Способ получения полипептида со свойствами гирудина и штаммы дрожжей sасснаrомyсеs cerevisiae, экспрессирующие предшественник гирудина

Патент 1774950

Авторы

Классы МПК

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к генной инженерии , в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина и к штаммам Saccharomyces cerevisiae. экспрессирующим предшественник гирудина. Сущность изобретения: способ получения полипептида со свойствами гирудина состоит в том, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTG1818 или pTG886, трансформируют полученными плазмидами штамм дрожжей S,cerevisiae TGYIsp4, очищенный белок активируют обработкой 1 мл раствора цианбромида с 30 мг/мл в 70%- ной муравьиной кислоте. Получены штаммы a) Saccaromyces cerevisiae штамм TGYIsp4 (Mat L ura 3-251-383-328-hls-3-11-15), трансформированный плазмидой pTG1818, депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов при Институте Пастера под № 1-441); б) S.cerevisiae штамм TGYIsp4 (Mat L ura 3-251-373-hls-3-11-15), трансформированный плазмидой pTG886, депонирован под номером 1-442. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 2 табл. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ социАлистичЕских

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1 (21) 4028760/13 (86) РС Г/FR 86/ 00153(02.05,86) (22) 30.12.86 (31) 8506672 (32) 02.05.85 (ЗЗ) ЕЯ (46) 07.11.92. Бюл. ¹ 41 (71) Трансжен С.А. (FR) (72) Жерар Луазон (FR), Поль Толстошев(AV), Ив Лемуань (FR) и Жан-Пьер Лекок (BE) (56) 1.FR, № 8404755, С 12 N 15/00, 1985, 2.Markwardt et al. 1967, I-! орре Seylerlsz, Physlol Chem, 348, рр.1381-1388. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ГИРУДИНА И

ШТАММЫ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES

CEREVISlAE, ЭКСПРЕССИРУ10ЩИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИК ГИРУДИНА (57) Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способу получения полИзобретение относится к генной инженерии, в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина и к штаммам Saccharomyces cerevlslae, экспрессирующим предшественник гирудина.

Известно, что слюнные железы медицинских пиявок содержат полипептид, называемый гирудином, который является специфичным и эффективным ингибитором тромбина. Однако проблемы, связанные с выделением и очисткой гирудина, ограничивают его широкое применение в медицине, Известно получение гирудина клонированием натурального гена пиявки, кодирую„„Я „„177495О А3 ипептида со свойствами гирудина и к штаммам Saccharomyces cerevlsiae. зкспрессирующим предшественник гирудина. Сущность изобретения: способ получения полипептида со свойствами гирудина состоит в том, что конструируют рекдмбинантные плазмидные ДНК pTG1818 или pTG886, трансформируют полученными плазмидами штамм дрожжей S,cerevisiae TGYlsp4, очищенный белок активируют обработкой 1 мл раствора цианбромида с 30 мгlмл в 707;ной муравьиной кислоте. Получены штаммы а) Saccaromyces cerevisiae штамм TGYlsp4 (Mat (ura 3-251-383-328-his-3-11-15), трансформированный плазмидой pTG1818, депонирован s Национальной коллекции культур микроорганизмов при Институте Пастера под № 1-441); б) S.cerevisiae штамм TGYisp4 (Mat L ura 3-251-373-his-3-11-15), трансформированный плазмидой pTG886, депонирован под номером 1-442. 2 с. и l з.п.ф-лы, 2 табл. щего гирудин, известна и экспрессия гирудина в микроорганизме Е.coli (1j, Однако использование гирудина, полученного из кишечной палочки, требует устранения пирогенных примесей и связано с проблемой очистки гирудина, используемого в клиниках.

Кроме того, гирудин, синтезированный через E.coll, остается внутриклеточным и должен, следовательно, очищаться, исходя из очень большого количества пептидов

Е.coll. По этим причинам представляет интерес экспрессия гена гирудина в дрожжах, которые не продуцируют пирогенных веществ или веществ, токсичных дл ч человека, 5

FR ura 3 (Ми A, ura 3-251, 373, 328) и GRF 18 (Mat, Ыз 3 11-15 Ieu 2, 3-112).

