0,35; 0,2%-ный р-р К2СГ20 0,15-0,25; 0,1%-ный р-р СгС1з 0,07-0,15; вода дистиллированная остальное. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 А 61 К 47/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4928119/14 (22) 25.02 91 (46) 07.11,92. Бюл. N 41 (71) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения УЗССР (72) Г.Н.Хорват и А.А.Арзанов (73) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения УЗССР (56) Регламент производства иммунодиальостикума на HB анаренэритроцетарного иммуноглобулинового сухого. Н, 280-82, утвержден 08.04.82. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА (57) Использование: медицина для получения эритроцитарных диагностикумов разИзобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для определения антител K австралийскому антигену в реакции пассивной гемагглютинации путем сенсибилизации отмытых эритроцитов О/1/ группы крови австралийским антигеном в присутствии хлорида хрома с последующим отмыванием сенсибилизированных эритроцитов в физиологическом растворе. при этом эритроциты сенсибилизируют антигеном в концентрации 40 — 60 мкГ/мл суспензии эритроцитов в присутствии 0,07...0,13%-ного раствора хлорида хрома и после отмывания через 3 — 6 ч сенсибилизированные.. Ы 1774872 АЗ личного назначения, Цель изобретения — повышение чувствительности диагностикума.

Сущность изобретения: проводят сенсибилизацию формализированных отмытых эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде HBSAg или антителами гепатита

В в присутствии коньюгирующего агента в виде хлорида хрома, затем отмывают сенсибилизированные эритроциты физиологическим раствором, добавляют защитную среду до получения 5% взвеси эритроцитов и лиофилизуют. Сенсибилизацию проводят при 54-57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас.%: 0,3%-ный р-р CuS04 0,25 — 0,35;

0,2%-ный р-р К2СГ207 0,15 — 0,25; 0.1%-ный р-р CrCb 0,07 — 0,15; вода дистиллированная остальное. 1 табл, эритроциты обрабатывают 0,5...0,8%-ным раствором формалина при соотношении формалина и сенсибилизированных эритроцитов (0,24 — 0,28):1 (см. а.с. СССР N 715088, 1980).

Достигнутый в известном способе уровень чувствительности обнаружения антител у 89...90% больных сывороточным гепатитом не может быть признан достаточным при обследовании доноров крови, и не удовлетворяет практическое здравоохранение.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для определения антигена гепатита В, включающий сенсибилизацию 50%-ных формализированных эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде, 8\/) с иммуноглобулином

1774872 — 0,25...0,35 — 0,15...0,25

0,07...0,15

0,47....0,75

50 в присутствии конъюгирующего агента в виде 0,3%-ного о-ра хлорида хрома (СгС!з) при гемпературе 37...45 С в течение 30 мин с последующим отмыванием от несвязавшегося белка и хлорида хрома физиологическим раствором, добавлением защитной среды, состоящей из бычьего альбумина, буры, сахарозы и борной кислоты на дистиллированной воде, до образования 5% концентрации взвеси и, при необходимости, лиофильной сушкой (Регламент производства иммунодиагностикума на

НВз-антиген эритроцитарного иммуноглобулинового сухого" N 280-82, утвержденного начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Минздрава СССР от 08.04.82).

Известный способ выбран авторами за прототип.

Имея широкое применение в отечественной медицинской поактике, известный способ не лишен недостатков, основными из которых являются следующие: — уровень чувствительности недостаточно высок (10...20 НГ) по сравнению с радиоиммунным методом, разрешающая способность которого составляет 1„.5 НГ; — повышенный расход дефицитного белка в связи с необходимостью использования глобулиновой фракции с титрам

1/128-1/256.

Целью изобретения является повышение чувствительности диагностикума.

Г)оставленная цель достигается тем, чт в известном способе получения эритроцитарного диагностикума, включающего сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии коньюгирующего агента с псследующим их отмыванием, добавление защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5% и лиофилизацию, сенсибилизацию проводят при 54—

57ОС, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас,%:

0,3% ный p-p CUSO4

0,2 jp-ный р-р K2CI207

0,1%-ный р-р СгС!з

Вода дистиллированная остальное

Температурный интервал, использованный в заявляемом способе, отличается более высокими значениями по сравнению с известными и активно интенсифицирует процесс сенсибилизации, при этом верхнее значение интервала (57 С) является предельным, так как его превышение вызывает распад белка, В то же время использование в качестве коньюгирующего агента смеси

CuS04, К2Сг20т, СгС!з не только усиливает связывающие (дубильные) свойства агента. но и предупреждает шлакообразование, снижающее частоту диагностикума и, следовательно, чувствительность его как при определении антигена, так и антител, Оптимальность состава смеси:

0,3%-ный р-р CuSO< 0,25...0,35

0,2%-ный р-р К Сг 07 0,15...0,25

0,1%-ный р-р СгС!з 0,07.„0,15

Вода дистиллированная остальное доказана экспериментально в процессе многочисленных исследований влияния каждого из ингредиентов смеси в различной концентрации в индивидуальном и совместных влияниях на связующую способность суспензий эритроцитов различного происхождения и концентрации. Суммарное действие отличительных признаков предложенного способа реализует в диагностикуме новый уровень чувствительности, сопоставимый с радиоиммунным методом.

