Способ определения лектиновой активности

Способ определения лектиновой активности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: физиология растений, биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: для определения лектиновой активности готовят ряд последовательных разведений исследуемого образца, добавляют к нему клетки микроводоросли Chlamydomonas reinhardli CW 15 и проводят реакцию агглютинации в течение 1 ч при рН реакционной смеси 7,0-7,4.

сокэз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (ч>s G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ С ВИДЕТЕЛ ЬСТВУ (21) 4915690/13 (22) 01.03,91 (46) 30.11,92, Бюл. N 44 (71) Институт физиологии растений им.

К.А,Тимирязева (72) В.Е.Семененко, Н,А,Пронина, Е.С.Купцова и Т;Н.Фалькович . (56) Луцик и др. Методы поиска лектинов и определения их иммунохимической специфичности. Методические рекомендации.

Львов, 1980, Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к исследованию биологических материалов, а именно к способам определения лектиновой активности и может найти применение при анализе биологических объектов и определения структуры и качественного состава лектинов.

Известен способ определения лектино вой активносги при гемагглютинации.

Принцип его заключается в том, что к серии последовательных разведений добавляют

2%-ную суспензию эритроцитов и после инкубации определяют агглютинацию эритроцитов визуально. Титр лектина выражают наибольшим разведением раствора, дающего агглютинацию.

Недостатками этого способа являются использование эритроцитов для тестирования гемагглютинирующей активности. Во-первых, не всегда имеется возможность взятия крови у животных из-за их отсутствия или болезни. Необходимы большие средства для поддержания вивария. Во-вторых, эритроциты могут храниться в хорошем состоянии очень ограниченное время (сутки или несколько суток), по истечении которого необходимо повторное взятие крови. Кроме

„„5U 1778698 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ (57) Использование: физиология растений, биотехнология, иммунология, Сущность изобретения; для определения лектиновой активности готовят ряд последовательных разведений исследуемого образца, добавляют к нему клетки микроводоросли

Chlamydomcnas relnhardli CW 15 и проводят реакцию агглютинации в течение 1 ч при рН реакционной смеси 7,0-7,4. того, с помощью традиционного способа тестирования лектинов по агглютинации эритроцитов не могут быть выявлены лектины из всех обьектов, Предложен способ определения лектиновой активности с помощью клеток микроводоросли Chlamydomonas

reinhardtiI CW-15, с помощью которого могут быть выявлены лектины, имеющие углеводсвязывающие участки, характерные для растительных объектов и не взаимодействующие с эритроцитами или другими ранее предложенными объектами.

Целью изобретения является расширение сферы возможностей способа и уменьшение трудоемкости процесса, Поставленная цель достигается новым способом определения лектиновой активности с использованием способности отдельных клеток к агглютинации и последующей визуальной оценкой ее, причем в качестве отдельных клеток используют микроводоросль Chiamydomonas reinhardtii CW-15. агглютинацию проводят методом последовательных четырехкратных разведений лектина в известной концентрации при рН 7.0-7,4 и концентрации клеток 1 52,5%.

1778698

10

50

При проведении реакции агглютинации при рН больше или меньше названных пределов клетки водорослей лизируют. При концентрации клеток ниже 1,5% осадка не образуется, при концентрации выше 2,5% во всех лунках выпадает осадок, Пример 1. Для проведения реакции гемагглютинации берут нужный объем раствора крови в Консерванте, трижды отмывают физиологическим раствором на холоде при центрифугировании1,5тыс об/мин

10 мин и ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,2 до концентрации эритроцитов

2%. Эту суспенэию используют для определения лектиновой активности на пластиковых планшетах с U-образными лунками с объемом 200 мкл. Калиброванный пипеткой в каждую лунку вносят. по 150 мкл буфера, в пеовчю лунку добавляют 50 мкл раствора коммерческого лектина конканавалина А(соп

