Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба

Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для изучения активности чумного токсина. Сущность изобретения: клеточную культуру, индикаторную к холерному токсину, обрабатывают мышиным (чумным) токсином в дозе 0,1-5 ЛД, инкубируют 5-60 мин. при 18-38° С, затем добавляют холерный токсин в дозе, индуцирующей морфологические изменения в культуре, а результаты оценивают по степени торможения морфологических изменений в опытной и контрольной пробах.

.с1(Оз сс1В(т:ких

СОЦИАЛИС(И Л -.VИХ

РЕСГГУF,ЛИК (51)5 С 12 О 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOMVITF. Г

ПО ИЭОВРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

L (21) 4793460/13 (22) 21.02.90 (46) 15.11.92.Бюл, ¹ 42 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно — исследовательский противочумный институт (72) К,К.Рожков, О.И.Сальникова, А.С.Новохатский, Л.П.Алексеева и В.И.Марченков (56) Mont ie Т. С. J. Intern. — E ncycl.

Pharmacoi., Ther„1981, V.12, N З,р.491-499. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕJIEНИЯ АКТИВНОСТИ МЫШИНОГО ТОКСИНА ЧУМНОГО

МИКРОБА

Изобретение относится к микробиологии, в частности к изучению активности действия бактериальных токсинов, При излучении бактериальных токсинов в качестве индикаторных систем часто используются культуры клеток, как высокочувствительные, стандартные и воспроизводимые модели.

Известно использование для изучения действия холерного токсина и термолабильного энтеротоксина Е. Со клеточной культуры CH0 (Guerrat КЛ .. Branton бЛ .. J. Inf.

Dis„1977, v. 135. р. 720 — 728), Чего (Germani

Y., Dassy В, Апп. Mickrobiol (Inst. Pasteur)

1984, и. 135 В, р. 291 — 295) и других линий, основанное на специфическом изменении морфологии клеток (удлинение или округление) под действием токсина.

Однако попытки использовать клеточные системы для определения действия мышиного токсина чумного микроба оказались безрезультатными (Mantic Т,С. J. Intern. лв . Ы<юо 1773472 А1 (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для изучения активности чумного токсина. Сущность изобретения: клеточную культуру, индикаторную к холерному токсину, обрабатывают

"мышиныл1" (чумныл() токсином в дозе 0,1 — 5

ЛД, инкубируют 5 — 60 мин. при 18 — 38 С, затем добавляют холерный токсин в дозе, индуцирующей морфологические изменения в культуре, а результаты оценивают по степени торможения морфологических изменений в опытной и контрольной пробах, Encycl. Pharmacoi, Ther., 1981, и, 12, N3, р.

491 — 499. Сальникова О.И., Рожков К, К., Апутин И.М, и др. В кн,: Бактериальные токсины. Тез, докл. 2 Всесоюзн. конф. !Ормала, 1989. — С. 115).

Известен способ для определения активности "мышиного" токсина чумного микроба на животных (Montie Т.С., Ajl S.J. Nature and

synthesis of murine toxins of PasteureIla pestis.

Microbial toxIns. N.Y., London, 1970, v. Ill.

Bacteria protein toxins. Ch. 1 — а).

Самкам белых мышей весом 16 — 18 г внутрибрюшинно (или внутривенно) вводят ряд разведений препарата. Препарат одного разведения вводят 6 животным. Число павших мышей на разведение регистоируют через 24 ч, LDgo выражают в микрограммах белка, определенного по методу Лоури, необходимого. чтобы убить 50% мышей и рассчитывают по разведениям.

Однако зтот способ имеет ряд недостатков, связанных с тел1, что используется био1775472 логическая система (лабораторные животные), которую трудно стандартизировать по возрасту, полу, биологической активности. Последняя подвержена сезонным колебаниям и зависит от условий содержания животных (особенно температурного режима и питания). Кроме того, исследуются малые выборки животных из популяции, Все это ведет к низкой воспроизводимости результатов. Недостатком способа является его трудоемкость, связанная с содержанием лабораторных животных.

Целью изобретения является повышение достоверности за счет стандартизации способа и увеличения объема выборки исследуемого биологического объекта, Настоящая цель достигается тем, что в качестве биологической модели используют культуру клеток, изменяющих морфологию под действием холерного токсина, а оценку активности ведут по тормозящему действию мышиного токсина на изменение морфологии клеток.

Способ осуществляется следующим образом. Клеточную культуру, выращенную в ростовой среде с 10 сыворотки плода коровы, переносят в культуральные панели с ростовой средой, содержащей 1% сыворотки и инкубируют при температуре 18 — 38 С в течение 5 — 60 мин. с препаратом мышиноlo токсина возбудителя чумы в дозе 0,1-0,5

LDso, определенной титрованием на белых мышах, затем в эту смесь добавляют холерный токсин в дозе, вызывающей достоверные изменения морфологии клеток (удлинение для СНО, округление для Чего).

