Средство, обладающее антигерпетическим действием

Средство, обладающее антигерпетическим действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве лекарственного препарата для лечения поражений , вызываемых вирусом герпеса простого. С целью повышения активности действия средства последнее содержит а-лизин-а -оксидазу и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас,%. а -лизин-а -оксидаза 0,001-0,1; наполнитель остальное.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)s А 61 К 37/50

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) 1 ъ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ м

Ic (21) 4921819/14 (22) 26.02.91 (46) 07.12.92, Бюл, N. 45 (75) С.Б.Алексеев, Т.Т.Березов, А.А.Селищева, И.П.Смирнова, А.А.Згурский, С.В.Диорица, З.Х.Корнилова и В.Ю.Ири (56) Баринский И.cD. и др, Герпес. Этиология, диагностика, лечение. M.: Медицина, 1986, с,З и далее.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве лекарственного препарата для лечения поражений, вызываемых вирусом герпеса простого.

Из белковых препаратов, используемых для лечения герпетических инфекций, известен препарат реаферон, который представляет собой полученный генной инженерией а — интерферон человека.

Недостатком указанного препарата является его малая эффективность, что требует высоких концентраций препарата.

Целью изобретения является повышение активности действия средства, обладающего антигерпетическим действием.

Указанная цель достигается тем, что средство, обладающее антигерпетическим действием, содержащее активное вещество, содержит а -лизин-а-оксидазу и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.%; а -лизин-а- оксидаза 0,001-0,1; наполнитель остальное.

Отличительным признаком нового средства является то, что оно содержит а -лизин.. Ы „1779381 А1 (54) СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве лекарственного препарата для лечения поражений, вызываемых вирусом герпеса простого. С целью повышения активности действия средства последнее содержит а-лизин-а -оксидазу и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас,, а -лизин-а -оксидаза 0,001-0,1; наполнитель остальное, Q -оксидазу (ЛО) как ингибитора вирусов группы герпеса простого, при этом лечебные свойства средства проявляются именно с использованием гелеобразного препарата, способствующего усилению необходимого эффекта фермента, а также пролонгирующего его действие, Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

В опытах использовали штамм Л2 вируса герпеса простого 1-типа (В ГП-1), полученный из музея Института вирусологии АМН

СССР им.И,Д.Ивановского и кроликов породы шиншилла весом 1000-1100 г, Вирус размножали путем пассирования на перевиваемой клеточной линии Чего, про псходящей из почек зеленой мартышки.

Высокоочищенный препарат а - 1изин- а — оксидазы получали по следую ей методике.

Получение бесклеточной культуральной жидкости, содержащей ЛО.

Продуцент фермента Trichodei т а

harzianUm ЯИа! F-180 культивировали гпубинным способом в стерильных условиях на

1779381

40

55 питательной среде следующего состава: 5 кг пшеничных отрубей и 6 кг сульфата аммония на 100 л питательной среды, Культивирование вели при перемешивании и аэрации 3 куб,м/ч при 28 С в ферментере объемом 250 л в течение 5 суток (120 ч). Во время ферментации рН не поддерживали.

По окончании ферментации к культуральной жидкости добавляли сульфат аммония до 20% насыщения и инкубировали 3-4 ч.

Далее культуральную жидкость центрифугNpoBBRM при 3-4 тыс, об/мин и супернатант (около 90 л) подвергали дальнейшей обработке. Содержание ЛО составляло 4-6 Е/мг супернатанта.

Получение высокоочищенного фермента ЛО.

К супернатанту, полученному, как описано выше, добавляли сухой сульфат аммония до примерно 50% насыщения и инкубировали в течение 3-4 ч, Центрифугировали при 3-4 тыс, об/мин и супернатант отбрасывали. Осадок промывали дважды сульфатом аммония (50% насыщения) и затем растворяли вбуфере,,содержащем 20 мМ трис-HCI pH 7,2-7,6, Объем буфера составлял 1/50-1/100 объема исходной культуральной жидкости.

К полученному раствору (обьем l-2 л) добавляли диотомовую землю (бентонит) в количестве 49-50 г/л и перемешивали в течение 1- (,5.÷àñà. Фильтровали смесь через воронку Бюхнера с мелким стеклянным фильтром (20-40 мкм) под слабым вакуумом.

Фильтрат наносили на колонку с DEAEцеллюлозой объемом 500-600 мл, уравновешенную 10 мМ трис-HCI буфером рН 7,2-7,6 (объем буфера для уравновешивания примерно 5-6 л), Скорость протока буфера через колонку 150-200 мл/ч, После нанесения материала колонку npoMblBBflM буфером

10 мМ трис-HCI; 0,2 М NaCI. Контроль проводили по измерению оптической плотности при 280 нм.

Элюцию фермента вели буфером 10 мМ трис-HCI pH 7,2-7,6; 0,5 M КаС! и собирали фракции, содержащие ЛО активность. В результате было получено 900 мл фермента с удельной активностью 150 Е/мг белка. Выход по активности составил 70-75%. Полученный препарат фермента диализовали при 4 С против 0,01 М Na-фосфатного буфера рН 7,2 и затем лиофильно высушивали. В результате был получен гомогенный препарат ЛО, в/Испытания а -лизин-а -оксидазы.

