Способ получения внеклеточной перекисной дисмутазы человека

Способ получения внеклеточной перекисной дисмутазы человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , биохимия и способы получения перекисной дисмутазы. Сущность изобретения: способ заключается в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рРЗЗ- нео-18, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий внеклеточную дисмутазу, трансформируют полученной ДНК линии клеток СНО, культивируют трансформированные клетки с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s С 12 N 15/53

Э;.г

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (1, 4 ,, О ) ,о () (21) 4202612/13 (86) PCT/0К 86/00098 (02.09,86) (22) 30.04,87 (31) 4027/85 (32) 03.09.85 (33) 0К (46) 30.11.92, Бюл, ¹ 44 (71) Симбиком Актиеболаг (СН) (72) Стефан Марклунд и Томас Эдлунд (SE) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ В НЕ КЛЕТОЧНОЙ

ПЕРЕКИСНОЙ ДИСМУТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к способам получения перекисной дисмутазы и ее. использованию для терапевтического лечения.

Некоторые соединения имеют тенденцию к самоокислению. Все процессы самоокисления приводят к образованию токсичных промежуточных соединений восстановлен (я кислорода, Самоокисление адреналина, пирогаллола и других соединений приводит к образованию перекисного радикала. Небольшая часть восстановления кислорода в митохондриях приводит к образованию перекиси, а в дальнейшем — перекиси водорода, Микросомная цитохромная P4so — система также высвобождает высший окисел.

Перекись водорода образуется всегда, когда образуется высший окисел в результате реакции дисмутации. Большинство оксидаз в организме непосредственно восстанавливает кислород в перекись водорода.

Ионизирующее излучение расщепляет воду с образованием атомов водорода и гидроксильных радикалов. Образующиеся та5&„„1779263 А3 (57) Использование; генетическая инженерия, биохимия и способы получения перекисной дисмутазы. Сущность изобретения: способ заключается в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPS3нео-18, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий .внеклеточную дисмутазу, трансформируют полученной ДНК линии клеток СНО, культивируют трансформированные клетки с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 1 табл, ким образом.гидроксильные радикалы характерны для большей. части биологических опасностей, к которым приводит ионизирующее излучение.

В системе оксидазы ксантина, например, образуется не только высший окисел, но также перекись водорода, как непосредственно, так и в результате дисмутации высшего оксида. Эти соединения могут затем взаимодействовать с образованием гидроксильного радикала. Система оксидазы ксантина повреждает протеин ы. углеводы и нуклеиновые кислоты, а также убивает клетки, Из биохимических соединений полиненасыщенные липиды оказываются наиболее чувствительными к токсичному воздействию кислорода, Промежуточные соединения кислорода могут инициировать цепные реакции, включающие молекулярный кислород, так называемое окисление липида в перекисное соединение. Гидроперекиси липидов, образующиеся таким образом, и продукты их разложения не только наносят ущерб функциям клеточных мемб1779263 ран, но могут также повреждать другие компоненты клеток.

Организмы, живущие в присутствии кислорода, были вынуждены в процессе эволюции создать несколько защитных механизмов против токсичных метаболитов восстановления кислорода. К защитным факторам относятся дисмутазы высших окислов (ДВО), которые подвергают дисмутации радикал высшего окисла, и содержатся в относительно. постоянных количествах в клетках ткани млекопитающих. Самым известным из этих ферментов является ДВОСи2п, который является димером с молекулярным весом 33000, содержащим два атома меди и два атома цинка. ДВОCuZn обнаружен в цитозоле и в межмембранном промежутке митохондрин. ДВО-Мп является тетрамером с молекулярным весом 85000, содержащим 4 атома Мп, и он сосредоточен главным образом в митохондриальной матрице. До последнего времени предполагали, что внеклеточные жидкости не обладают ДВО-активностью.

Недавно. установлено присутствие дисмутазы высшего окисла во внеклеточной жидкости (например, плазме крови, лимфе, синовиальной жидкости и цереброспинальной жидкости), которая была названа ECSOD (ВК-ДВО), внеклеточная дисмутаза высшего окисла), У человека активность на мл плазмы составляет менее 17; от общей

ДВО-активности на г ткани, но она видимо активно регулируется организмом. Сходство с лектинами указывает на то, что в отличие от ДВО CuZn этот фермент является гликопротеином, Он видимо состоит из четырех равных нековалентно связанных субъединиц с общим (тетрамерным) молекулярным весом 135000 с содержанием металлов: один атом Си и один атом 2п на одну субъединицу. Фермент катализирует дисмутацию первого порядка радикала высшего окисла, как это делают другие ДВО, содержащие Си. ,дво

Ог . + Ог . + 2Н - Ог+ НгО

Удельная активность является очень высокой и, видимо, объясняется наличием четырех атомов Си в молекуле. При хроматографии на гепарин-Сефарозе этот фермент разделяется на три фракции, А— без какого-либо средства,  — со слабым сродством и С вЂ” с сильным сродством относительно гепарина, В отличие от поведения