Активность действия мышиного токсина оценивают по степени торможения им морфологических изменений клеток под действием холерного токсина в.опытной и контрольной (с кипяченым препаратом мышиного токсина) пробах.

Пример 1. Суспензию клеток (6 10 кл/мл среды Игла, содержащей 1 сыворотки коровы) СНО (СНΠ— KI, институт Цитологии АН СССР, г. Ленинград) в объеме 50 мкл вносили в лунки 96-луночной культуральной плоскодонной панели (0пЬго). Добавляли 50 мкл раствора мышиного токсина содержащего 0,1 ЫЗщ по дайным внутрибрюшинного титрования на белых мышах и инкубировали 5 мин при 38 С. Затем вносили 50 мкл раствора холерного токсина в

Дозе, вызывающей изменения (удлинение в

2-3 раза) 15% клеток популяции СН0.

В качестве контроля клеток испольэователи 50 мкл суспензии клеток СНО (б 10 кл/мл), к которой добавляли 50 мкл растворителей холерного и мышиного токсинов, в данном случае -5мМ раствор трис-НО буфера, рН 7,2.

В качестве контроля действия холерного токсина брали 100 мкл суспензии клеток

5 СНО (3 10" кл/мл), добавляли дозу холерного токсина, используемого в опыте в объеме 50 мкл.

В качестве контроля действия мышиного токсина в 100 мкл суспензии клеток СН0

10 (3.10" кл/мл) добавляли дозу мышиного токсина, используемого в опыте в объеме 50 мкл.

Для контроля специфичности действия мышиного токсина использовали кипяче15 ный в течение 5 мин препарат мышиного токсина.

Контроль взаимодействия токсинов друг с другом осуществляли в следующих вариантах:

"а" — токсины предварительно смешивали, добавляли эту смесь в культуру клеток и инкубировали;

"б" — токсины смешивали, инкубировали и обрабатывали этой смесью клеток;

"в" — культуру клеток инкубировали с холерным токсином, а затем добавляли мышиный токсин, Дозу и объемы токсинов, а также время и температура инкубации соответствовали таковым в опытной пробе примера.

Панель помещали в 5 СОг при 37 С на ночь. Затем считали с помощью инвертированного микроскопа количество клеток, изменивших морфологию в опыте и контролях. Для этого подсчитывали по 400- клеток в трех полях зрения в каждой лунке с 2 — 4 параллельными, В результате учета оказалось, что в предлагаемом нами способе изменили морфологию 10,0 2,0 %, в контроле клеток—

9,0 + 1,9, в контроле действия холерного токсина — 15,0 и 2,4, в контроле действия мышиного токсина -9,9 + 11,8, в контроле специфичности — 15,7,5, в контролях взаимного слияния токсинов друг на друга вариант "а" — 14,7 +. 2,4, вариант "б"—

14,0 й1,8, вариант "в" — 15,4 2,5 $.

Таким образом, мышиный токсин в дозе

0,1 05одостоверно защищал клетки СНО от действия холерного токсина, вызывающего удлинение 15 клеток,,реакция носит специфический характер; использованная в опыте последовательность обработки клеточной культуры токсинами обоснована; мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующего (или активирующего) действия на холерный токсин.

Пример 2, Условия опыта и система контролей, как описано в примере 1, но

1775472

10

15 клетки СНО инкубировали с препаратом мышиного токсина в дозе 2 LDM 30 мин при 37 С, Холерный токсин использовали в дозе, вызывающей изменение морфологии половины клеток в популяции, В результате подсчета оказалось, что в опытной пробе изменили морфологию 11,0 + 2,0 % клеток, в контроле клеток — 8,5 +.1,7, в контроле действия холерного токсина — 50,0 2,4, в контроле действия мышиного токсина—

9,0 1,8, в контроле специфичности реакции — 52,2 ч-2,0, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: "а"—

53,0 -0 2,4 %. вариант "б" — 50,0 +1,8 %, вариант "в" — 51,0+. 1,8 %.

Таким образом, мышиный токсин в дозе

2 LDM достоверно защищает клетки СНО от действия холерного токсина, вызывающего изменение 50 % клеточной популяции; реакция является специфичной, используемая, в.опыте последовательность обработки клеточной культуры — обоснованной: мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующего действия на холерный токсин.

Пример 3. Условия постановки опыта и системы контролей как в примере 1, но клетки СНО инкубировали с препаратом мышиного токсина в дозе 5 LDgo 60 мин при

18 С, а затем вносили препарат холерного токсина в минимальной дозе, вызывающей максимальный эффект (удлинение примерно 70 % клеток в популяции).

