Способ получения нуклеозидов или их фармацевтически приемлемых сложных эфиров

Способ получения нуклеозидов или их фармацевтически приемлемых сложных эфиров

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к химии природных соединений, в частности к получению нуклеозидов ф-лы У IN 1 Ян где Ri-H или амино; Р2-С2-Се-алкокси - или метокси замещенный Сз-Се-циклоалкилом Сз-Св-циклоалкокси, лирролидинил, или аминогруппа, замещенная С2-Се-алкилом, Сз Сб-Циклоалкилом, или дизамещенная и Сз-Сб-циклоалкил - С2-Се-алкилом или ди- Ci-Ce-алкилом, или их фармацевтически приемлемых сложных эфиров. Цель - разработка способа получения более активных соединений. Получение ведут рекцией пуринового основания ф-лы ВН, где В - соответствующий остаток пурина с 3-деокситимидином в апротонном полярном растворителе в фосфатном буфере в присутствии смеси ферментов переноса пентозила с последующим в случае необходимости переводом полученного соединения в его фармацевтически приемлемый сложный эфир, обработкой соответствующим галоидангидридом, 1 табл. СО С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК Ы, 1779256 А3 (st)s С 07 Н 19/16, С 12 Р 19/40

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) т -"ь;, „Ь й, гдд,1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ я .".",,.„ .: -.=.

К ПАТЕНТУ .- » где R>-Н или амина; Rz-С2-С6-алкокси — или метокси замещенный Сэ-Сб-циклоалкилом

Сэ-Св-циклоалкокси, пирролидинил, или аминогруппа, замещенная С2-Св-алкилом, Сэ-Се-циклоалкилом, или диэамещенная и

Сэ-Св-циклоалкил — Сг-Св-алкилом или диC1-Се-алкилом, или их фармацевтически приемлемых сложных эфиров. Цель — разработка способа получения более активных соединений. Получение ведут рекцией пуринового основания ф-лы ВН, где В— соответствующий остаток пурина с 3-деокситимидином в апротонном полярном растворителе в фосфатном буфере в присутствии смеси ферментов переноса пентозила с последующим в случае необходимости переводом полученного соединения в его фармацевтически приемлемый сложный эфир, обработкой соответсгвующим галоидангидридом, 1 табл.

В (21) 4355537/04 (22) 08.04.88 (31) 8708512; 8712691; 8723013 (32) 09.04,87; 29.05.87; 30.09.87 (33) GB (46) 30.11.92. Бюл. М 44 (71) Дзе Велкам Фаундейшн, Лимитед (GB) (72) Джордж Уолтер Кошалка. Томас Энтони

Кренитский, Дженет Литстер Райдаит и

Чарлин Луис Бернс (US) (56) J.Bioorg. Chem, 9/1/, 1983, с.50 — 59. (54)Ч:ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ

ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ (57) Изобретение относится к химии природных соединений, в частности к получению нуклеоэидов ф-лы .. " в 1 л

;/ 4мн ио

Изобретение относится к 6-замещенным 2, 3-дидеоксинуклеозидам, их фармацевтическим производным, пригодным для лечения и профилактики некоторых вирусных инфекций.

СПИД относится к иммуносупрессивному или иммунодеструктивному заболеванию, которое предрасполагает лиц к инфекциям с возможным смертельным исходом. В сущности, СПИД связан с прогрессирующим истощением T-клеток, особенно субсистемы помощник-индуктор, несущей поверхностныи маркер -ОКТ .

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) репродуцивно выделен от больных СПИД или больных с симптомами, которые часто 4 предшествуют СПИД. ВИЧ цитопатичен, и по-видимому, преимущественно -инфициру- © ет и разрушает Т-клетки, несущие ОКТмаркер, причем теперь общепризнано, что СЛ

ВИЧ является зтилогическим фактором 0

СПИДа.

С моменте открытия того, что иммунодефивитный виРус является этиологическим агентом СПИД, сделано множество предложений по созданию химиотерапевтических средств против вируса иммунодефицига человека, которые могут быть эффективны при лечении больных СПИД. Так, например, в описании на Европатент М 196185, раскры вается 3 аэидо-31-деокситимиl дин/апробированный над названием

1779256 эидовудин/, его фармацевтически приемлемые производные и использование их при лечении ретровирусных инфекций у человека, в том числе СПИД, и ассициированные клинические состояния., 5

Опубликовання заявка на Европатент

М 0206497 относится в основном к пуриновым нуклеозидам, применяемым при лечении вирусных инфекций, вызывающих иммунодефицит у человека и аналогичные 10 состояния. В частности, в указанной заявке описан 2,6-диаминпурин-9-P-0-2, 3-диде1 оксирибофураноэид, предназначенный для лечения вирусных инфекций, приводящих к иммунодефициту человека. 15

В ходе данной работы, найдено, что некоторые 6-замещенные 2, 3-дидеоксинук1 леозиды, упоминаемые ниже, пригодны для лечения или профилактики вирусных инфекций, в частности раствор ретровирусных ин- 20 фекций и особенно СПИД.

Ранее были описаны некоторые 6-замещенные пуриновые нуклеозиды, и в частности, в журнале Bloorg. Chem, 9/1/ стр. 52—

59, 1983 r., описан 6-метиламинопурин-9-P-0 25

1 1

2 -, 3 -дидеоксирибофураноэид, применяемый далее в данном описании для лечения вирусных инфекций, вызывающих иммунодефицит человека и аналогичные состояния.