ВК-ДВО, ДВО-CuZn и ДВО-Мп не связываются с гепарин-Сефарозой. Этот фермент обладает определенным гидрофобным характером, который может указывать на сродство с клеточными мембранами, Сродство с гепарином часто указывает на сродство с сульфатом гепарина, который содержится на поверхности клетки., в частности, на эндотелии кровеносных сосудов, Следовательно, можно предположить, что ВКДВО частично локализована на поверхности клеток. а частично во внеклеточных жидкостях. Аминокислотный состав и антигенная активность совершенно не похожи на те же показатели исследованных ранее

ДBO-изоферментов, Информационная

РНК, кодирующая ВК-ДВО, содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, что указывает на то, что

ВК-ДВО является секретируемым протеином, и РНК, кодирующая ДВО-CuZn, с другой стороны, не содержит такую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, Кроме того, аминокислотная последовательность ВК-ДВО отличается от аминокислотной последовательности других ДВО-изоферментов; как было установлено, ВК-ДВО содержитя в плазме всех исследованных видов млекопитающих, а также у птиц и рыб, Содержание варьирует в широких пределах от вида к виду, но внутривидовые вариации очень незначительны.

B плазме грызуна содержится в 10 — 20 раз больше ВК-ДВО, чем в плазме человека, в которой содержится сравнительно мало ВКДВО, ВК-ДВО был также обнаружен во всех типах исследованной ткани животного. В тканях внутривидовые различия значительно слабее, Концентрация ВК-ДВО в тканях (единиц на грамм влажного веса) выше, чем концентрация ВК-ДВО в плазме (единиц/мл) у человека, У грызунов ткань и плазма содержат приблизительно равные количества В К-ДВО.

Активность ДВО делает их интересными кандидатами на использование в качестве терапевтических агентов с целью подавления токсичных эффектов высших окислов и других кислородных радикалов.

Ввиду вышеупомянутой низкой концентрации ДВО-активности во внеклеточных жидкостях, компоненты во внеклеточной жидкости и поверхности клеток являются наименее защищенными против радикалов высших окислов и других токсичных продуктов восстановления кислорода по сравне55

50 нию с .внутренностью клетки. Таким образом, ВК-ДВО образует особенно интересный продукт для терапевтических применений в связи с внеклеточным образованием радикалов высших окислов.

Важным аспектом изобретения является то, что оно относится к ВК-ДВО рекомбинантного происхождения.

1779?83

ДН К-последовательность, кодирующая Изобретение относится к способно>iу

ВК-ДВО, или ее модификации или произ- репликации вектору экспрессии, которыи водные, как они были определены выше, содержит ДНК-последовательностл.;одиможет иметь природу комплементарной рующую ВК-ДВО, Непосредственно вниз ог

ДНК(кДНК), т, е. она может быть "сконстру- 5 этой последовательности {последовательирована" при помощи образования кДНК- ности, кодирующей ВК-ДВО) может содербиблиотеки на основе иРНК из клеток, жаться последовательность кодирующая продуцирующих ВК-ДВО, посредством из- сигнальный пептид, присутствие которого вестных стандартных приемов и векторов. гарантирует секретирование ВК-ДВО, эк—

Эксперименты с гибридизацией могут быть 10 прессированной клеткой-хозяина. в котозатемосуществленысиспользованиемсин- рую был введен вектор. Сигнальной тетических олигонуклеотидов в качестве последовательностью может быть. напризондов с тем, чтобы идентифицировать мер, следующая последовательность: кДН К-последовательность, кодирующую . ВК-ДВО. В качестве альтернативы ДНК-по- 15 -18 -10 -1 следовательность может носить геномную MetLeuAlaLeuCyserCysLevLevLe+laAl природу, то есть, она может быть получена aGlyAlaSerAspAla непосредственно из клеточного генома, на- ATGCTGGCGCTACTGTGTTCCTGCCTG пример, при помощи отбора геномных по- CTCCTGTGCAGCCGGTGCCTCSGACGCC следовательностей, гибридизирующихся с 20 TAGGACCGCGATGACACAAGGACGGA

ДНК-зондом, полученным на основе полной CTGACCACCGTCGGCCACGAAGCCYTGGG или частичной амнокислотной последова- 120 тельности ВК-ДВО, Для терапевтических Эта сигнальная последовательность соцелей предпочтительным вариантом явля- ставляет предмет настоящего изобретения ется ДНК-последовательность ВК-ДВО че- 25 и предполагается, что она может быть вставловеческого происхождения с тем, чтобы лена в направлении вниз от ДНК-последоизбежать неблагоприятных иммунных реак- вательностей, кодирую щих другие протеины или пептиды с тем, чтобы обеспеДНК-последовательность может также чить секретирование полученных в резульиметь синтетическую природу. ДНК-после- 30 тате продуктов из клеток, довательность может быть смешанной, синтетической и геномной природы, Такой линией клеток является СНОсмешанной геномной и кДНК природы, или К1/pPS Зпео-18, которая сдана 27 августа смешаннойкДНКисинтетическойприроды, 1986 г. в Европейское Собрание Культур полученнойлигированиемДНК-фрагментов 35 Клеток Животных под шифром хранения кДНК, геномной или синтетической приро- . ЕСАСС 86082701. ды (в зависимости от необходимости), причем ДНК-фрагменты содержат часть гена, Изобретение относится также к ДНКкодирующего ВК-ДВО, эти процедуры вы- фрагменту, который кодирует ВК-ДВО и полняются при помощи стандартных при- 40 который содержит следующую ДНК-послеемов. довательность:

-18 -10

Ие1ЬеиА1а1euLeuCycse r Cya LeuLeuLeuAl aAl a61 yAl ase гЯн р

АтастаасостястстоттсстасстостсстаасАоссаотосстсаоАС тАссАссасОАтаАсАсААООАссСАс6АООАссотса6ссАс66Асссто

-I +1 10 120

AleT tTht6 . 6luAs setAle61 uptoAeesetAs setAle6luTt tleAt Авр ,QCCTGGACGGGCGAGGACTCG6CGGAGCCCAACTCTGACTCGGC66АОТ6САТССОЯСАС

C6GACCTGCCCGCTCCTGA6CC6CCTCGGGTTGAGACTGAGCCGCCTÑÀÑÑÒÀG6ÑTÑT6

20 30

АЕГТТГА|ЕАТВРВ1ТАГ61и11ЕТГ 61661НЧВ|АЕГ61ВАГ АГ АВ АВРАВРБ .Х

АтстАссссААООтсАсоаАОАтстсссАООАсотсАтосАососсооаАсоАссАсоас

ТАСАТОСООТТССАОТСССТСТАОАССОТССТССЯОТЯCGTCGCCGCÑÑÒ6ÑTGÑTGCCG

40 50

ThrLeuHf sAlaAlacysGlnvaI6InproserAIaThrLeuAspAlaл1ас1лРгoArg

АсастссАссссссстассАООтссАОссатсаоссАссстссясассасссясссссса

TGCGAGGTGCGGCGGACGGTCCACGTCGGCAGCCGGTGCGACCTGCGаCGCGTCGGGGC

3ОО

60 70 вг :в г ..

ОТОАССОССОТССТССТСТТССООСАОСТТОСОССССасосслАССтСGACGC rr . сАстсоссосАссАООАОААООссотсОААсосасоасасааттсаАастосоадАСА о

7 1779263 8

Во 90 д аСеинтииттвнеесотНси1ивсоавовесвесаесас атастентвив1нсsGlll ассстаалаааСттСССОАССОАОССОААСАОСТССАОСсасасСАТСCACQT CACCAG

CU60hCCTCCCGhA66QCTGGCTCGGCTTGTC0hG6TCGGC6CGGTAааТОСАС0тО6тС

100 110

420 сии

TTc66GGAccT6AGcch0GGcT6cchGTcchcc66 сссслстлсллсссастаассатс лласссстаалстсаатсссалсастслаатаасссоаоаталтоттооосалссоаслс

480

120 110

ProHlapro01nHiaPro01yAspPbeGlyAsnPheAiaY®1Лг hs Gl SerLeuTr ссослсссослослсссаоосалсттсаосАА ттсосоотссосолсаасласстстаа

GGCGTGGGCGTCGTGG0CCCGCTGAA6CCGTTGAAQCGCCAGGCGCTОCC6TC6ОAОАCC

540

140 150 rTyrAr А1аа1 ЬеиЛ1ал1еБегЬеиЛ1аа1 troHlввег11ече101 ArgAla

Аоатлссасоссаасстаассосстсастсасааосссаслстсслтсатааассоаосс тсслтаасасаассоалссоосааласаласасссаоасоталаотласлсссаасссаа

600

160 170

ValVaIvelHishls6lyGluhcphspLeu0IyhrgGIyGlyAsn6lnAlaserval0Iu

ОТООТСОТССАСОСТООСОАООАСОАССТОООССОСООСООСААССЛООССАОСатааЛО

CACCAGCAGGTQCGACCGCTCCTGCTGGACCCQQCGCCGCCGTTGGTCСО0ТС6САССТС бб0

180 190

Авп01УАвпЛ1в01улвдЛгд елА1ас вс sualVa101 alC ваl ProGlyLeu, AAcQGGAAcGcQGGccQ6cGGcTGGccTGcT6c таатооосототбс сссбоостс ттосссттасасссооссоссолссоалсолсаслсслсссослслсосссоаасссало

730

200 --:: 210

ТrpGluAr 961ПА1алr g0luH i i 8 Е r01uAr gт уВ 1уВЛГghr ghr gQlu8e r 03 иСуа таааласасслаососооалослстслаласо".Алоллосаасаососалаласалатас

ACCCTCGCQGTCCGCQCCCTC6TGA0TCTCGCGTTCTTCGCCQCCQCGCTCTCGCTCACО

Ly.вА1вЛl а . е е

Алаассосстал туссаасоалст

Необходимо отметить, что эта последовательность включает кодирующую последовательность сигнального пептида, приведенную выше. Сигнальная последовательность простирается от акинокислоты—

18 до -1. Последовательность, кодирующая зрелый ВК-ДВО, начинается в аминокислоте +1.