Пример 1. К трижды отмытым в физиологическом растворе для удаления формалина 50% эритроцитам в объеме 0,5 мл добавляют восемь объемов дистиллированной воды (РН=2,0 — 2,5) и осуществляют сенсибилизацию добавлением одного объема риванольной гаммы с титром 1/16 — 1/32 и одного объема конъюгирующего агента в виде смеси следующего состава, мас,%:

0,3%-ный р-р CuS04 0,25

0,2%-ный р-р К Сг 07 0,25

0,1%-ный р-р СгС!д 0,15

Инкубацию осуществляют в термостате при 56 С. Время сенсибилизации 25 мин, После завершения сенсибилизации полученную смесь трижды отмывают физиологическим раствором от несвязавшихся белков и ингредиентов связующего агента, а затем добавляют известную "-ащитную среду до 5% взвеси эритроцитов и подвергают лиофильной сушке, Полученный диагностикум используют следующим образом: готовят физиологический раствор с концентрацией эритроцитов

2,5% и полученныйтестдобавляютк пробам крови доноров в следующей последоцательности: — в лунки иммунологического планшета вносят 25 мкл исследуемой сыворотки крови донора, предварительно разведенной 1:8; — в лунки планшета, заполненные разведенной сывороткой, добавляют 25 мкл теста (отмытых эритроцитов); — продолжительность реакции — 25 мин, При образовании в лунках видимого осадка в форме зонтика результат считается

1774872 положительным. Процент выявления

H BsAg среди обследованных доноров составил 7 — 8%, Пороговая чувствительность диагнбстикума, откалиброванная по параллельно по- 5 ставленным опытам с использованием радиоиммунного метода составила 1,0 — 0,5

НГ антигена, Результаты апробации приведены в таблице.

Пример 2, К эритроцитам, приготов- 10 ленным аналогично примеру 1, добавляют очищенный HBsAg в концентрации 0,1-0,2 мгl мл и сенсибилизацию осуществляют при температурном режиме и в присутствии конъюгирующего агента аналогичным при- 15 веденнным в примере 1. Время сенсибилизации 30 мин. После завершения сенсибилизации эритроциты обрабатываются аналогично примеру 1. Использование полученного диагностикума аналогично 20 примеру 1.

Пороговая чувствительность полученного диагностикума соответствует 0,5 — 0,25

МЕ. Частота выявления антител больных гепатитом В достигает 96 %, а у обследован- 25 ных доноров 27„.39, Результаты апробации приведены в таблице.

Анализ результатов, приведенных в таблице, свидетельствует о следующем: — чувствительность диагностикума, пол- 30 ученного предложенным способом, как на

HBsAg, так и на антитела, соизмерима с чувствительностью радиоиммун ного метода и превышает известные в 10...20 раз; — предложенный способ отличается ста- 35 бильностью и высокой степенью оптимизации параметров, — так снижение нижних пределов температурного интервала и PH раствора относительно оптимальных показателей указанных величин приводит к 40 спонтанной агглютинации, в то время как повышение верхних пределов тех же параметров относительно оптимальных показателей — к потере чувствительности, а при доведении PH раствора до 7,0 (аналогично прототипу) чувствительность диагностикума снижается до величины известного способа 10...20 ME (строка 3.2.6 таблицы); — повышение степени выявления

HBsAg и антител при массовых обследованиях доноров полученным в предложенном способе диагностикумом на 4...5 % наиболее социально необходимо и экономически целесообразно, так как предупреждает имеющие место в медицинской практике случаи сывороточного гепатита с одной стороны, и, с другой стороны, позволяет выявить заболевание на ранней стадии его; — предложенный способ гарантирует полученному диагностикуму повышенный (в

2 раза) относительно известного срок хранения и частичную экономию дефицитного белка, Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного диагностикума, включающий сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии коньюгирующего агента с последующим их отливанием, добавлением защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5 и лиофилизацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительностии диагностикума, сенсибилизацию проводят при 54 — 57 С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас. g,: 0,3 -ный раствор

CuSOa — 0,25 — 0,35; 0,2%-ный раствор

К Сг207 — 0,15 — 0,25; 0,1 g,-ный раствор

CrCia — 0,07 — 0,15; вода до 100.