Цель изобретения — изыскание способа 30 получения новых соединений, описываемых указанной ниже структурной формулой, обладающих более высокими лечебными свойствами при лечении и профилактике вирусных инфекций. 35

Согласно изобретению предлагается способ получения нуклеозидов формулы

Л 40 ми где Я1 — водород или амийо: Rg — С вЂ” C6-ал- 45 кокси- или метокси замещенный Сз — Cgциклоалкилом, C3 — С8-циклоалкокси, пирролидинил, или аминогруппа, эамещенная С вЂ” Се-алкилом, Сэ-С6-циклоалкилом, или ди-замещенная Сз — Св-цикла- алкил-Сг 50 — Ce-алкилом или ди-С1 — Cg-алкилом, или их фармацеватически приемлемых сложных, эфиров.

Согласно изобретению нуклеозиды формулы I получают путем взаимодействия 55 пуринового основания формулы (11) ВН, где

 — соответствующий, остаток пурина, с 3деокситимидином в апротонном полярном растворителе в фосфатном буфере в присуствии смеси ферментов переноса пентоэила, такой как смесь тимидинфосфорилазы и пуринуклеозидфосфорилаэы с последующим в случае необходимости переводом полученного соединения формулы (I) в его фармацевтически приемлемый сложный эфир обработкой соответствующим галоидангиридом.

К примерам ретровирусных инфекций, которые можно лечить или предупреждать способом в соответствии с настоящим изобретением, относятся такие как вирус, вызывающий иммунодефицит человека (ВИЧ), ВИЧ-2 и лимфотропный вирус Т-клеток у человека (HLTV), например, инфекции

HTLVÈ или HTLV-И, Предлагаемые соединения особенно пригодны для лечения или профилактики СПИД и родственных клинических состояний, например как СПИД— связанного комплекса (AP C), прогрессируемая общая лимфаденопатия (Р61 ), СПИД— связанных неврологических состояний, таких как рассеянный склероз или тропические парапарезы, анти-В ИЧ-антитело положительные и ВИЧ-положительные состояния, саркома Капоши и системная волчанка. Предлагаемые соединения можно также использовать для лечения и профилактики псориаза.

Предлагаемые соединения, указываемые в данном описании также как активное вещество, можно принимать при лечении любым подходящим способом, включая оральный, ректальный, назальный местный (в т.ч, в ротовой полости и под языком), вагинальный и парентеральный (в т,ч. подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное введение), Требумая доза обычно будет колебаться в интвервале от 3,0 до 120 мг на кг массы тела больного в сутки, предпочтительно от

6 до 90, а в наиболее предпочтительном варианте от 15 до 60 мг на кг массы тела в сутки. Требуемую дозу предпочтительно распределять на две. три, четыре, пять, шесть или более дробных доэ, принимаемых в течение суток через соответствующие интервалы. Указанные дробные дозы можно принимать в единичных дозированных формах, например, содержащих 10 — 1500 мг, предпочтительно 20 — 1000 мг и в наиболее предпочтительном варианте 50 — 700 мг активного.вещества на одноразовую дозу.

В идеальном варианте, активное вещество следует вводить для достижения в крови максимальных концентраций активного соединения примерно от 1 до 75 мкМ и предпочтительно примерно от 2 до 50 мкМ, а в наиболее предпочтительном варианте примерно от 3 до 30 мкМ. Такие концентрации можно получить, например, путем вве1779256

15

25

55 дения внутривенно 0,1 — 57 раствора активного вещества, не обязательно растворенного в физиологическом растворе, или при оральном приеме в виде пилюли, содержащей примерно от 1 до 100 мг/кг активного ингредиента. Требуемую концентрацию в крови можно поддерживать непрерывным вливанием для подачи примерно 0,01 до 5,0 мг/кг/ч или периодическими вливаниями, содержащими примерно от 0,4 до 15 мг/кг активного вещества.

Хотя можно активное вещество вводить в чистом виде, предпочтительно его назначать в виде фармацевтического состава.

Рецептуры изобретения содержат хотя бы один активный ингредиент, как указано выше, в комбинации с одним или несколькими его приемлемыми носителями и в необязательном варианте другие лекарственные средства, Каждый носитель должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими компонентами лекарственного состава и безвредности его больному. В рецептуры входят носители, пригодные для орального, ректального, назального, местного (в т.ч. I poтового и подъязычного), вагинального или парентерального (в т.ч, подкожного, внутривенного, внутримышечного и внутрикожного) введения. Для удобства лекарственные составы можно представлять в единичной дозированной форме и приготавливать любыми известными в фармации методами.

Такие методы включают операцию связывания активного вещества с носителем, который составляет один или несколько вспомогательных ингредиентов. Обычно лекарственные составы приготавливают посредством равномерного и тщательного, соединения активного вещества с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или с обоими, а затем при необходимости формования целевого продукта.

Лекарственные составы предлагаемого изобретения, предназначенные для орального введения, можно приготавливать в виде дискретных единиц, например, как капсулы, пилюли или таблетки, каждая из, которых содержит дозированное количество активного вещества, в виде порошка или гранул, в виде раствора или суспензии в водном или безводном жидком веществе или в виде жидкой эмульсии типа масло-вода или вода-масло, Активный ингредиент может быть также представлен в виде шарика, или пасты.

Таблетки можно получать путем уплотнения или прессования, по желанию с одним или несколькими вспомогательными компонентами. Спрессованные таблетки можно получать путем уплотнения в соответствующей машине активного вещества в свободнотекущем виде, например как порошок или гранулы, при желании смешанного со связующим (например, повидоном, желатином, оксипропилметилцеллюлозой), замасливэтелем, инертным разбавителем, консервантом, дезинтегрантом (например, ; натрийгликолягом крахмала, сшитым повидоном . сшитой натрийкарбоксиметилцеллюлозой), поверхностно-активным или диспергирующим веществом.. Сформовэнные таблетки можно получить путем формования в соответствующей машине смеси из порошкообрэзного соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. По желанию на таблетки можно нанести покрытие или надрез и их можно составлять так, чтобы обеспечить медленное или регулируемое высвобождение активного вещества, содержащегося в таблетке, используя, например, оксипропилметилцеллюлозу в различных соотношениях для получения требуемого профиля высвобождения. По желанию, таблетки можно выполнить с знтеральной оболочкой для выделения частично из кишечника помимо желудка. Указанное особенно имеет преимущество для производных пуриновых нуклеозидов, поскольку такие соединения подвержены кислотному разложению.