Клетки, продуцирующие ВК-ДВО, могут быть идентифицированы иммуногистохимическим способом с использованием антител, направленных против ВК-ДВО или при помощи анализа на секретирование. ВКДВО в.среду, в которой культивируют специфичные клетки.

Как уже было упомянуто выше, ВК-ДВО проявляет сродство с гепарином, что указывает на сродство с сульфатом гепарина, или другими гепариноподобными глюкозоиминоглюканами, содержащимися на поверхности клетки. в частности, на поверхности клеток эндотелия, Таким образом, имеет смысл индуцировать высвобожденсие ВКДВО с поверхностей клеток и тем самым обеспечить улучшенный выход ВК-ДВО выращиванием клеток в среде, содержащей гепарин или гепариновый аналог.

ДН К-фрагмент, содержащий ДН К-по, следовательность, кодирующую ВК-ДВО, 5 вставляют в вектор, который вводят в клетку-хозяина, которую затем выращивают на соответствующей среде при подходящих условиях с целью осуществления экспрессии

ВК-ДВО, далее ВК-ДВО изолируют. Средой, 10 которую используют для выращивания клеток, может быть любая известная среда, пригодная для этой цели, но в нее обходимо добавить Си и/или Zn, ВК-ДВО, экспрессированная клетками, может секретировать15 ся, то есть проходить через клеточные мембраны, в зависимости от типа клетки и состава вектора, Если BK-ДВО продуцируется внутри клетки, то есть не секретируется клеткой, то она может быть выделена с ис20 пользованием стандартных приемов, включающих разрушение клеток механическими средствами, например, с использованием ультразвука или гомогенизации, или при помощи ферментных или химических средств

25 с последующей очисткой, 1779263

10

20

30

50

Для того, чтобы обеспечить секретирование, ДНК-последовательность, кодирующая ВК-ДВО, должна предваряться последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, присутствие которого обеспечивает секретирование ВК-ДВО из клеток так, что по крайней мере значительная часть ВК-ДВО, экспрессированной в клетке, секретируется в культуральную среду и в дальнейшем может быть извлечена оттуда. Экспериментально было установлено, что часть секретированной ВК-ДВО содержится в среде, а часть ВК-ДВО присутствует на поверхности клеток. Таким образом, выражение "секретированный в культуральную среду" включает любой перенос ВК-ДВО через клеточную мембрану, заканчивается ли он в культуральной среде или на поверхности клетки. BK-ДВО может быть извлечен иэ среды при помощи стандартных приемов, содержащих фильтрацию клеток и изоляцию секретированного протеина.

Очистка ВК-ДВО возможна с помощью антител, которые используют для хроматографии по принципу сродства, Антитела могут быть либо поRèклонàRüíûми, либо моноклональными антителами, Предпочтительными в настоящее время являются моноклональные антитела, так как большая часть моноклональных антител, как было установлено, связывается с антигеном более слабо, чем смесь поликлональных тел, иэ чего следует, что десорбция может быть осуществлена при умеренных условиях с использованием слабых элементов.

Кроме того, так как все lg6 должны быть направлены против ВК-ДВР, гораздо меньшие количества матрицы антител надо будет использовать для адсорбции ВК-ВДО из биологического материала. Десорбция ВКДВО потребует меньшие объемы элюента. что упрощает процедуры элюирования, которые в настоящее время весьма трудоемки из-за больших объемов элюента, необходимых для проведения десорбции.

Специфичность моноклональных антител относительно ВК-ДВО видимо выше, чем специфичность поликлональных антител. Элюат, таким образом, будет более чистым, что означает исключение одной или нескольких последующих стадий очистки.

Это означает. что процедура получения будет упрощена, а выход будет выше для ВКДВО, что представляет собой важное экономическое преимущество, В большинстве случаев, особенно, когда используют поликлональные антитела для очистки BK-ДВО, собранный элюат может быть абсорбирован на ионообменной матрице с последующим элюированием RKДВО-активности и сбором фракций, содержащих ВК-ДВО-активность. Последующая очистка собранного элюата может быть осуществлена при помощи нанесения его на хроматографическую колонку с матрицей, содержащей гепарин или гепариновый аналог, например, сульфат гепарина или любой другой сульфатированный глюкозоаминогликан, сульфат декстрана или другое, сильно отрицательно заряженное соединение, и последующего элюирования; далее собирают фракции, обладающие сродством с анализируемым материалом.

