Способ получения 2 @ -дезоксинуклеозид-5 @ -0-/1- тио/трифосфатов

Способ получения 2 @ -дезоксинуклеозид-5 @ -0-/1- тио/трифосфатов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности, к получению -дезоксирибонуклеозид-5 -0-(1-тио)трифосфатов общей формулы 0е -Р(ОХОв)-0-Р-(ОХОе)-0Р (5ХОе)-0-СН2-СН-0-СНВ-СНг-СН(рН). где В-гуанин-9-или или цитозин-1-ил, используемых в генетической инженерии и молекулярной биологии. Цель - повышение выхода и упрощение процесса. Синтез ведут из 2- дезоксирибонуклеозидов обработкой их сначала тиохлорокисью фосфора в смеси триметили триэти л фосфате (1:1) в присутствии пиридина при 0-5°С (110-130 мин), затем пирофосфатом в виде раствора его три-н-бутил-аммониевой соли в безводном ацетонитриле (4-10 мин) и далее водой (20- 50 мин) (гидролиз). Выделение целевых веществ ведут на ионообменных колонках. Эти условия позволяют увеличить выход целевых веществ до 85-90% при снижении длительности процесса и сокращении расхода тиохлорокиси фосфора. сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК о1)з С 07 Н 19!20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ вЂ”вЂ”

ПРИ ГКНТ СССР

:Аг"» .-

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О О $

II ц р

-о-я-o-р-о-v ! l I

О О О

HO (21) 4322727/04 (22) 29.10.87 (46) 15.11.92. Бюл. Рв 42 (71) Институт цитологии и генетики Со AH

СССР (72) В.С.Богачев (56) Goody R.S., Isakov W. Simple synthesis

and separation of the dlastereomers of -thlo

ahologs of rlbo- and deoxyrlbo- dl- and

trIphosphate. Tetrah. Lett. 1986, v.27, hh 31, р.3599-3602. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2 -ДЕЗОКСИНУКЛ ЕОЗ ИД-5 -0-(1-ТИО)ТРИ ФОСФАТОВ (57) Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности, к получению 2 -деэоксирибонуклеозид-5 -О-(1-тио)трифосфатов общей формулы 0 -Р(0)(0 )-О-Р-(0)(0 )-ОДанное изобретение относится к усовершенствованному способу получения дезокси нукл еозид-5 -О-(1-тио)трифосфатов (dNTP S) общей формулы 1 где В-цитозин-1-ил, гуанин-9-ил, и может быть использовано s молекулярной биологии и генетической инженерии.

Цель изобретения — увеличение выхода целевых продуктов и упрощение процесса достигается выявлением условий и параметров реакций, времени, концентрации, реакционной среды, присутствием дополнительных реагентов.

„„SU„„1775406 А1

Р(5)(0 )-0-СН2-СН-0-CH 8-CH -CH(OH), где

В-гуанин-9-или или цитозин-1-ил, используемых в генетической инженерии и молекулярной биологии. Цель — повышение выхода и упрощение процесса. Синтез ведут из 2дезоксирибонуклеозидов обработкой их сначала тиохлорокисью,фосфора в смеси триметил- и триэтилфосфате (1:1) в присутствии пиридина при 0-5ОC (110-130 мин), затем пирофосфатом в виде раствора его три-н-бутил-аммониевой соли в безводном ацетонитриле (4-10 мин) и далее водой (2050 мин) (гидролиз). Выделение целевых ее- ществ ведут на ионообменных колонках.

Эти условия позволяют увеличить выход целевых веществ до 85-90 ) при снижении длительности процесса и сокращении расхода тиохлорокиси фосфора.