Лекарственные препараты, пригодные для местного применения в ротовой полости, включают лепешки с активным веществом в ароматизированной основе, обычно сахаре и акации или астрагале; пастилки с активным веществом в инертном носителе, например как желатин и глицерин, или сахаре и акации, и растворы для полоскания ротовой полости, содержащие активное вещество в соответствующем жидком носителе.

Лекарственные составы для ректэльного приема могут быть представлены в виде свечей с соответствующей основой, содержащей, например, масло какао или салицилат.

Прописи, пригодные для вагинального применения, могут быть представлены в виде писсариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пены или спрзйев, содержащих дополнительно к активному веществу такие носители, которые известны в данной области для этих целей.

В рецептуры, предназначенные для парентерального введения, входят водные и безводные изотонические стерильные растворы, которые могут содержать противоокислители, буферы, бактериостаты и

1779256 растворенные вещества, которые переводят состав в изотоничный с кровью предполагаемого больного. и водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие вещества и загустители, Указанные лекарственные препараты могут быть представлены в герметичных емкостях с одноразовой или многоразовой дозой, например, ампулах или флаконах, причем их можно хранить в сублимированно-высушенном (лиофилизованном) состоянии, необходимо только непосредственно перед употреблением добавление стерильного жидкого носителя. например, воды для инъекций. Моментально приготавливаемые инъекционные растворы и суспензии можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток типа, описываемого выше в данком описании.

Предпочтительными препаратами, используемыми в единичной дозировке, являются такие, которые содержат, как ранее указывалось в данном описании, суточную дозу или единицу, суточную дробную дозу или ее соответствующую долю активного вещества..

Предлагаемые соединения можно также представлять для использования в форме ветеринарных, препаратов, которые можно получать, например, традиционными в данной области способами.

Следует иметь в виду, что при добавлении к ингредиентам, особенно указываемым выше, предлагаемые препараты могут включать другие вещества, общепринятые в данной области, имеющие отношение к типу рассматриваемого лекарственного препарата. Например, вещества, пригодные для орального введения. могут включать такие вспомогательные агенты, как подслащивающие добавки, загустители и ароматизированные вещества.

Пример 1. 6-N-пиперидинопурин-9P-D-2,3 -дидеоксирибофуранозид, 6-N-пиперидинпурин, (2,41 ммоль, 0,5 r

Sigma Chemicals St Louis МО)растворяют в

10 мл .диметилсульфоксида при нагревании.

После охлаждения до комнатной темпер ату р ы и р и ба вл я ют 3 -деокситимидина

l (3,62 ммоль, 0,82 r) вместе с 30 мл 10 м М . калийфосфатного.буфера с рН 6,8, содержащего 0,04% азида калия.

Прибавляют очищенную тимидинфосфатную (10,000 м.ед) и пуриннуклеозидфосфорилазу (20,000 м.ед), абсорбированные в

10 мл DEAE-целлюлозе, и полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через 8 часов реакционную смесь фильтруют и фильтрат наносят на систему из сопряженных колонок. Первая колонка заполнена гидроксидной смолой AGI-X2 (2,5 х 10 см), а вторая — смолой из Амберлита XAD -2 (2,5—

20 см), После нанесения образца колонку промывают большим объемом воды, и полученный продукт элюируют метанолом, После удаления растворителя и повторного растворения в смеси хлороформ метанол (9: . 1 по объему), дополнительно хроматогра10 фируют на колонке с силикагелем (5 х 20).

Подвижную фазу представляют смесь хлороформ; метанол (9: 1 по объему).

Продуктсодержащие фракции соединяют, повторно растворяют в этаноле и фильтруют через 0,22 мкм фильтр. Этанол упаривают, а продукт растворяют вводе. После лиофилизации 6-N-пиперидинопурин-9-Р-D-2,3 -ди1 деоксиробофуранозид (0,265 г) анализируют в виде 0,1 гидрата, содержащего 0,3 этанола.

Вычислено, %; С 58,74; Н 7, 27; N 21,96

С15Н21Й502

Найдено, %: С 58,86; Н 7,14; N 21,82

ЯМР д 8,36 /с.1Н, Нв/, 8,19 /С, 1Н, Hz/ 6,23/дд, 1Н, H) 5,01 /т, 1Н, J = 5,54, ОН5/, 4,12 /м, 3Н, H4 CHz/ 3,52 /м, 2Н. Н5/, 2,37 /м, 2Н/ Н2/2,04 /м, 2Н, Нз /, 1,61 / б, 25

2Н, СН2/

Пример 2. 6-хлоропурин-9-P-D-2, 3 -дидеоксирибофуранозид

Синтез 6-хлоропурин-9ф-D-2,3 -дидеt I оксирибофуранозида осуществляют по ме30 тодике примера 1, за исключением того, что

6-хлопурин (Sigma Chemicals, St Louis

МО)растворяют в 5 мл каждого из диметилформамида и диметоксиэтана.