Введение плазмид, с одной стороны, привбдит к штамму фенотипа ura", а, с дру- 55 гой стороны. обеспечивает экспрессию предшественника гирудина. условия хранения.

Полная стандартная среда (УРС), содержащая 20% глицерина (1//V), Консервация в и которые способны выделять протеины в питательную. среду.

Известен также способ очистки или экстракции природного гирудина, полученного из пиявок (2).

Недостаток способа вЂ” необходимость осуществления стадий очистки или экстракции, что делает способ экономически невыгодным.

Цель изобретения вЂ” упрощение способа, Способ основан на методах генной инженерии с получением рекомбинантного гирудина с использованием других типов микроорганизмов, отличающихся от Е,coil.

Изобретение относится к штаммам дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM l-441 и CNCM-442, экспрессирующих предшественник гирудина. Изобретение относится также к способу получения полипептида со свойствами гирудина, заключающемуся в том. что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTG 1818 или pTG 886, трансформируют полученными плазмидами штамм дрожжей

Saccharomyces сегеч!з!ав TGY! sp4, а очищенный белок активируют путем обработки

1 мл раствора цианбромида с 30 мг/мл в

?0%-ной муравьиной кислоте.

Используемые штаммы депонированы в

Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) при Институте Пастера (Франция) и и>леют следующее таксонометрическое описание:

a) TGYl sp4 PTG 1818: Sacchromyces

cerevls lae.

Штамм TGYI зр4 (Mat ura 3-251-383328-his-3-11-15), трансформированный в

ura плазмидой pTG 18 !8; депонирован под

N 1-441. б) TGY sp pTG 886: Saccaromyces сеген!з!ае.

Штамм TGY sp4 (Mat L vra 3-251-373-Ыз3-11-15), трансформированный в ura+ плаэмидой pTG 886; депонирован под N 1-442.

Исходный штамм TGYI зр4, который трансформируют рекомбинантными векторами, является штаммом, представляющим генотип; Мм, Ы з 3-11, I5, ura 3-251, 3 73, 328, что выражается фенотипом (Ыз), (Ura), Этот штамм получают скрещиванием штаммов А этой среде при -8 С. Состав среды дрожжевой экстракт Dlfco 1%, 2% глюкозы.

Среда культивирования вЂ” минимальная среда (отбор прототрофов по урацину), содержащая гистидин 40 мгl мл или смесь аминокислот (например, казаминокислоты

0,5%).

Состав минимальной среды (YNBG): стандартный Bacto Yeast Nitrogen Вазе (Difco) без аминокислот 6,7 г/л, глюкоза 10 г/л, температурные условия 28 С, Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Конструкция pTG 822.

Фрагмент кДНК гирудина HY-2 экстрагируют из геля после обработки плазмиды

pTG 717 с Pst 1, гидролизуют одновременно ферментами Hlnf I u Aha ill. Фермент Hinf I вырезает концевую часть первого кодона последовательности зрелого гирудина НУ2. Фермент Aha III вырезает приблизительно 30 пар концевых оснований (3 ) стоп-кодона последовательности гирудина.

Полученный таким путем фрагмент Н!п1

I Aha !!! выделяют на агарозном геле, затем элюируют из этого геля.

Последовательность, кодирующую зрелый протеин. вводят в вектор pTG 880, Вектор pTG 880 является производным вектора

pTG 838. Плазмида pTG 838 идентична pTG

833, за исключением того, что сайт Bgl !! расположен около стоп-кодон транскрипции PGK. Этот сайт удаляют воздействием полимеразы Кленова, чтобы получить pTG

838.