1774872

I

I

1 0

I С

1 R

6 д 3 с а с

z с

C уу

Е I

Л В

z C (v e

z Й

00 ле е л

Yeech

8z е». оод

5 а с а и

t4

6 л С

lO X х е

С С С есис

Ы Е 9 Се

895У с с с

95ее са а

1 I

t4 Z

Ф 6

1 1

1 1 °

4 I 1

-0 (Ч Ф б 6 °

1 Ф (ч

l l

I I м ю

1 I I

6 б 1

I (Ч 1

I 1 1

ЧФ 1 I 1 I

I I

I Z

1 1

1 Ф

I 1

1 Z I

Ф Z I

3 Э 1 (9

tt I с

Ф е 1

3 1 т 3

1 1

I 3сд

1 z

I Ю 3

1 0 I

6 f 3

1 1

1 З 1

1 0 ю»

1 д 1

С 1

1 Л 1

I 63 1

I 0 1

1 а 1

1 3

I б

Ф

LAsO CX Я С

CO ЮЧ LA ло л

1 ° 1 о о о лоо ъа (ЭЪ

6 (Ч

1 6 1 О\! ! 6 1 1 1 1

3 IO

3 9

О 1

St e

9 I 63 5 и

Л

l! I Z б ю а

u1 о

0 1 Ф

Л 1 С а

*ю

I IO

° 6 Ll(1 бч О

93 O(es(A t

1 1 1 1 сд лО 44

I 1 6 I

IA (Ъ

t»

° Ч юч

I а ь (ч

° I

Р(а

1 1 1 3 I

1 I 1 ао с

6 9(Л сб I t4

О 1 о -а

° 4 tAC4 оао к е (Ч ° Ъ 3

z и(а(ч 9 ао S

VL

С3

С

L е

1 I 1 1

В 1 В (Ч

Сб

LA

Cl (чма

ООО 6.

1 1 1 аао е оо с и! 1 1 1 I

3 1 I

«It(1 або (\

X д (ъ дд 4

1 - CLtv

1 S 3

cs acs

t (ALA сю о (ч

О ОООО

t» IA IA о оюч оооо

ОО l

С3 о о д л х о

1 б (ч

1 46 3

I ts aCt

LA LA (Ч «(4 Р \ о оооо аа (ч м оооо (Ч ФЧ

О!О

t4 (Ч

О!О

l3.

I (ф дд

l м аМ о асб

lA LA

Ъ (Ч (At(4t о оооо аа (Ч МРЮ Э сэ о о сэ (ъм

ОО мм

ОО (Ъ

I

1 0 а

1 Cl с ф х

3 0 Я! 8) 1

I (4

О

I о а (ч

° (Ъ 3

»

I! I I

I 1 I

1 I I

1 3

t 1 1

1 1! 6 1 ! 1 1

I e

Д Я л с

0 (Я е и а х

I e 0

С и

3 I и и

I и Ф а z

0 а

3I Ы

I e e

a Y

I fO 1

3(3.

lA (ч

Cl (Ч б ч\ м л о

I I б

3 t 1

3 Ф

1 I I б ° 1

1 1

1 1 I 1

Ъ

1 1 1

I л а

3 I 1

1 I 1

1 В

3 1 1! 6 1 1

В I I В

1 I 1

1 В °

° 1 1 °

lA (Ч 1

LA (Ч

1 1 б ! 1 I

1 I I

1 1 1

I i 1

I 3 I

6 I 1

V о

lA 1

1 1 3

1 Ф I

1 1

1 1 б

Э 1

I 1 В

I б I

1 1 6

3 з

I Z

Z 6e z (с е

Z 0

Л L аа 4

C CC ай z ао с

6l C Z лvc.

I Y

e g (ч (Я с асМ (tl L с е

ЛС

Ы Л с» z

1 ф Л

1 1 l I I

0 В 6 9 1

I 0 X б Л О X 1

Yet- (vzuz 1 аасбs.V 0с 9И

t Y 93 F Р*

9ZC l XZVЗ

9ze (o„z

L3ZY l ЕСЧС I — -4 ааб 00

9 3

Чб ЕЕРР ею

1 Ф !

Cl ZZ 1

Zl 00 1

et gxx

С (. I 1

O (-(— "- — 3

1 с з I

1 Я X

X 1 Ф 1

3 Лййй !

3 — — 4

1 1

1 1 Ь вЂ” 3

et 07

OI 6ЛС

Z Z XL

Yt 90021 л

3- — — — (I

3

I

I

6 !

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Ф

I

I б

I !

I

4

1

1

I

6

1

1 (1

I

1

1

1 C

Ф е

1 а !

I X а

6 IO

r (z

1

1 ! дд ю о

s to

I Я

1 Z

1

1 ф

6 (O

Л ю ч

В

1 Ol

13

В 36

t l ч

I

1 дд

1 V б

1

v

l и

1 Е

3 Е

3и ,s

I

1