После отфильтровывания твердого вещества фильтрат доводят до и римерно 5 мл в вакууме с последующим растворением в

100 мл воды. Полученный продукт хроматографируют на колонке со смолой XAD-2 (2,5 х х20 см). После промывки колонки 500 мл воды, продукт элюируют метанолом. Продуктосодержание фракции объединяют и

45 прибавляют 20 мл сухого силикагеля. Весь раствор удаляют в вакууме. Сухой силикагель наносят на верхнюю часть колонки с силикагелем, доведенную до равновесного состояния смесью хлороформ; метанол (9;

50:1 по объему), продуктсодержащие фракции, в которых нет диокситимидина, объединяют. После удаления растворителя в вакууме осадок растворяют в этаноле, филь труют с дальнейшим растворением в воде и

55 лиофилизуют. Полученный продукт дополнительно очищают хроматографией на колонке, содержащей полигосильную CIs смолу, в смеси из метанола и воды (8; 2 по объему). После удаления растворителя в ва1779256

10 кууме продукт растворяют s воде и лиофилизуют с выходом 0,199 г 6-хлоропурин-9-P-D2, 3 -дидеоксирибофуранозида (т.пл. !

100 С)

Вычислено, /о. С 47,16; Н 4,35; N 22,00; 5

С! 13,92, C>oH»CiN40Z

Найдено, /: С 47,10; Н 4,35; N 21,94; CI

13,86.

Пример 3, 6-Этиламинопурин-9-)3-0- 10

2 . 3 -дидеоксирибофуранозид, ! L (2,69 ммоль, 0,5 г) 6-этиламинопурина (и риготовлен ного нуклеофильн ым замещением хлорной группы у 6-хлорпурина (Sigma

Chemicals, St Louis МО) аминогруппой эти- 15 ламина) и 3 33 ммоль, 0,755 г (3-детокситимидина) соединяют вместе с 50 мл 10 мМ калиевофосфатного буфера с рН 6,8, содержащего 0,04 / азида калия. Прибавляют очищенную тимидинфосфорилазу (400 20 м.ед,), и пуриннуклеозидфосфорилазу (700 м.ед) и полученную суспензию перемешивают при 37 С. Через 48 часов добавляют еще

700 ед. пириннуклеозидфосфорилазы и 400 ед. тимидинфосфорилазы, и реакционную 25 смесь перемешивают при 37 С. Через 5 дней реакционную смесь фильтруют и наносят на колонку с гидроксидной смолой AG-1Х2 (2,5 х 10 см), Полученный продукт элюируют водной промывкой и хроматогра- 30 фируют на амберлитовой смоле ХАО-2 (2,5—

20 см). После нанесения образца колонку промывают большим объемом воды. Про- дукт элюируют метанолом, После удаления растворителя продукт повторно растворя-,35 ют в воде и ацетоне, затем лиофилизуют с выходом 0,299 r б-этиламинопурин-9ф-D2,3 -дидеоксирибофуранозида, который ! анализируют как 0,2 М воды и 0,1 оцетона. (т.пл. = 30 С(а)20 С =-29,45 С/0,5ДМФ/) 40

Вычислено, /: С 57,17; Н 6,64; N 25, 68

С12Н17И502 0,2Н20 0,1СзН60

Найдено, : С 54,13; Н 6,69; N 25,75.

Пример 4, б-этилметиламинопурин-9Р-0-2, 3 -дидеоксирибофуранозид, !

Методика синтеза 6-этилметиламинопури н-9-P-0-2,3, дидео к с и ри бофура нозида ! I аналогична примеру 2. Реакционную смесь фильтруют, фильтрат наносят на колонку с дауэкс 1-гидроксидом (2,5 — 10 см), Продукт 50 элюируют 90 раствором метанола в воде (по объему) и хроматографируют на амберлитовой смоле XAD-2 (2,5 х 20 см) после удаления растворителя до примерно 5 мл и повторного растворения в 100 мл воды. Ro- 55 сле нанесения образца колонку промывают большим объемом воды, полученный продукт элюируют 95 раствором этанол-вода (по объему). Продуктсодержащие фракции объединяют и 20 мл сухого силикагеля прибавляют. Весь растворитель удаляют в ваккуме, Сухой силикагель наносят на верхнюю часть колонки с силикагелем (4,8 х 20 см), доведенную до равновесного состояния смесью хлороформ:метанол (98: 2, по объему), Продуктсодержащие. фракции объединяют и после упаривания растворителя в вакууме растворяют первоначально в этаноле и фильтруют. После удаления растворителя и повторного растворения в воде раствор лиофилизуют с получением 0,3 6этилметиламино-9-/3-0-2, 3 -дидеоксирибо-! фуранозилпурина, который анализируют как 0,05 гидрат (т.пл. < 30 С).

Вычислено, :С 56,12; Н 6,92; N 25,17.

С1зН19Й502 0,05Н20

Найдено, : С 56,12; Н 6,94; N 25,14.

ЯМР: д 8,36 /с, 1Н, Ня/, 8,19 /с, 1Н, Нр/

6,23 /дд. 1Н, H i/ 5,05 / т, 1Н, J = 5,58, ОН5/

4,09/м, 1Н, H4/ 4,08 /м, 2Н, СН2/ 3,51/м, 2Н, Н5/. З,ЗЗ /с, ÇH, СНз/, 2,41 м, 2Н, Н2/, 2,03/м, 2Н, Нз/ 1,14 т, ÇH, J = 7,01, СНз/

Пример5. б-иодопурин-9ф-0-2, 3 -дидеоксирибофуранозид . б-иодопурин (0,624 г, 2,54 ммоль, Sigma

Chemicals, St Louis M0) и 3 -диокситимидин ! (0,71 г, 3,13 ммоль) смешивали с 700 мл 10 мМ калийфосфатного буфера с рН 6,68, содержащего 0.04 азида калия. Прибавляют очищенную тимидинфосфорилазу(2,000 ед,) и пуриннуклеозидфосфорилазу (7,000 м,ед), и полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через 48 ч реакционную смесь фильтруют, и фильтрат сушат в вакууме.