Изобретение относится к использованию ВК-ДВО с целью диагностики, профилактики или лечения заболеваний или нарушений, связанных с присутствием или образованием радикалов высших окислов, или других токсичных промежуточных соединений кислорода, образующихся из радикалов высших окислов.

Примерами таких заболеваний или нарушений могут служить ишемия, инфаркт миокарда, почки, мозга или инфаркт кишечника. воспалительные заболевания, такие как ревматический артрит, панкреатит, в частности, острый панкреатит, пиелонефриты и другие типы нефритов, и гепатиты, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет {инсулиновой природы), рассеянный склероз, жировая эмболия, расстройство дыхательной системы у взрослых, нарушение дыхательной системы у детей, кровоизлияния в мозг у новорожденных, ожоги, разрушающее воздействие ионизирующего излучения и канцерогенез, Таким образом, ВК-ДВО может найти по существу такое же применение, что и

CuZn — ДВО, терапевтическая активность которой изучена более подробно и обсуждается ниже, Однако, было установлено, что ВК-ДВО обладает несколькими свойствами, которые, как предполагается, делают ее особенно эффективной в терапевтических приложениях, CuZn — ДВО имеет низкий молекулярный вес {33000), что приводит к тому, что она быстро выводится из организма в результате фильтрации в клубочке в почках так. что в человеческом организме этот фермент имеет период полураспада примерно

20-30 минут. Предварительные эксперименты с ВК вЂ” ДВО неожиданным образом показали значительно более продолжительное время полураспада для ВК-ДВО, H,íÿстоящее время этот факт частично обьясняется высоким молекулярным весом ВК-ДBO. равным 135000, который препятствует ее

1779263

12 выделению из организма в результате фильтрации в клубочке, а частично, тем, что ВКДВО, видимо, связывается с поверхностями .эндотелия клеток, о чем речь пойдет ниже, При терапевтическом применении ВК-ДВО этот фермент имеет время полураспада в человеческом организме не менее 4 часов, а возможно и больше.

ВК-ДВО является в случае своего нативного окружения секретированным протеином и, таким образом, весьма правдоподобно, что он синтезируется для выполнения функций во внеклеточном пространстве (во внеклеточной жидкости или на поверхностях клеток), которые и позволяют ему проявлять свойства, которые особенно хорошо приспособлены для защиты компонент плазмы или внешней поверхности клеток от токсичных воздействий радикалов высших окислов или других радикалов кислорода. Эта точка зрения подтверждается, например, тем, что ВК-ДВО имеет слабо гидрофобный характер, который способствует ее связыванию с внешней поверхностью клеток. а тот факт, что этот фермент проявляет сродство с гепарином, указывает на сродство с сульфатом гепарина, который обнаружен на внешней поверхности клеток, Таким образом, оба эти свойства указывают на способность защищать ткань, см. примеры, в которых результаты подтверждают связывание ВК-ДВО с эндотелием кровеносных сосудов, ДВО-активность в терапевтических приложениях была подтверждена для следующих заболеваний или нарушений, При парентеральном применении

CUZn-ДВО проявлял активность в качестве противовоспалительного агента в ряде животных моделей воспалительных процессов, а также при воспалительных заболеваниях животных, У человека положительные эффекты ДВО были отмечены при ревматическом артрите и артрозах, при воспалении мочевого пузыря и других урологических заболеваниях, а также при осложнениях, вызванных в результате лечения ионизирующим излучением. В некоторых странах бычья CuZn — ДВО зарегистрирована в качестве лекарственного препарата (Орготеин, Пероксинорм), который используют главным образом для лечения артритов и артрозов, при этом композицию применяют внутрь суставов.

При парентеральном применении

CuZn-ДВО не воспринимается клеткой.

CuZn — ДВО, заключенная в липосомы, воспринимается клетками. Была подтверждена ее эффективно:ть против заболевания Крона, заболевания Бечета, язвенных колитов, заболевания Ковальского и нежелательных эффектов радиационной терапии. Механизм противовоспалительной активности

CuZn — ДВО не совсем ясен, Прямая защита от кислородных радикалов, продуцируемых активированными лейкоцитами, была выдвинута в качестве гипотезы, Другая возможность заключается в предотвращении образования сильно хемотактических мате10 риалов, вызванного перекисями, Другой областью применения ДВО является его использование в качестве защитного фактора против разрушения ткани, вызванного ишемией с последующим восстановлением кровотока. Если прерывается подача крови к ткани, то ткань медленно будет превращаться в некротическую. Макро- и микроскопический процесс разрушения в общем случае будет развиваться медленно, в течение нескольких часов. Если кроваток восстанавливается в ткани, например, через 1 ч, то вместо улучшения будет наблюдаться очень сильное ускорение разрушения ткани. Наиболее вероятно, имеется несколько причин для называемого пародокса восстановления кровотока, но кислородные радикалы, которые образуются в результате повторного появления кислорода в ранее ишемической ткани, вносят