Для испытания ЛО в составе мази использовались соотношения компонентов, мас.%: а -Лизин-а -оксидаза 0,001

Наполнитель 99,999

Заражение ВГП-1 кроликов приводит к развитию инфекционного процесса. Исходя из этого, кролики являются удобным экспериментальным объектом для моделирования герпетической инфекции и испытания антивирусных препаратов.

В наших условиях моделирование инфекционного процесса достигалось путем инфицирования стандартизованных повреждений роговицы и кожи кроликов.

Эксперименты проводили по следующим схемам.

С х е м а 1. Кроликам проводили скарификацию роговицы обоих глаз (5-10 поверхностных разрезов) бифуркационной иглой. (-(емедленно после нанесения повреждения на левый глаз и кожи на поврежденный участок наносили 1000 тканевых цитопатических доз ВГП-1, что составляло 50% от летальной дозы. Правый глаз и поврежденную зону кожи использовали как контроль, Препарат, обладающий антигерпетическим действием, вьодили ежедневно в течение 5 дней (0,42 мкг/мл). Контрольным зара>кенным живот lblM вводили ежедневно по 0,5 мл физиологического раствора. Оценку действия препарата проводили по следующим параметрам; макроскопическая картина (ежедневно), иммунологический анализ отделяемого из поражений на левой стороне (через день), гистологический анализ роговицы и участка кожи, пораженных вирусом (на 7-й день после заражения), В трех исследуемых группах использовали по три кролика.

Схема N1 демонстрирует достижение поставленной цели, Влияние препарата в виде мази изучалось на экспериментальной герпетической генитальной инфекции у морских свинок.

В работе использовали вирус герпеса простого 2 типа (ВГП-2), штамм "MS", полученный из национальной коллекции вирусов США (Roc(evil(e, Mary(end,USA). Вирус поддер>кивали B пассажах на чувствительной культуре клеток Чего в среде RPM(-1640, содержащей 500 Е/мл бензилпенициллина, Биологическую активность вируса определяли титрованием в культуре клеток \/его стандартным методом, Результаты выражали в ТЦД/50/мл. Специфичность вирусного

ЦПД в культуре клеток подтвер>кдалась методом иммунофлюоресценции с использованием противогерпетических кроличьих антител, меченых eÈÒÖ.

В опытах использовали самцов морских свинок весом 300 г. Перед заражением жиBoTHblM давали наркоз внутрим и шеч ными

1779381 о ействия

Кожа (в/м) иньекциями Кеталлара в дозе 100 мг/животное. На предварительно скарифицированную поверхность слизистой полового члена наносили 0,1 мл вирусной суспензии в дозе 100000 БОЕ/мл (ЛД/100) 5 на одно животное. Клиническое проявление острой герпетической генитальной инфекции у морских свинок оценивали по 5-бальной шкале (Mayo et al, 1983), Использование модели герпетической 10 генитальной инфекции подтвердило терапевтический эффект препарата в указанных концентрациях ЛО и наполнителя.

Пример 2. Использование препарата следующего состава, в мас. /. 15

B качестве наполнителя использовали гелеобразное вещество "Сакап".

Полное восстановление структур глаза при введении препарата после заражения, а также полное восстановлен lе архитекто- 20 ники кожи в местах повре>кдения на 5-ые6-ые сутки, При введе1-1ии препарата через

28 ч наблюдается также положительный эффект, хотя он несколько снижен по сравнению с введением препарата сразу после 25 заражения.

Пример 3. Использование препарата следующего состава, в мас, /.

ЛО -0,2 наполнитель -99,8. 30

Наблюдается полное восстановление структур глаза при введении препарата сразу после заражения, а также полное восстановление архитектоники кожи в местах повреждения. При введении препарата че- 35 рез 28 ч эффект несколько снижен по сравнению с введением его сразу после заражения. Увеличение дозы ЛО в препарате более 0,1/, не приводит к улучшению терапевтического эффекта. Наблюдается 40 некоторая аллергизация, выраженная в по краснении роговицы глаза.

Пример 4. Использование препарата следующего состава, мас. P:

ЛО 0,0001

Наполнитель 99,999

Наблюдается эффект улучшения структур глаза при введении препарата, хотя он слабо выражен и проявляется только на начальном этапе течения патологического процесса как при введении препарата сразу после заражения, так и через 28 ч после заражения животного. Снижение терапевтического эффекта связано с недостаточной дозой ЛО в используемом для лечения животных препарата.

В результате проведенных исследований показана высокая эффективность препарата на основе ЛО на моделях офтальмогерпеса и генитального герпеса при использовании его 1 раз в день втечение 5-7 дней после заражения животных, что выгодно отличает данный препарат от прототипа, которой применяется до

5-7 раз в день. По сравнению с прототипом дозы препарата при лечении вышеуказан !blx заболеваний снижены в 5 раз, что, в свою очередь, черезвычайно существенно для предотвращения развития аллергизирующих процессов, характерных при применении различных белковых препаратов.

Формула изобретения

Средство, облада1ощее антигерпетическим действием, содержащее активное вещество,отлича ощееся тем,что,с целью повышения активности действия, оно содержит й-лизин-а -оксидазу, наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.,4: а -Лизин-а-оксидаза

Наполнитель алительный процесс в повер стных слоях и оболочках коЭпидермис отсутствует, дно кта покрыто некрозированнь ложениями, субэпидермальн кена воспалительная инфель рация

Полное восстановление тектоники кожи в местах по вреждения раженный терапевтический ект. Практически восстанови лась структура кожи.