Полученный осадок растворяют в 95 растворе этанола с водой (по объему), и после прибавления до примерно 20 мл силикагеля, растворитель удаляют в вакууме. Сухую двуокись кремния наносят на верхнюю часть колонки с силикагелем (2,8 X 50 см), и полученный продукт элюируют смесью метанол: хлороформ (5: 95, по всему обьему).

Фракции, содержащие только продукт, соединяют, а растворитель удаляют в вакууме.

Осадок повторно растворяют в этаноле и фильтруют через 0,22 мкм фильтр. После удаления большей части этанола и прибавления примерно 25 мл воды, полученное вещество лиофилиз ют с выходом 0,088 г б-иодопурин-9-P-D-2, 3 -дидеоксирибофуранозида, который анализируют как 0,2 гидрат (т. пл. 151 — 153 С).

Вычислено, :С 35.15; Н 3,46; N 15,77.

СюН»!ч402 . 0,2 Н20

Найдено ; С 35,31; Н 3.31; N 15,83.

Пример б. 6-Циклопропилметиламинопурин-9-/3-0-2, 3 -дидеоксирибофурано-! зид, 1779256

6-Циклопропилметиламинопурин получают нуклеофильным замещением хлорной группы 4 б-хлоропурина (Sigma

Chemicals, St Louis МО) аминогруппой циклопропилметиламина (Sigma Chemicals, St Louis M0) 6-циклопропилметиламинопурин (2,64 ммоль, 0,50 г) растворяют в 5 мл диметилформамида. После охлаждения до комнатной температуры прибавляют 3 -деI окситимидин (3,98 ммоль, 0,90 г) вместе с 30 мл 10 мМ калийфосфатного буфера с рН

6,8, содержащего 0,04% азид калия. Прибавляют очищенную тимидинфосфорилазу (10,000 м.ед) и пуриннуклеозидфосфорилазу (20,000 м.ед.), абсорбируемых в 10 мл DEAEцеллюлозе (Whatman), Полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через 8 часов реакционную смесь фильтруют, фильтрат наносят нэ систему из сопряженных колонок. В первой колонке находится смола AG1-Х2 (ОН-форма), 2,5 х 10 см, в то время как во второй колонке — амберлитовая смола

XAD-2 (2,5 х 20 см). После нанесения образца колонку промывают 500 мл воды и продукт элюируют метанолом. Затем продукт подвергают флэшхроматографии в колонке. с силикагелем, 5 х 20 см, используя смесь хлороформ; метанол (9: 1 по объему). Растворитель удаляют в вакууме, и полученную смолу помещают во флакон с ацетоном. После лиофилизации получают 0,588 r 6-циклопропилметиламинопурин-9-Д-D-2, 1

3 -дидеоксирибофуранозида, который анализи- руют как 0,15 воды и 0,15 ацетона.

Вычислено, %, С 57,71; Н 6,77; N 23.29.

С14Н 19Й502 0,15Н2 0,15СзН60

Найдено, %: С 57,73; Н 6,94; N 23,39.

Пример 7. б-Изопропиламинопурин-

9-P-D-2, З -дидеоксирибофуранозид.

Синтез 6-изопропиламинопурин-9-P-D2, 3-дидеоксирибофуранозида осуществI I ляют по методике примера 1, за исключением того, что 6-изопропиламинопурин (приготовленный из б-хлоропурина, Sigma

Chemicals. St Louis МО и изопропиламина) растворяют в 5 мл каждого из диметилформамида и диметилсульфоксида.

После лиофилизации, б-изопропиламинопурин-9-P-0-2, 3 -дидеоксирибофураноI зид(0,52 г) анализируют как 0,2 гидрат(т,пл.

55 — 57 С)

Вычислено, %: С 55 58; Н 6,96; N 24,93, С1зН19М02 0,2Н20, Найдено,.%: С 55,54; Н 6,96; N 25,01, Пример 8. Тиамиприн-9 Р-0-2, 3 -диI I деоксирибофуранозид

Тиамиприн (Burroughs Wellcome Со, Research Triangle Park NC) (0,05 г) растворяют в2,,5 мл диметилсульфоксида и 15 мл диме10

20 токсиэтана и смешивают с 3 -диокситимиди-! ном (0,8 г) в 30 мл калийфосфатного буфера с рН 6,8, Прибавляют очищенную тимидинфосфорилазу (1600 м.ед.) и пуриннуклеозидфосфорилазу (70,000 м,ед.) и полученную суспензию перемешивают при 35 С, Через

96 часов реакционную смесь фильтруют и объем сгущают в вакууме до сиропа, Прибавляют воду (25 мл) и раствор выдерживают в течение ночи при 3 С. Преципитат собирают фильтрацией, затем суспендируют в 5 мл диметилформамида и фильтруют.

К фильтрату прибавляют 15 мл метанола, а затем раствор выдерживают при температуре — 20 С. Через 5 дней твердое вещество собирают фильтрованием, растворяют в

65% растворе метанола с водой (no объему) и хроматографируют на гидроксидной смоле AG I X2. Продукт элюируют 65% раствором мета н ол; вода (no объему). После удаления растворителя в вакууме, твердое вещество растворяют в 20 мл смеси хлороформ: метанол (9: 1) и хроматографируют на пластинке из силикагеля (3 х 50 см), доведен25 ной до равновесного состояния смесью хло.роформ:метанол (9: 1 по объему). Продуктсодержащие фракции объединяют и растворитель удаляют в вакууме. Остаточный силикагель выделяют из продукта растворением

30 в 95% растворе этанола с водой(по объему) и фильтруют через 0,22 мкм фильтр, Этанол упаривают, и прибавляют примерно 200 мл воды. Полученную суспензию лиофилизуют с выходом 0,056 г тиамиприн-9 Р-0-2, 1

35 З-дидеоксирибофуранозида, который анализируют как 0,4 гидрат, содержащий 0,7 эквивалентов метанола (т.пл. 130 С, частичное плавление при 110 С), Вычислено, %: С 41,84; Н 4,68; $7,60; N

40 26,55.