Плаэмида p TG 833 я вляется "челночной" плазмидой дрожжей вЂ” Е.со!!. Основные элементы этой плазмиды следующие: ген uRA3 как маркер отбора в дрожжах. источник репликации плазмиды Ри дрожжей, ген устойчивости. к ампициллину и источник репликации плазмиды pBR 322 Е.со!! (эти два последних элемента обеспечивают амплификацию и отбор этой плаэмиды в кишечных палочках), фланговый участок в 5 гена

PGK дрожжей с кодирующей- последовательность1о этого гена до сайта Sall, фрагмент Sail-Pvu il pBR 322 и стоп-кодон гена

PG K.

Плазмиду pTG 880 конструируют на основе pTG 838 введением короткого участка поликлинкера (происходящего от бактериофага M13) в pTG 838, вырезанного с помощьк> EcoRI и Bglil, что позволяет разместить ряд сайтов клонирования. в таком порядке: Bglll, Pst I, Hind ill, Barn ill, Sma и EcoRI, непосредственно после участка 5 гена PGK дро>к>кей. ДНК плазмиды

pTG 880 обрабатывают Bgll u Sma I, и большой фрагмент, образующийся от этого гид1774950

55 ролиза, выделяют и элюируют из геля. Фрагмент Hinfl-Aha Ilt pTG 717, который содержит основную часть кодирую щей последовательности гирудина НУ-2, смешивают с pTG 880, одновременно с 3 синтетическими нуклеотидами, предназначенными для воспроизведения ИН2 концевого участка последовательности гирудина, и которые связывают сайт Bglll вектора с сэйтом Hlnf ! фрагмента, содержащего гирудин. Эту смесь лигируют. Получают плазмиду pTG

882.

Эта плазмида служит для трансформации клеток дро>кжей с целью получения гирудина под контролем промотора РОК.

Однако не обнаружено никакой активности гирудина в сырых экстрактах клеток, трансформированных этим вектором, Причина отсутствия получения активного гирудина еще непонятна. Тем не менее конструкция

pTG 882 служит источником кодирующей последовательности гирудина.

Пример 2. Сначала фрагмент BglllEcoRI (230bp) в конструкции pTG 882, содержащий последовательность гирудина, переносят в бактериофаг M13m р8 между сайтами Вав Н и FcoRI, Это дает фаг M13TG

882, из которого можно выделить фрагмент

ECoRI- lindlll (приблизительно 245 вр), Этот фрагмент содержит целиком кодирующую последовательность гирудина НУ-2, причем участок слияния BamHI/Bglil и склеивающие концы (Hindlil-EcoRI) позволяет осуще cTBnsITb клонирование данного фрагмента в векторе pTG 881.

Плазмида pTG 881 (10 кб) является "челночной" плазмидой Е.coti (дрожжи, реплицирующие автономно одновременно в

Е.colt и штаммах Saccharomyces

cerevisiae, и varum и carlbergensis).

Введение этой плазмиды в Е,соИ позволяет получать устойчивость к ампициллину (и к другим антибиотикам типа > -лактама), Кроме того, этэ плазмида несет гены iEU2 и

URA3 дрожжей, которые экспрессируются в штаммах Е,coli u Saccharomyces

cerevtsiae.

Плазмиду pTG 881 конструируют следующим образом, Исходная плазмида представляет собой

pTG 848, она образована из следующих фрагментов ДНК:

1) Фрагмент EcoRt-Hindlll приблизительно 3,3 кб, происходит из плазмиды

plD В207. Сайт Hind ill соответствует положению 105 плазмиды 2и формы В), сайт

EcoRI вЂ” положению 2243. В этом фрагменте находится ген IEU2, включенный Pstt сайт фрагмента 2и формы P.

2) Фрагмент Htndll гена ЦВАЗ.

3) Большой фрагмент EcoRI (поло>кение

0j вЂ” ЯаИ (положение 650) pBR 322. В сэйт Pvu

II этого фрагмента встраивают фрагмент

ЕсоИ-Hlndlll (концы которого предварительно затупляют в присутствии фрагмента

Кленова и 4 нуклеотидов) и 510 пар оснований, соответствующих концу гена РОК. Затупленный Есой! конец гена PGI, соединенный с концом Pvu II pBR 322, восстанэвливает сайт EcoRI.