25 свой вклад в это разрушение, Так как такие

30 радикалы являются в высшей степени короткоживущими и, следовательно, их трудно изучать непосредственно, их образование и воздействие могут быть проанализированы на основании защитного

35 воздействия различных "пожирателей". Защита тканей была подтверждена в моделях восстановления кровотока при ишемии или аноксии в почке, Результаты относительно ишемии и последующего восстановления кровотока

40 имеют потенциально важные клинические приложения. Может быть получен исключительно хороший эффект восстановления

45 кровотока в ткани в связи с инфарктами сердца в результате сопутствующего применения ДВО и/или других защитных факторов против кислородных радикалов и тромболитических факторов, например что ее можно испольэовать в связи с хирургией сердца и трансплантацией сердца, Аналогичным образом результаты применения ДВО в связи с ишемией почек с последующим восстановлением кровотока могут

55 быть использованы в связи с трансплантацией почек и трансплантацией других opraнов таких. как кожа, легкие, печень или поджелудочная железа. Заболевание ише50 плазминогенного активатора ткани. Результаты экспериментов с ДВО указывают на то, 13

1779263

5

20

30

40

50 мия головного мозга является еще одним возможным применением.

ДВО обладают также другйми интересными защитными эффектами в связи с другими патологическими заболеваниями, Например, панкреатит был вызван в поджелудочной железе собаки тремя различными путями: вливание олеиновой кислоты, частичная закупорка выводного протока и ишемия с последующим восстановлением кровотока. Было установлено. что ДВО, каталаза и ДВО+ каталаза оказывают защитное воздействие, но в общем случае наиболее эффективным оказывается комбинированное лечение. Эти результаты указывают на возможность активной терапии против этого заболевания, для которого в настоящее время не существует специальной терапии, Было установлено, что лечение с использованием ДВО является эффективным также при ожогах.

Парентеральное применение Cu2n—

ДВО предотвращает бронхолегочную дисплазию у преждевременно рожденных детей, страдающих от младенческих нарушений дыхательной системы.

В моделях с щенками гончей собаки было отмечено, что инъекция ДВО уменьшает частоту внутрижелудочн ых кровоизлияний головного мозга с последующим снижением кровяного давления.

ДВО улучшает состояние крыс, страдающих гепатитом, Острое сильное увеличение кровяного давления приводит к функциональным и морфологическим нарушениям в артериолах головного мозга. Ингибиторы синтеза простагландинов и дисмутаза высших окислов предназначены для защиты против таких нарушений, Детальный анализ этой модели приводит к заключению, что радикалы высших окислов образуются в качестве побочных продуктов в процессе синтеза простагландинов, Эти результаты наводят на мысль, что повреждение тканей. вызванное радикалами высших окислов, которые высвобождаются в процессе синтеза простагландинов, может иметь место в других патологических ситуациях, и что ДВО может осуществлять защитное действие.

При различных типах аутоиммунных заболеваний таких, как системный склероз и ревматический артрит. была отмечена более высокая частота хромосомных повреждений в лимфоцитах. Фибробластные культуры и прямые препараты костного мозга также иногда обладают более высокой частотой повреждений, Неопластическая трансформация клеток в общем случае разбивается на две фазы, а именно, на инициирование и последующее развитие. В лабораторных моделях, когда инициирование осуществляли при помощи ионизирующего излучения, блеомицина, мизонидазола и других нитроимидазолов, онкогенную трансформацию эффективно ингибируют при помощи введения в среду ДВО. Причем нет необходимости в присутствии ДВО в процессе воздействия инициирующих материалов, что видимо указывает на то, что фермент ингибирует последующую стадию развития, Нетоксичные дозы ксантина + оксидаэы ксантина вызывают рост клеток, Добавление ДВО или ДВО + каталаэы ингибирует этот эффект, В модели, в которой кожные опухоли вызывали бензантраценом с последующим применением форболового сложного эфира (TPA), при помощи локальной обработки липофильным комплексом меди с ДВО-активностью значительно снижали образование опухоли, Этот результат указывает на то, что по крайней мере в некоторых случаях радикалы высших окислов участвуют в образовании опухоли и что ДВО может осуществлять защиту против такого действия, Есть основания предполагать, что кислородные радикалы участвуют в неблагоприятных воздействиях токсичных материалов таких, как блеомицин, адриамицин, аллоксан, б-гидродопамин, паракват, дигидрофумаровая кислота, нитрофурантоин и стрепотозотоцин. В тех случаях, когда образование радикалов имеет место во внеклеточном пространстве, зто пространство может быть защищено при помощи инъекции защитного фермента. Так ДВО может защищать против диабетогенной активности аллоксана в лабораторных условиях и в живом организме. Таким образом, разрушающее воздействие аллоксана, видимо, осуществляется через воздействие радикалов высших окислов или других кислородных радикалов, полученных из него; Причина высокой чувствительности р -клеток к аллоксану не совсем ясна и можно только предполагать, что имеется какая-либо связь между чувствительностью к аллоксану и тяжестью заболевания сахарным диабетом (инсулинового типа). При сахарном диабете существуют инфильтрация в островках Лагерганса под воздействием воспаленных клеток, которые потенциально могут образовывать кислородные радикалы, Поэтому можно подположить. что защита -клеток при по1779263

16 мощи инъекций ДВО является первым шагом в борьбе с сахарным диабетом, В общем случае CuZn-ДВО использовали в качестве испытываемого материала в экспериментах, которые были описаны выше. Однако можно предположить, что ВКДВО можно использовать для тех же целей.