С14Н16ЯИВ04 0,4Н20 0,7СН40

Найдено, %: С 41,93; Н 4,43; S 7,48; N

26,34.

Пример 9, 2-Амино-б-н-пропоксипу45 рин-9-P-D-2, 3 -дидеоксирибофурэнозид, i (0,21 г) 2-амина-6-н-пропорксипурина (полученного нуклеофильным замещением хлорной группы в 2-амино-6-хлороприне (Aldrich Chemical Со, Milwaukee Ti) элкок50 сильным анионом при реакции между гидридом натрия и пропанолом и (0,29 r) 3

-деокситимидина соединяют в 100 мл калийфосфатного буфера, рН 6,8, содержащего

0,04% азида калия. Прибавляют очищенную

55 тимидинфосфорилээу (1200 м.ед.) и пуриннуклеозидфосфорилазу (8400 м.ед,) и полученную суспензию перемешивают при

35 С. Через 48 часов реакционную смесь фильтруют, фильтрат хроматографируют на

1779256

40

55 колонке с гидроксильной смолой AG-1-Х2 (2х х 25 см), Полученный продукт элюируют

90 раствором метанола с водой (по объему), Растворитепь удаляют в вакууме, и остаток растворяют в метаноле. Прибавляют

10 мл сухого силикагеля, и метанол удаляют в вакууме, Высушенный силикагель наносят на колонку с силикагелем (2,5 х 30 см), доведенную до равновесного состояния в смеси хлороформ: метанол (9: 1), которая также является растворителем для элюирования.

Фракции, содержащие только целевой продукт,соединяют, а растворитель удаляют в вакууме. Остаточный силикагель удаляют, а продукт высушивают согласно примеру 8

Получают 0,132 г 2-амино-6-н-пропоксипурина-9-P-0-2, 3 — дидеоксирибофуранози! I да, который анализируют как 0,2 гидрат (т,пл, = 70 С);

Вычислено, %; С 52,91; Н 6,56; N 23,73.

С13Н19Й503 0,2Нго

Найдено, %; С 52,52; Н 6,62; N 23,49.

Пример 10, 6-Этилтиопурин-9-,В-D-2, I

3-дидеоксирибофуранозид (5,5 ммоль, 1 г)

6-этилтиопурина, полученного от Sigma

Chemicals Со, St Louis MO (4,47 ммоль) 31деокситимидина, суспендируют в 50 мл 15 мМ калийфосфатного раствора с рН 7,2.

Прибавляют очищенные тимидинфосфорилазу (7890 м.ед,) и пуриннуклеозидфосфорилазу (1980 м.ед.) и суспензию перемешивают при 35 С. Через 144 ч реакционную смесь фильтруют и фильтрат выдерживают при — 20 С. После размораживания фильтрат доводят до рН 10,7 гидроксидом аммония и хроматографируют на колонке со смолой из доуэкса-1-формиата (2,5 х 8 см), Затем элюируют 30% раствором

H ïðîïàíoëà с водой (по объему), Фракции, содержащие продукт объединяют, а растворитель удаляют. Остаток растворяют в 30% растворе н-пропанола с водой (по объему) и хроматографируют на колонке (50 х 30 см) Bio Rad P - 2. Продукт эл юируют из колонки

30% раствором н-пропанола с водой (по объему). Продуктсодержащие фракции объединяют, а растворитель упаривают в вакууме с выходом 0,427 r 6-этилтиопурин9 P-D-2 . 3-дидеоксирибофуранозида, кото1 рый анализируют как 0,5 гидрат, Вычислено, о . С 49,81, Н 5,92; N 19,36;

$11,44.

С1г Н15ЯМ40г 0,5НгО.

Найдено, : С 49,63; Н 5,96: N 19,28; S

11,06.

Данные ЯМР: д 8,71 /с, 1Н, Ha /. 8,67 /с, 1Н, Нг/, 6,33 /тр. 1Н, Н /M. 4,1/, 2Н, ОН, Н4 / 3,4 — 3,6/ м. 2H, 5 CH2/, 1,8 — 2,4/м, 4Н, 2 и 3 СНг/ 1,5 /тр. ЗН, СН3/.

Пример 11, 2-Амино-6-бензилтиопурин-9-ф-0-2, 3 — дидеоксирибофуранозид, I l

2-Амина-6-бензилтиопурин (1,9 ммоль, 0,5 г), полученный от Sigma Chemicals, Со.

St Louis M0, и 3-деокситимидин (2,0 ммоль, 0,543 r) растворяют в 20 мл 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7, содеражащего 0,04% азид калия. Прибавляют очищенные тимидинфосфорилазу (2,000 м.ед.) и пуриннуклеозидфосфорилазу (2,900 м.ед.) и полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через

3 дня прибавляют 80 мл 10 MM калийфосфатного буфера, рН 7. Через день реакционную смесь фильтруют. Полученную лепешку растворяют в 90 растворе метанола с водой (по объему), фильтруют, фильтрат хроматографируют на колонке 2,5 х 10 см с дауэкс-1-гидроксидом. Продукт элюируют из колонки 90 раствором метанола с водой (по объему), Фракции, содержащие продукт, обьединяют и после лиофилизации получают 0,086 г 2-амино-6-бензилтиопурин-9 Р-D-2, 3 -дидеоксифуранозида.

I I

Вычислено, %: С 57,13; Н 5,36; N 19,59;

S 8,97.

С17Н19ЯН50г

Найдено, %: С 57,02; Н 5,39; N 19,51; S

8,89.