4) Фрагмент Hindlll-Sai i (2,15 кв) гена

PGK.

Плазмиду pTG 848 обрабатывают с помощью Hindtl и концы выделенных таким путем двух фрагментов затупляют с помощью фрагмента Кленова и 4 дезоксирибонуклеотидов. Два фрагмента сшивают и перед трансформацией подвергают эту сшитую смесь действию Hindi ll. Трансформируют штамм Е.coii BJ5183 (pyrF) и трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину и по пир-характеру, Таким путем получают плазмиду р TG874, где два сайта Hindi ll удалены.

Плазмиду pTG874 гидролизуют с помощью Smal и Sall, фрагмент 8,6 кб выделяют затем из геля агарозы. Плазмиду pTG864, которая включает EcoRI-Sall (приблизительно 1,4 кб) гена MFLI, клонированного в тех же сайтах pBR322, обрабатывают с помощью EcoRI. Затупленные концы плазмиды обрабатывают с помощью фрагмента Кленова в присутствии 4,нуклеотидов. Гидролиз осуществляют ферментом Sali и выделяют фрагмент

EcoRI-Sail, соответствующий гену MFLI.

Этот последний фрагмент лигируют с участком Smat-Sall (8,6 кб) pTG874, чтобы получить таким путем плазмиду pTG786.

Чтобы исключить сайт Bglil, смежный с, последовательностью промотора MFLI, осуществляют частичный гидролиз с помощью

Bglll плазмиды pTG876 с последующей обработкой фрагментом Кленова в присутствии дезоксирибонуклеотидов. Получают новую плазмиду pTG881.

Поскольку слияние с сайтом Hindllt чужеродной кодирующей ДНК позволяет осуществить трансляцию в той же фазе считывания, полученный гибридный протеин включает части пре-про-а-феромона.

Клонирование в pTG881 фрагмента

Hlndlti-EcoR1, который несет ген гирудинэ, приводит к плазмиде pTG886. При осуществлении однократного клонирования сайт

Bglll оказывается в нижней части фрагмента, что позволяет выделять фрагменты в форме Htnfl-Bgtlt, причем сэйт Hinfl такой же, как сайт, используемый выше. Посколь1774950

35 ку Bglll является единственным в PTG881, то очень легко воспроизвести конец 5 кодирующей последовательности гирудина, используя 3 олигонуклеотида, кодирующих последовательность 5 гирудина и обеспечивающих считывание последовательности пре-про- а -феромона, сопровождаемой последовательностью зрелого гирудина, Эта новая плазмида называется рТО 897.

Пример 3. ДНК рТО897 служит для трансформации дрожжей TGYlsp4 (MatL, ura 3-251-373-328, his-11,-15) в ura+.

Трансформированную колонию реплицируют и используют для посева не менее

10 мл питательной среды и 0,5% казаминокислот. После 20 ч культивирования клетки подвергают центрифугированию, надосадочную часть подвергают диализу дистиллированной водой и концентрируют выпариванием (цен грифугирование в вакууме).

Параллельно обрабатывают таким же

"образом культуру PGYlsp4, трансформированную pTG886, и культуру TGYisp4, трансформированную плазмидой не несущей послецовательность гирудина (TGYlsp4

РТО856). Сухие остатки поглощают 50 мкл воды и 20 мкл кипятят в присутствии 2,8%

SDS и 100 ммоль меркаптоэтанола, затем помещают на гель акриламида вЂ” SDS (l5% акриламида, 0,1% SDS). После фиксации и окрашивания синим Coomassie обнаруживают полипептиды, которые накапливаются в держащихся на поверхности культурах ! ОУ!зр4/pTG886 и TGYlsp4/pTGH =7 л которые отсутствуют в контрольной культуре, Кроме того, эти ряды дополнительных пептидов мечены цистеином S, как это следо35 вала ожидать для пептидов гирудина, поскольку эта молекула очень богата цистеином.

