Способ экспрессии цепей химерного антитела

Способ экспрессии цепей химерного антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в иммунологии и медицине для диагностики прогнозирования и лечения болезненных состояний, включая аденокарциному. Сущность изобретения: сконструированы эукэриотические векторы экспрессии, которые могут быть использованы для создания модифицированных и химерных производных KSI/4.

SU „, 1780541 АЗ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (53)5 С 12 N 15/13

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ;:,-: ::, ;,,„

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л

I»

«Г

СО

С) (л )>

,Сд (21) 4743669/13, 4613958/13 от 20,04.89 (22) 25.04.90 (31) 184522 (32) 21.04.88 (33) US (46) 07.12.92, Бюл. ¹ 45 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Лайза Селсам Бриверз, Томас Фрэнк

Бьюмол, Роберт Алан Гадски и Барбара

Джин Вигел (US} (56) Патент ЕПВ N 0120694, кл, С12 N15/00,1984.

Патент ЕПВ № 0125023, кл. С 12 N

15/00, 1984.

Патент ЕПВ ¹ 0088994, кл, С 12 N

15!00, 1984.

Изобретение относится к иммунологии и генной инженерии, в частности к исследованию моноклональных антител, и направлено на продуцирование химерных моноклональных антител, которые могут быть использованы для лечения рака и других заболеваний.

Изобретение относится к способу экспрессии тяжелых цепей химерного антитела

К 1/4 в эмбриональных клетках человеческой почки, В публикации Европатента №

0125023 от 14 ноября 1984 r, раскрываются рекомбинантные и химерные моноклональные антитела, Однако эти молекулы реагируют с карциноэмбриональным антигеном, а не с антигеном аденокарциномы настоящего изобретения, Кроме того, СаЫИу и др. не раскрывают способ настоящего изобретения, в котором цепи антител продуцируются в нелимфоидных клетках почки.

SherIe l. Morrison в ignm, 223: 1202—

1207 (1985) раскрывает получение химерных антител в клетках трансфектомы. Химерные (54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНОГО;

АНТИТЕЛА (57) Использование. в иммунологии и медицине для диагностики прогнозирования и лечения болезненных состояний, включая аденокарциному, Сущность изобретения: сконструированы эукариотические векторы экспрессии, которые могут быть использованы для создания модифицированных и химерных производных К$!/4. антитела, полученные Morrison реагируют с тринитрофенилом и были продуцированы в лимфоидных клетках, В работе Sun и др., и ) *» *.6 раскрывают химерные антитела; которые реагируют в аденокарцйномой. Из сравнения ами нокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, раскрытого Sun, и аминокислотной последовательности тяжелой цепи KS1/4 ясно видно, что эти последовательности являются на 48;ь негомологичными, Более того, в работе Sun и др. не раскрывается Использование нелимфоидных клеток, которые используются в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение относится к получению новых соединений ДНК и векторов клонирования рекомбинатной ДНК, который кодирует мышиное (человеческое) химерное антитело с тяжелой цепью, проис-, ходящее от КЯ1/4. Эти векторы позволяют экспрессировать новые ДНК-соединения в нелимфоидн ых эукэриотических клетках.

1780541

Изобретение также позволяет получить клетки хозяина, трансформированные этими новыми клонирующими векторами. Эти трансформированные клетки хозяина экспрессируют рекомбинантные или химерные

KS1/4-антитела. Многие из существующих

ДНК-соединений могут быть использованы для получения KS1/4-производных, которые до сих пор не были синтезированы ни в природе, ни в лаборатории, и которые также входят в объем настоящего изобретения.

Моноклональное антитело KS1/4 является мышиным антителом, которое специфически связывается с антигеном поверхностных плотности на клетках аденокарциномы, а также на нормальных эпителиальных клетках, Это антитело оказалось эффективным для диагностики заболеваний vl î, а также для

j jyg диагностики и лечения аденокарциномы. Последние исследования подтвердили, что KS1/4-лекарственные коньюгаты показывают дозозависимую суппрессию роста опухоли.