Ранее было установлено, что ее можно использовать.с более высокой эффективностью благодаря ее специфичным свойствам, которые делают ВК-ДВО особенно притягательной для внеклеточного применения, Пример 1. Получение гомогенатов пупочного канатика, Человеческие пупочные канатики собирали в палате для рожениц в госпитале

Университета в Умеа, Их хранили в холодильнике в палате, а затем быстро замораживали в лаборатории при температуре

-80 С и хранили при температуре -30 С, После оттаивания пупочные канатики измельчали, суспендировали в 50 мл буфера фосфата калия, рН 7,4, содержащего 0,3 M

КВч, 3 MM диэтилентриаминпентэуксусной кислоты (ДТП К), 100000 м ед/д тразилола (апротинииа) и 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), Использовали 4 л буфера на кг пупочных канатиков.. Для увеличения экстрагирования ВК-ДВО из ткани (примерно в 3 раза) использовали хэ. отропную увеличивающую диффузию соль

КВч. ДТПК, тразилол и ФМСФ добавляли с тем, чтобы ингибировать протеазы. Эту суспензию в дальнейшем подвергали гомогенизации, обрабатывали ультразвуком, встряхивали при температуре 4 С в течение

1 часа. Полученные в результате гомогенаты подвергали центрифугированию (6000xg, 20 мин), а верхние слои быстро замораживали при температуре -80 С, хранили при температуре -30 С.

Пример 2, Получение и очистка

ВК-ДВО легких человека, Извлекали легкие человека в течение 24 ч после смерти при помощи вскрытия девяти трупов без каких-либо очевидных признаков заболевания легких, Легкие измельчали на куски, промывали в 0,15 М растворе NaCI, гомогенизировали в 5 объемах смеси ледвода, 50 MM ацетата натрия, рН 5,5, Го. могенат обрабатывали ультразвуком, экстрагировали в течение 30 минут при температуре 4 С и центрифугировали(6000 x g) в течение 20 минут.

Верхний слой адсорбировали на ДЭАЭСефселе, уравновешенной 50 мМ ацетатом натрия, рН 5,50, и элюировали градиентом

0 — 200 мМ NaCI в ацетатном буфере, Градиентный объем в 10 раз превышал объем колонки.

25 шенной относительно фосфатного буфера, а

40

50 зы колонны подвергали диализу против 25

5

Активные фракции собирали, разбавляли 1,5 объемами дистиллированной воды и титровали до рН 8,4 с использованием 1М раствора NaOH. Снова адсорбировали на

ДЭАЭ-Сефаселе, уравновешенном 175 мМ трис НС!, рН 8,4 (! объем ионообменного материала на 10 объемов фракции), Далее

ДЭАЭ-Сефасел промывали буфером, заполняли им колонну и элюировали 0-200 мМ градиентным раствором NaCI в Трис-буфере, Собранные фракции концентрировали и подвергали диэлизу относительно 150 мМ фосфата натрия при рН 6,5. Пробу наносили на колонну (примерно 1 мл геля на 15 мг протеина в пробе) с Фенил-Сефарозой, уравновешенной относительно того же буфера. Эту активность элюировали градиентом 0 — 0,5 М КВч в 50 мМ фосфата натрия (рН

6,5), Активные фракции собирали, концентрировали и подвергали диализу против 0,15

Мфосфата натрия,,рН 6,5, Пробу наносили на колонну из Кон А-Сефэрозы, уравновезатем элюировали при помощи 50 мМ а-метил D-маннозида в фосфатном буфере. . Активные фракции концентрировали, наносили на колонну и элюировали в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, Активные фракции со стадии элюирования собирали, концентрировали и наносили на колонну из лектина пшеничных зерен

Сефароза (10 мл), уравновешенную при помощи 0,15 Мфосфата натрия,,рН 6,5.

Фермент элюировали 0,45 М N-ацетил-0глюкозамином в фосфатном буфере, Активные фракции с описанной выше стадии собирали, концентрировали, подвергали диализу против 0,15 М фосфата натрия, рН 6,5, и наносили на колонну, содержащую голубую Сефарозу КЛ-6Б, уравновешенную при помощи фосфатного буфера. После промывки колонны буфером подавали 10 мМ НАД и 10 MM НАДФ. После промывки буфером пиридиновых нуклеотидов фермент элюировали 0,9 М КВч в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, Активные фракции из голубой СефаромМ фосфата натрия, рН 6,5, и наносили на колонну. с гепарин-Сефарозой, уравновешенную тем же буфером, элюировали 140 мл градиента 0-1,0 M NaCI в фосфатном буфере. Получали три фракции.