Электрофорез осуществляют следующим образом, Экстракты готовят следующим обра30M: l0 мл среды (минимально) (Yeast

nitrogen Вазе Difco без аминокислоты 6,7 г/л, глюкозы 10 г/л, к которой добавляют

0,5% казаминокислоты), засевают различными штаммами и культивируют в течение

20 ч (стационарная фаза). Клетки центрифу- ги руют, надосадочную часть подвергают диалиэу относительно воды (минимум удержания: M,Â. 1000), сушат центрлфугированием в вакууме. Затем образцы поме- щают в 50 мкл буферного раствора, из которых?О мкл обрабатывают, как описано выше, и помещают на гель акриламид вЂ” SDS (15% акриламида, 0,1% SDS), Используют следующие штаммы:

TGYlsp4, трансформированный плазмидой, не содержащей последовательности гирудина (контрольные), ТОУ!зр4, трансформированный рТО886, TGYlsp4, трансформированный рТО 897, помещают маркировочные эталоны сверху вниз: 94 000, 67 000, 43 000, 30 000, 20 100, 14 000.

Полосы обнаруживают окрашиванием в голубой цвет Coomassie R-250.

Экстракты готовят следующим образом.

100 мл минимальной среды + гистидин 40 мкг/мл засевают различными штаммами для культивирования в течение ночи. Когда плотность клеток достигается приблизительно 5-10 (экспоненциальная фаза роста), 6 к каждой культуре добавляют 40 мкл цистеина "$ (9,8 мКи/мл; 1015 Ки/ммоль). Через

10 мин клетки центрифугируют, помещают в

10 мл полной среды (300C) и инкубируют при.

30 С при перемешивании, Через 3 ч 10 мл всплывающей над поверхностью части подвергаютдиализу водой и концентрируютдо объема 0,5 мл. Приблизительно 35 000 cpm (40 мкл) помещают на гель вЂ” акриламид-SDS (15% акриламида, 0,1% SDS). Полосы протеинов обнаруживают после флюорографии.

Используют штаммы:

TGYisp4, трансформированный плазмидой, не содержащей последовательности гирудина, TGYlsp4, трансформированный

pTG886, TGYlsp4, трансформированный р TG897.

Г!омещают маркировочные средства, молекулярный вес которых указан (x10 ).

Надосадочные слои, содержащие эти полипептиды, испытывают на их антитромбиновую активность, не обнаруживают ни какой активности.

Б случае полипептида, полученного с помощью ТОУ!sð4/ðÒÑ886, оказывается, что он подвергнется нормальным стадиям расщепления предшественника а -феромона, что дает удлиненную молекулу гирудина с 8 аминокислотами на его конце МН2. Следовательно, не удивительно, что полипептид, выделенный клетками ТСУ!зр4 pTG887, не активен.

Напротив, в случае полипептида, полученного с помощью ТОУ!зр4/pTG897, оказывается, что полипептид идентичен природному протеину, следовательно, активен; Несколько гипотез могут обьяснить отсутствие активности:

1) Созревание протеина неполное, могут остаться остатки Clu-А!а в NH2.

1774950

2) Протеин неактивен, так как он имеет не ту конформацию или же в находящемся на поверхности слое культуры имеются протеины или молекулы с молекулярным слоем

1 000, которые тормозят активность.

3) Протеин неполный, так как он был подвергнут внутриклеточному и/или внеклеточному протеолизу.

Пример 4. Если причина отсутствия активности связана с присутствием дополнительных аминокислот с ИН2 конца, то можно активизировать, подвергая пептид, выделенный TGYlsp4/pTG886, расщеплению цианбромидом. Этот реактив высоко специфичен к остаткам метионина, и сшитый протеин, кодированный с помощью рТ6887, содержит только один метионин.