Данные ЯМР: д 8,18 / С, 1Н, Hii/ 7,3 /м, 5Н, /, 6,6 /с, 2Н, NH2/, 6,08/ дд, 1Н I /, 4,93

/ шир. 1Н 5 ОН/, 4,45 /шир. 2Н, СНг/, 4,08

/м, 1Н, 4H4 (. 3.43 — 3,65/м. 2Н 5 СН2/

2,35/м, 2Н, 2 СНг/ 2,0 /м, 3 СНг/

Пример 12. 6-Этоксипурин-9-/3-D-2, I

3 -дидеоксирибофуранозид

6-Этоксипурин (3,0 ммоль, 0,5 г Sigma

Chemicals Со, St 1ouis МО)и 3-деокситимидин (3,3 ммоль 0,75 г) суспендируют в 25 мл

10 мМ калийфосфатного буфера с рН 6,8, содержащего 0,04% азид калия. Прибавляют очищенные тимидинфосфорилазу (800 м-.ед,) и пуриннуклеозидфосфорилазу (1200 м.ед.) и полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через 24 часа прибавляют 85 мл 10 MM калийфосфатного буфера, рН 6,8 и реакционную смесь перемешивают в течение 5 дополнительных дней при 35 С.

Выделившийся осадок выделяют фильтрованием и фильтрат хроматографируют на колонке 2,5 х 10 см с дауэкс-1-гидроксидом.

Полученный продукт элюируют 90 раствором метанола с водой (по объему), и фракции, содержащие указанный продукт, объединяют. После удаления растворителя в вакууме растворяют в 30 растворе н-пропанола и воды (по объему) и хроматографируют на колонке со смолой Bio Rad P-2.

1779256

Фракции, содержащие продукт, объединяют и после лиофилиэации получают 0,225 г б-этоксипурин-9-,8-0-2, 3 -дидеоксирибофуI I ранозида, который анализируют 0,15 гидрата, Вычислено, %: C53,68; Н 6,15; N 20,98.

С1з Н17й1502 0,15 Í20 . Найдено, %: С 54,05; Н 6,15; N 20,88.

Данные ЯМР; д 8,6 /с, 1Н, Нв/, 8,5 / с

1Н, Н2/, 6,3 /дд, 1Н, Н1 /, 4,97 / тр. 1Н, 5

ОН/. 4 6 (м, 2 Н.-CH 2-/, 4.1 /м, 1 Н, Н43/. 333

/м, 2Н- 5 СН2/, 2,41 /м, 2Н 2 СН2/, 2,03 /м, 2Н, 3 СН2/, 1,4/тр, ЗН, J = 0,035 Гц, СНз/.

Пример 13. 6-Диметиламинопурин-9P-D-2 . 3 -дидеоксирибофуранозид

6-Диметиламинопурин (6,13 ммоль, 1 r

Sigma Chemicals Со, St Louis МО) и 3-деокситимидин (4,44 ммоль, 1 г) суспендируют в

50 мл 1Р мМ калийфосфатном буфере рН

7,0, содержащего 0,04% азида калия, Прибавляют очищенные тимидинфосфорилазу (2000 м;ед.) и пуриннуклеизидфолсфорилазу (3000 м.ед.) и полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через 120 часов реакционную смесь фильтруют и фильтрат хроматографируют на колонке со смолой из дауэкс-1-гидроксида (2,5 х 8 см)4 используя в качестве элюента 90% раствор метанола и воды (по объему). Фракции, содержащие указанный продукт, обьединяют, а растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 25 мл 30% раствора н-пропанола и воды (по объему) и хроматографируют на колонке со смолой Bio Rad P-2 с водой (по объему). Фракции, содержащие продукт, объединяют, а растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 30 мл деионизованной воды и хроматографируют на колонке с сефадексов 6-10 (5 х 90 cM), В качестве элюента используют воду, Соответствующие фракции объединяют и после лиофилиэации получают 6-диметиламинопурин-9-P-D-2, 3 -дидеоксирибофуранозид, I I который аналИзируют как 0,3 гидрат (т,пл, =

=162 С)

Вычислено, %:С 53,64; Н 6,60; N 26,06

С12Н17Й502 О,ЗН20

Найдено, %: С 53, 63: Н 6,63; N 25,8.

Пример 14. 6-Гидрооксиэтиламинопурин-9-P-D-2, 31-дидеоксирибофуранозид.

6-Гидроксиэтиламинопурин (2,8 ммоль, 0,5 г, Sigma Chemicals Со, St Louis МО) и

3-деокситимидин (3,30 ммоль, 0,76 г) суспендируют в 75 мл 10 мМ калийфосфатного буфера, рН 6,8. содержащего 0,04% азида калия, Прибавляют очищенные тимидинфосфоридазу (400 м.ед,) и пуриннуклеозидфасфорилазу (700 м.ед.) и полученную суспензию перемешивают при 35 С, Через

8 дней добавляют 600 м.ед. тимидинфосфо10 рилазы и 1050 м.ед. пуриннуклеозидфосфорилазы, Через день реакционную смесь фильтруют и фильтрат наносят на колонку

2,5 х 10 см, с дауэкс-1-гидроксидом, Указанный продукт элюируют метанолом. Фракции, содержащие продукт, объединяют и упаривают в вакууме, Остаток затем наносят на колонку 2,5 х 50 см с силикагелем и элюируют под давлением смесью хлороформ;метанол (8: 2). Фракции, содержащие продукт, объединяют и после лиофилизации получают 6-гидроксиэтиламинопурин-9 /1D-2, 3 -дидеоксирибофуранозид, который

I анализируют как 0,65 гидрат (т.пл, = 153 С), 15, Вычислено, %: С 49,53; Н 6,34; N 24,7.

С12Н17К405 0,65Н20

Найдено, %: С 49,83; Н 6,07; N 23,7.