Фракция А содержала УФ-абсорбирующий материал, который не связывался с гепарин-Сефарозой. Ее подвергали очистке на колонне с Сефакрил G-300. Пробу элюировали в 25 мМ трис HCI. рН 7,5.

1779263

Фракция А, В и С подвергали диализу относительно 25 мМ Трис HCI, рН 7,5, а затем концентрировали до объемв 1 мл на мембранных ультрафильтрах. Фракцию С использовали для получения антител ВКДВО в соответствии с описанием, приведенным в помещенном ниже примере.

Пример 3. Кролику подкожным способом вводили 30 ы г ВК-ДВО (фракцию

С), вместе с полной добавкой Фрейнда, Далее.иммунизацию ускоряли при помощи 5 инъекций 30,и г ВК-ДВО в неполной добавке Фрейнда с интервалами в один месяц.

4ереэ 2 недели после введения последней дозы кролику собирали кровь, IgG-фракцию антисыворотки изолировали при помощи адсорбции и десорбции из материала Протеин-А-Сефароэа в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, Элюирование осуществляли 0,1 M гпикоколHCI, рН 3,0. Собранный IgG титровали при рН 7,0. После этого IgG подвергали диализу против 0,1 М карбоната натрия (рН 8,3), 0,15

M NaCI (соединяющий буфер).

IgG разбавляли до концентрации 5-8 мг/мл при помощи "соединяющего буфера".

Добавляли Сефарозу, активированную

CNB, инкубировали при встряхивании в течение ночи при температуре 4 С, Буфер отсасывали из геля и анализировали на оставшийся протеин. В общем случае получали более чем 98 связывание. Гель со связанным IgG блокировали суспензией в 1

М этанопамина в течение ночи при температуре 4 С, промывали "соединяющим буфером", далее 0,1 M ацетата натрия (рН 4,0), 0,5 М NaCI. Гель хранили в "соединяющем буфере" с азидом в качестве антибактериального агента

100,и л 50 суспензии анти-ВК-ДВОСефарозы добавляли к 0.5 мл BK-ДВО в "соединяющем буфере". Осуществляли параллельное контрольное инкубирование с использованием 100,и л 50 суспензии

Сефарозы 4В. Растворы встряхивали в течение ночи при температуре 4 С, а затем центрифугировали. Остаточная активность в растворе, обработанном Сефарозой 4В, была равна 2080 ед/мл, а в растворе, обработанном анти-ВК-ДВО-Сефароэой — 720 ед/мл, Используя эти цифры, можно рассчитать, что 1 мл анти-ВК-ДВО-Сефарозного геля связывает 13500 единиц ВК-ДВО (примерно 120 р г). Эти расчеты использовали для составления плана адсорбции ВК-ДВО из гомогенатов ткани человека.

Пример 4. Иммуноадсорбция ВКДВО в анти-В К-ДВО-Сефарозе.

55 деляли от экстракта на стеклянной воронке, промывали 50 мМ фосфата калия (рН 7,0), 05 M NaO, Гель упаковывали в хроматографическую колонку, элюирование начинали с 50

MM фосфата К (рН 7,0), 0,5 М NaCI со скоростью 50 мл/час и фиксировали поглощение в области 280 нм. Элюирование продолжали до достижения очень низких значений при

А2во. Далее ВК-ДВО эпюировали линейным градиентом KSCN 0,5 — 2,5 M в 50 MM фосфата калия, рН 7,0. Общий объем градиента составлял 500 мл, а элюирование осуществляли со скоростью 30 мл/час, Десорбция

ВК-ДВО протекала медленно и элюирование не могло быть ускорено.

Элюирование ВК-ДВО не является полным в конце градиента 2,5 М KSCN. но эпюирование не продолжают с тем, чтобы не собирать ВК-Д,ВО, которая становится слишком денатурированной под действием высокой концентрации KSCN.

Первую активность в градиенте не собирали, так как она содержала слишком большое количество примесей неспецифично связанного протеина (Ащр), Пример 5. Адсорбция и эпюирование из ДЭАЭ-Сефасела.

В собранный элюат из колонны с антиВК-ДВО-Сефарозой добавляли 1-аминометиппропанол до конечной концентрации 10 мМ. Раствор титровали до рН 9,0 с использованием 1М NaOH, разбавляли 5 объемами дистиллированной воды. В полученный раствор добавляли 40 мл ДЭАЭ-Сефасепа, уравновешенного 50 MM фосфатом натрия, 0,5 М NaCI, 175 мМ Трис-HCI, рН 9,6, ВК-ДВО адсорбировали на Д