Эту реакцию осуществляют следующим образом: дрожжи, содер>кащие плазмиду

pTG886 либо контрольную плазмиду, не содержащие вкл очения гирудина, культивируют в 10 мл среды в течение 24 ч. К этому моменту культура достигает плотности от 7 до 10 10 клеток.мл, Находящуюся на поверхности часть отделяют от клеток, подвергают интенсивному диализу дистиллированной водой, затем подвергают сублимационной сушке, Сухой порошок растворяют в 1 мл 70%-ной муравьиной кислоты и аликвотную часть используют для определения содержания всех протеинов (методом окрашивания в голубой цвет

Coomassie, с реактивами), остальную часть препарата обрабатывают 1 мл свежего раствора цианбромида с 30 мг/л s 70%-ной муравьиной кислоте.

После удаления кислорода продувкой азотом пробирки инкубируют в темноте в течение 4 ч при комнатной температуре. Все практические работы в присутствии цианбромида осуществляют с соответствующими предосторожностями и в вентилируемом вытяжном шкафу. Реакцию расщепления цианбромидом прекращают добавлением

10 объемов дистиллированной воды, затем раствор подвергают сублимационной сушке, °

Расщепленные, пептиды снова растворяют в 10 мл дистиллированной воды и под. вергают повторной сублимационной сушке два раза. Затем пептиды растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды и аликвотную часть используют для измерения антитромбиновой активности, Остальную часть образца подвергают сублимационной сушке и двум стадиям ренатурэции описанной ниже.

Так как активность гирудина зависит от присутствия дисульфидных мостиков в молекуле, кажется вероятным, что пептид, расщепленный цианбромидом, должен быть подвергнут ренатурации, чтобы иметь биологическую активность, Следовательно, расщепленные пептиды подвергают денатурированию в 5 М CuHCI с последующей ренатурацией.

Подвергнутые сублимационной сушке пептиды растворяют в 400 мкл 5 M гуанидингидрохлорида (CuHCI) в трис-HCI 250

10, ммоль, рН 9,0; затем готовят раствор 2 ммоль восстановленного глютатиона и 0,2 ммоль окисленного глютатиона, доводя обьем до 2,0 мл (конечная концентрация 1,0 М

CUHCI и 50 ммольтрис).

Через 16 «23" С в темноте образцы подвергают диализу в течение 24 ч три раза относительно 2 л трисHCl 50 ммоль, рН 7,5, NaCI 50 ммоль, при

23 С и конечный диализат осветляют центрифугированием.

Потом измеряют антитромбиновую активность находящихся на поверхности частей. Результат этого опыта, представленный в табл.1, ясно показывает получение анти25 тромбиновой активности в находящихся нэ поверхности клетках, трансформированных плазмидой рТ6886.

В итоге, клетки дро>к>кей, несущие рекомбинантную плазмиду, экспрессируют

30 пептид, имеющий биологическую активность гирудина, после реакции расщепления и ренатурации. Это доказывает, что присутствие дополнительных аминокислот с ИН2 конца достаточно для обьяснения от35 сутствия активности полипептидов, имеющихся в культурах Т6%эр4/рТ6886 и оно может быть также в случае культур

TGYlsp4/рТ6896 (хвосты Giu-Ala).

Пример 5. При использовании конст40 рукции pTG897сохраняется опасность, что выделенный пептид сохраняет хвосты GluAla в ИН2, что объясняет отсутствие антитромбиновой активности этого материала.

Если эта гипотеза соответствует действи45 тельности, дол>кна быть возможность восстановления активности непосредственно в поверхностном слое с образованием участка обрыва между остатками 61ц-Ala u первой аминокислотой гирудина HY-2

50 (изолейцин), Это осуществляют, добавляя кодирую. щую последовательность для дублета fays

Агд, который представляет участок узнавания эндопептидазы, вовлеченной в созрева55 ние предшественника феромона.

Конструкцию получают, как описано ранее.

Получающуюся плазмиду называют р TG805.

Плазмида служит для трансформации штам+ ма TGYlsp4 в ura . Вещество, находящееся на поверхностном слое, анализируют гель1774950

15- я

26-я у р, р,ф р,,у,! .,ц 7 Д. /1 7Я И Р/f 47 4 O дЩ та стет РтОтютт Юнтат стаЯсе тетст /4

40-"» й, Соответствующую плазмиду называют

pTQ818, и она отличается от PTG1805 только включением нуклеотидов 5 -TTC-GATAAA, соответствующих кодонам зеМео-Asp.