Пример 15. б-Циклопропиламинопурин-9-/3-0-2, 3 -дидезоксирибофуранозид.

I I

20 б-Циклопропиламинопурин (полученный из б-хлоропурина (Sigma Chemicals Со, St Louis МО) и циклопропиламина) (2,86 ммоль, 0,5 r) и 3-деокситимидин (4,30 ммоль, 1 г) растворяют в 10 мл смеси диметилсуль25 фоксид: N, N-диметилформамид (1: 1) и далее разбавляют 30 мл 10 мМ калийфосфатного буфера с рН 6,8. содержащего

0,04% азида калия. Прибавляют тимидинфосфорилазу (10,000 м,е.) и пуриннук30 леозидфосфорилазу (20,000 м.ед,), абсорбируемые в 10 мл ОЕАЕ-смолы (Whatman), и полученную суспензию перемешивают при 35 С, Через 8 ч реакционную смесь фильтруют, и затем фильтрат наносят

35 на систему иэ сопряженных колонок, Первая колонка заполнена дауэкс-1- гидроксидом (2,5 х 10), в то время как вторая колонка содержит амберлитовую смолу XAD-2 (2,5 х х20). После нанесения образца колонки про40 мывают большим объемом воды и полученн ый продукт эл юируют метанолом.

Фракции, Содержащие укаэанный продукт, соединяют и после лиофилизации получают

0 54 г б-циклопропиламинопурин-9ф-0-2, l

45 3 -дидеоксирибофуранозид, который аналиl зируют как 0,55 гидрат (т.пл, 63 — 65 С).

Вычислено, %: С 54,75; Н 6,40; N 24,55.

С1зН171ч202 0,55H20

Найдено, %: С 54 67; Н 6,43; N 24,57.

50 Пример 16. 6-Циклопропиламинопурин-9-Р-D-2, 3 -дидеоксирибофуранозид, I 1 б-Циклопентиламинопурин (полученный из 6-хлоропурина Sigma Chemicals, St

Louis MO v циклопентамиламина) (2,49 ммоль,1

55 0,56 r) растворяют в 5 мл N, N-диметилформамида и 5 мл диметилсульфоксида. Прибавляют 3-деокситимидина (3,94 ммоль, 0,894 г)

I вместе с 30 мл 10 м М калийфосфатного буфера, рН 6,8, содержащего 0,04% азида

1779256

10

20

30

55 калия. Уксусной кислотой рН доводят до 6,8.

К реакционной смеси прибавляют очищенные тимидинфосфорилазу (10,000 ед.) и пуриннуклеозидфосфорилазу (20,000 м.ед,), соединенные с DEAE-целлюлозой(М/па1гпап).

Полученную суспензию перемешивают при

35 С в течение 8 ч, фильтруют и фильтрат выдерживают при 20 С в течение ночи.

После оттаивания фильтрат наносят на колонку 2,5 х 10, наполненную дауэкс-1-гидроксидной смолой. Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие продукт, объединяют и хроматографируют на колонке, содержащей смолу XAD-2 (2,5 — 20 см).

Затем продукт элюируют 350 мл воды, а далее метанолом, Фракции, содержащие продукт, растворяют в воде и после лиофилизования получают 0,459 r 6-циклопентиламинопурин-2;3 -дидео ксирибофура нозида, который анализируют в виде 0,05 гидрата (т.пл. = 88 С), Вычислено, %: С 59,21; Н 6,99; N 23,02.

С15Н21Й502 0,05Н20

Найдено, %: С 59.24; Н 7,05; N 22,95.

Пример 17, 2-Амино-6-метоксипурин9-P-D-2, 3 -дидеоксирибофура нозид.

I I

2-Амино-6-метоксипурин (3,0 ммоль, 0,5

r полученного из 2-амино-б-хлорпурина (Aldrich Chemical Со, Milwaukee W) и мета. нола), и 3-деокситимидин (4,50 ммоль, 1 г) растворяют в 10 мл смеси диметилсульфоксид 11,11-диметилформамид 1: 1 с последующим разбавлением 30 мл 10 MM калийфосфатного буфера с рН 6,8, содержащего 0,04% амида калия. К реакционной смеси прибавляют очищенные тимидинфосфорилазу (10,000 м.ед.) и пуриннуклеозидфосфорилазу (20,000 м,ед.), абсорбируемые на 10 мл DEAE-смоле, и полученную суспензию перемешивают при 35 С. Через 8 ч реакционную смесь фильтруют и фильтрат наносят на колонку 2,5 х 10 см, содержащую доуэкс — 1-гидроксид. Фракции, содержащие продукт, сгущают и доводят до объема

70 мл. Указанную пробу наносят на колонку

2,5 х 20 см, заполненную амберлитовой смолой XAD-2. Колонку промывают большим объемом воды, а продукт элюируют метанолом. Фракции, содержащие продукт, объединяют и после лиофилизования получают

2-амино-б-метоксипурин-9ф-D-2, 3 -дидеI I оксирибофуранозида.

Вычислено, %: С 49.81; Н 5,70; N 26,40;

C11H15N50;>

Найдено, %: С 49,70; Н 5,72; N 26,34.

П 1 и м е р 18. 6-н-Пропоксипурин-9-j30-2, 3 — дидеоксирибофуранозид.

I б-н-Пропоксипурин (0,5 г, 2,8 ммоль

Sigma Chemicals Со, St Louis МО) и 3-деокситимидин (0,96 г, 4,2 ммоль). ра<. наояю в

5 мл диметилсульфоксида и 5 мл N, N-диметилформамида, В реакционную смесь прибавляют 30 мл MM калийфосфатного буфера, рН 6,8,содержащего 0,04% азида калия, и очищенные тимидинфосфорилазу (10,000 м.ед,) и