А) в фосфатном буфере 1 мг7мл и делают последовательное четырехкратное разведение этого лектина, Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии эритроцитов и перемешивают содержимое лунок путем осторожного встряхивания планшета в горизонтальной плоскоСти. Оставляют на 2 ч при комнатной температуре, Результаты реакции учитывают невооруженным глазом. Определяют последнее разведение белка, при котором еще происходит гемагглютинация, 8 тех лунках, где белок вызывает агглютинацию, эритроциты покрывают дно ровным слоем. При отсутствии агглютинации они скапливаются в центре углубления лунки, образуя компактную пуговку с резко очерченными краями. Конканавалин А вызывает агглютинацию эритроцитов в первых шести

: унках, следовательно активность этого препарата составляет 0,244 мкг/мл, Пример 2, Для проведения реакции альгоагглютинации берут нужный объем суспензии микроводоросли Chlamydomonas

reinhardtil CW-15, культивирование которой проводят в накопительном режиме в стерильных условиях при постоянном освещении 60 Вт/м, температуре 26 — 28 С и непрерывном барботировании газовоздушной смесью, содержащей 1,7-2% СО в различного типа культуральных сосудах. Среда для культивирования содержит, г/л; NH4CI

5, MgS047H202, СаС!2 2НгО 1, KgHP0414„4, КН2РО4 7,2, раствор микроэлемейтов для сине-зеленых водорослей 1 мл. Отмывают физиологическим раствором на холоде при центрифугировании 2000 об/мин 10 мин и ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,2 до концентрации клеток 2%. Эту суспензию используют для определения лектиновой активности на пластиковых планшетах с 0образными лунками с объемом 200 мкл. Калиброванной пипеткой в каждую лунку вносят по 150 мкл буфера, в первую лунку добавляют 50 мкл раствора соп А в фосфатном буфере 1 мгlмл и делают последовательное четырехкратное разведение белка.

Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии водорослей и перемешивают содержимое лунок путем осторожного встряхивания планшета в горизонтальной плоскости, Оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом. Определяют последнее разведение белка, при котором еще произошла альгоагглютинация, В тех лунках, где белок вызывает агглютинацию, клетки водорослей покрывают дно ровным слоем. При отсутствии агглютинации они скапливаются в центре углубления лунки.

Соп А вызывает агглютинацию клеток хламидомонады в первых пяти лунках, следовательно активность этого лектина составляет

0,98 мкг/мл.

Пример 3. Для проведения реакции альгоагглютинации берут нужный объем суспенэии микроводоросли хламидомонады, отмывают физиологическим раствором при центрифугировании 2000 об/мин 10 мин на холоде и ресуспендируют в фосфатном . буфере рН.7,0 до концентрации клеток водо рослей 1,5%. Далее реакцию альгоагглютинации проводят аналогично примеру 2.

Активность Соп А по агглютинации. клеток хламидоманады составляет 0,98 мкгlмл.

Пример 4. Реакцию альгоагглютинации проводят аналогично примеру 2. После центрифугирования клетки хламидомонады ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,4 до концентрации 2,5%. Активность Соп А по агглютинации клеток хламидомонады составляет 0,98 мкг/мл.

Результаты примеров 2 — 4 показывают, что предлагаемый способ дает воэможность определить лектиновую активность при помощи клеток хламидомонады, уменьшить

его трудоемкость s связи с заменой животных клеток на клетки микроводорослей.

Формула изобретения

Способ определения лектиноаой активности, включающий приготовление серии последовательных разведений исследуемого образца, содержащего лектины, добавление к исследуемому образцу суспенэии клеток тест-объекта, инкубацию смеси и визуальную оценку реакции агглютинации, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса, в качестве тест-объекта испольэу1778698

Составитель И. Мегера

Техред М.Моргентал Корректор И. Шулла, Редактор

Заказ 4191 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10, ют клетки микроводоросли Chlamydomonas инкубацию проводят в течение 1 ч при рН

relnhardli CW 15 в концентрации 0,3- 0,5, реакционной смеси 7,0-7,4.