Активность, определенная в надосадочной жидкости культур ТОУ!зр4 PTG1818, по уже описанным стандартным условиям составляет приблизительно 20 ед. на 10 мл культуры, или приблизительно в 100 раэ выше активности, найденной в предыдущем примере. Следует отметить, что определение можно выполнять с 10 мкл неконцент-. рированной питательной среды.

Пример 7. В двух предыдущих примерах было показано, что присоединение нового участка hys-Arg непосредственно перед началом последовательности зрелого гирудина позволяет выделить активное вещество в надосадочной части. Однако в этих примерах, есл. обрыв. предшественника осуществляется в первом участке hys-Arg (отдаленном от центра по отношению к началу последовательности зрелого гирудина), можно получать в питательной среде более тяжелую неактивную примесь, соответствующую цепям гирудина, удлиненным на NHg-конце. Это особенно ясно в случае культур TGYlsp4 pTG1805, где неактивная примесь составляет большинство. Это относится также к культурам TGYlsp4 pTG1818, где неактивная примесь не составляет боль- 55 электрофорезом и сравнивают с веществом, полученным с TGYlsp4/pTG897.

Использованные штаммы;

TG Ylsp4, трансформированный рТО 897;

TGYlsp4, трансформированный . рТО805; контрольный, не производящий гирудина.

Специфические полипептиды штамма

TGYlsp4/рТО805 мигрируют более медленно, чем специфические полипептиды штам- ма TGYIsð4/ðÒG897. Этот результат подсказывает, что новый участок расщепле-, ния не эффективно используется эндопептидазой. Тем не менее, небольшая часть полученного в результате вещества активна в противоположность тому, что получают с культурами. TGYIsр4/рТО897, 5

10 !

Антитромбиновая активность находящихся на поверхности культур дрожжей (10, мл) приведена в табл.2, Пример 6. При использовании конструкции .(рТО897) получают только небольшую активность гирудина, очевидно, потому, что второй участок расщепления, предназначенный для выделения зрелого гирудина, мало эффективен. Создают новую конструкцию, предназначенную для того, чтобы сделать этот дополнительный участок расщепления более чувствительным к эндопептидазе, добавляя к нему впереди после-. довательность 3 аминокислот Ser-heu-Asp, которая присутствует выше hys-Arg.

Используют метод, описанный выше, эа исключением того, что относится к олигонуклеотидам, последовательности которых приведены ниже:

1 шинство, но может присутствовать. Чтобы избежать потери выхода в случае синтеза неактивного вещества, дают новую конст-. рукцию, приводящую к синтезу предшественника, который отличается от предшественника, синтезированного клетками TGYlsp4 рТО897, только отсутствием последовательности ОЬ Ala Glu А!а между участками обрыва hys-Arg и первой аминокислотной зрелой последовательности гирудина.

Формула изобретения

1.Способ получения полипептида со свойствами гирудина, предусматривающий выделение и очистку целевого продукта, о тличающийся тем,что,сцельюупрощения способа. конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК pTG1818 или pTG886,: трансформируют полученными плазмидами штамм дрожжей Saccharomyces сегеч!зlае

TGYlsp, а очищенный белок активируют путем обработки 1 мл раствора цианбромида с 30 мг/мл в 7070-ной муравьиной кислоте.

2.Штамм дрожжей Saccharomyces сегечlзlае CNCMY-441, экспрессирующий предшественник гирудина, З,Штамм дрожжей Saccharomyces

cerevlsIae CNCMY-442, экспрессирующий предшественник гирудина, 1774950

Таблица 1

Антитромбиновая активность в находящихся на поверхности культурах дрожжей

102,5

< 5,6

Таблиц а 2

Редактор

Заказ 3943 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета f10 изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Составитель Н.Кузенкова

Техред M. Mîðãåíòàë Корректор Н 5У«К пецифич активнос д/мл пер альных и инов