Пример 1. Дезоксигуаноэин-5 -О-(1- . тио)трифосфат (dGTP S), тетралитиевая ь соль. Дезоксигуанозин (10,7 мг, 40 мкмоль), высушивают при 110 С, 12 мм рт.ст. над 4

Р205 в течение 8ч, растворяют при переме- ц шивании и нагревании до 120 С в течение 1 р мин в смеси триэтилфосфат-триметилфосфат(1:1,0,18 мл), охлаждаютдо 25 С, прибавляют пиридин (6,6 мкл, 82 мкмоль), О" охлаждают в ледяной бане до 0 С, прибавляют сеежеперетненную Р$С!е (8 мкп, 80 мкмольт, емдержиееют при етои же темпе- к ратуре 120 мин. Затем к реакционной смеси добавляют раствор ди-(три-н-бутиламмониевой) соли пирофосфатной кислоты (66 мг, 120 мкмоль) в безводном ацетонитриле (0,6 мл), содержащий также три-н-бутиламин (22 мкл,90 мкмоль), встряхивают, выдерживают раствор при комнатной температуре 10 мин, прибавляют воду (". мл), выдерживают еще

1775406

43,12 и 42,82 (д), Рр -22,67 (дд), Р 5,94 м.д. (д)

Таким образом, данный способ позволяет примерно в 2 раза повысить выход целевых продуктов (85-90 ) при упрощении процесса за счет применения меньшего количества реагента (Р$О ) и меньшей продолжительности стадий.

Формула изобретения

Способ получения 2 -дезоксинуклеозид5 -О-(1-тио)трифосфатов общей формулы 1

45 мин и наносят на колонку с ДЗАЭ-сефадексом А-25 (7 0,9 см, НСО з). Колонку элюируют водой (20 мл) и затем линейным градиентом 0,10 — 1,0 M бикарбоната аммония, рН 8,5 по 50 мл в смесителе и резерву- 5 аре, Продукт выходит при концентрации соли 0,70-0 75 М (425 о.е.260, 90 от теоретического выхода). Воду упаривают в вакууме, бикарбонат аммония удаляют многократным упариванием с 60 спиртом 10 в вакууме. Остаток растворяют в воде (5 мл), титруют раствором 0,1 М гидроокиси лития до рН 8,5, пропускают раствор через колонку (2 0,8 см), содержащую в нижней части 1 мл Chelex 100 (Ll+), а в верхней Дауэкс 50 2 15 (LI, 1 мл). Продукт элюируют водой (20 мл), раствор упаривают в вакууме до обьема 0,1 мл и прибавляют 1,5 мл 0,5$-ного перхлората лития в ацетоне. Осадок центрифугируют. промываютацетоном(21 мл), эфиром(1 20 мл) и высушивают в вакууме над РгОэ при

25 . УФ-спектр А гййх (я) 253 нс (13700), Л min (e) (232 нм (4800), 31Р-ЯМР-спектр: ф.

43,32 и 42,84 (д), ф -22,72 (дд), Р -5,93 M.ä, (д). 25

Пример 2. Дезоксицитидин-5 -О-(1тио)трифосфат(бСТР,$) тетралитиевая соль.

Дезоксицитидин (9,2 мг, 40 мкмоль) тиофосфорилируют и обрабатывают пирофосфатом так же, как описано в примере 1. 30

Получают 309 о.е,272 (85 )(,) продукта в виде смеси диастереомеров, Осаждение его в виде тетралитиевой соли дает 16,4 мг.

УФ-спектр: А ПИХ (8) 272 нм (9100), Ап1а(е) 250 нм(6300); з р-ЯМР-спектр:Р, 35

О O S

В

0-р-О-P-0-Р

1 1

О 0 0

HO где В-гуанин 9-ил- или цитозин-1-ил, путем

t обработки2-дезоксинуклеозидовтиохлорокисью фосфора в триалкилфосфате в присутствии основания при температуре 0-50С с последующим добавлением раствора пирофосфата и гидролизом реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения процесса, обработку дезоксинуклеозидов тиохлорокисыо фосфора проводят в смеси триэтилфосфата и триметилфосфата (1:1) в присутствии пиридина в течение 110130 мин, пирофосфат добавляют в виде раствора его три-н-бутиламмониевой соли в ацетонитриле и выдерживают в течение 410 мин, а гидролиз реакционной смеси осуществляют водой в течение 20-60 мин.

Составитель Г.Коннова

Техред M.Моргентал

Редактор .

Корректор Н.Бучок

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 40/g Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5