При учете результатов выяснилось, что в опытной пробе изменили морфологию

35,5 М,2 % клеток в популяции, в контроле клеток — 10,0 +2 0 % в контроле действия препарата холерного токсина — 70,0 ч-3,5 %, в контроле действия мышиного токсина—

9,0 +4- 3,0 %, в контроле специфичности—

69,1 и 5,4 %, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: "а" — 68,2 2,0

%; в варианте "б" — 71,3 3 5 %, в варианте

"в" -71,0 М,2 %.

Таким образом, препарат "мышиного" токсина в дозе 5 Ю5о достоверно понижал реакцию клеток на холерный токсин в дозе, вызывающей изменение 70 % клеток популяции; реакция носит специфический характер; последовательность обработки клеточной культуры обоснована; мышиный токсин не оказывает прямого ингибирующего (или активирующего) действия на холерный токсин.

Пример 4. Для опыта использовали культуру клеток Чего. (институт Цитологии

АН СССР, г. Ленинград). Учет клеточной реакции оценивали в 4 — х бальной системе по степени изменения клеточного монос/оя.

Суточный монослой культуры Чего при по20

55 севной дозе 15 10 кл/мл: в объеме 100 мкл

4 среды Игла, содержащей 1 % сыворотки плода коровы, инкубировали с 25 мкл препарата мышиного токсина в дозе 2 LDgo npu

37 С в течение 30 мин. Затем добавляли 25 мкл холерного токсина в дозе, вызывающей изменения морфологии (округление) примерно половины клеток популяции (реакция на 2 балла). Условия культивирования, как система контролей аналогичны описанным в примере 1.

При учете результатов оказалось, что в опытной пробе. изменений клеточной морфологии не наблюдалось, в контроле клеток — тоже, в контроле действия холерного токсина отмечены изменения на 2 балла, в контроле действия мышиного токсина изменений монослоя не было, в контроле с ецифичности отмечены изменения на 2 бэлла, в контролях взаимного влияния токсинов друг на друга: вариант "а" — изменения на 2 балла, вариант "б" — изменения на

2 балла, вариант "в" — изменения на 2 балла, Таким образом, мышиный токсин в дозе

2 LDgo полностью защищает клетки Чего от действия холерного токсина, вызывающего изменения морфологии клеток Чего на 2 балла, реакция специфична, прямого ингибирующего (или эктивирующего) действия холерного токсина мышиным не отмечено.

Пример 5. Объемы проб, доза клеток и способ испытания препаратов в культуре клеток СНО аналогичны описанным в примере 1. Для количественного препарата мышиного токсина сначала находят цитотоническую единицу холерного токсина (ЦТЕ5о XT). Для этого двухкратные разведения препарата холерного токсина (ХТ)(8 мкг/мл) испытывают в системе клеток СНО.

Рассчитывают дозу холерного токсина, вызывающую. 50 изменение морфологии клеток и ее доверительные интервалы (Боярский А.Я„1955, с. 243-249, при n = 1200 подсчитанных клеток на каждую дозу и р =

0,05, с применением системы пробитов (Ашмарин И.П„Воробьев А.A., 1962, с. 93 — 104, 173). Как видно из рис. 1, она составляет

5,15 (6,3 — 4,4) нг/мл при разведении XT 1;

1550 (1: 1780 — 1: 1260), которое вызывает

50;0 3,2 % удлинения клеток популяции.

Затем двухкрэтные разведения препарата (2,5 — 0,00195 мкг/лунка) мышиного токсина (Ы35о=2 мкг) вносят в лунки с клетками

СН0. После 30 мин инкубации при 37ОС в лунки добавляют холерный токсин в дозе, равной 2 ЦТЕ5о ХТ (1: 890 — 1: 630), что соответствует 10,3 (12,7-9,0) нг/мл, вызывающей 62,0 + 3,1 % удлинения клеток популяции. После ночной инкубации панель

1775472

Составитель К.Рожков

Текред M,Moðãåíòàë Корректор Л.Лукач

Редактор А,Бер

Заказ 4022 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 микроскопируют и определяют статистически достоверную дозу мышиного токсина, снижающую процент удлиненных клеток до

50 уровня. Эту дозу считают эквивалентной 1 ЦТЕю ХТ, она составляет 0,18 (0,160,21) мкг.

Таким образом, на предложенной модели клеточной культуры СНО получена количественная характеристика антицитотонического

{антихолерогенного) действия мышиного токсина, Формула изобретения

Способ определения активности мышиного токсина чумного микроба путем введения исследуемого токсина в биологическую модель и оценки результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности за счет стандартизации способа, в

5 качестве биологической модели используют культуру клеток, чувствительных к действию холерного токсина, после введения мышиного токсина культуру инкубируют в течение

5-60 мин при 18 — 38 С, далее добавляют

10 холерный токсин в дозе, вызывающей морфологические изменения у 15-73,5 % клеток культуры, и определяют активность мышиного токсина по количеству морфологически измененных клеток, 15