Возникает одна проблема с использованием мышиных антител в человеческом организме, если иммунная система пациента с заболеванием раком вырабатывает антитела .против мышиных иммуноглобулинов, Такой иммунный ответ происходит не у всех пациентов, но если он происходит; то он приводит к постепенному ухудшению эффективности лечения в течение курса многократного приема лекарственного средства. Этот иммунный ответ пациента может также приводить к более сильным реакциям, таким, как анафилаксия или сывороточная болезнь. Такая иммуногенность не позволяет вводить Мхогократные дозы антитела и поэтому снижает клиническую ценность лечения.

Человеческие моноклональные антитела получить очень трудно, поэтому во избежание иммунологических проблем конструируют химерные антитела. Химерные антитела содержат специфические или вариабельные части антитела, происходящего от видов, связанных с постоянным участком от различных видов, См. Ol u Morrison; Bio

bechnlques 4:214 — 221 (1986). Поскольку иммунный ответ бывает часто направлен против постоянного участка, замена мышиного постоянного участка человеческим постоянным участком способствует значительному ослаб лению иммунологической реакции пацйента.

В соответствии с этим химерные антитела являются желательными для лечения заболевания.

Основная теория химерных антител описана в литературе, однако еще остается антител, обладающих определенной специфичностью, Настоящее изобретение относится к рекомбинантной ДНК и аминокислотным последовательностям, ко5 торые содержат полную молекулу К$1/4 монокланального антитела. Эти последовательности воздействуют на экспрессию химерных антител, которые обладают той же тканевой специфичностью, что

10 и KS1/4, но которые содержат при этом постоянные участки, происходящие от человеческих источников. Поэтому настоящее изобретение позволяет применять терапевтический режим с той же тканевой специклеток 40000 Д, обнаруженным в высокой 15 фичностью моноклонального антитела

KS1/4, но со значительным уменьшением иммунологических побочных эффектов.

Кроме того, изобретение включает рекомбинатную ДНК и аминокислотные после20 довательности К$1/4. Знание этих последовательностей позволяет специалистам разработать новые KS1/4-производные с модифицированными родством для KS1/4антигена, Настоящее изобретение, кроме то25 го, содержит способы получения химерного и рекомбинантного KS1/4 в линиях нелимфоидных клеток, чтобы тем самым разрешить проблему, часто возникающую в результате двойной секреции гетерогенных антител в

30 лимфоидных клетках.

В целях раскрытия настоящего изобретения ниже приведенные понятия определяются следующим образом;

А — деоксиаденозин;

35 Ala — остаток аланина;

Ар — ампициллин-резистентный фенотип или ген, несущий устойчивость в ампициллину;

Arg — остаток аргинина;

40 Ash — остаток аспарагина;

ASp — остаток аспарагиновой кислоты;

С вЂ” деоксицитозин;

Химерное антитело — антитело, содержащее вариабельный участок от одного ви45 да обычно мыши, который связан с постоянным участком от другого и отличного от него вида, обычно человека:

CyS — остаток цистеина;

dhfr — фенотип дигидрофолат-редукта50 зы или ген, несущий этот фенотип;

Enh — последовательность энхансера, полученная от ВК-вируса;

G — деоксигуанозин;

Gln — остаток глутамина;

55 G lu — остаток глутаминовой кислоты;

Gly — остаток глицина:

G418-R устойчивый фенотип или ген, несущий этот фенотип, может быть также идентифицирован как Km ; необходимость в разработке новых химерных His — остаток гистидина;

1780541

Hm — гидромицинустойчивый фенотип

R или ген, несущий этот фенотип;

Ile — остаток изолейцина;

Ivs — ДНК, кодирующая интрон, так называемая вставочная последоватеу1ьяость;

KSA — антиген поверхностного гликопротеина клеток 40000 USLA РЗ, которые являютсяя распознаваемыми моноклональным антителом KS1/4;

К$1/4 — мышиное моноклональное антитело, происходящее от линии клеток гибридомы; это антитело, распознающее гликопротеиновый антиген 40000 Д, обнаружено на поверхности клеток РЗ-VCLA;

Leu — остаток лейцина;

LP — ДН К-фрагмент, содержащий активность промотора аденовируса позднего промотора;

Lys — остаток лизина;

Met — остаток метионина;

МоА — моноклональное антитело;

Нативн ый белок — полипептид, продуцируемый при трансляции и РНК-транскрипта, и любых посттрансляционных модификаций;

PA — ДН К-последовательность, кодирующая сигнал полиаденилации;

Phe — остаток фенилаланин;

Р1 — ДН К-фрагмент, содержащий актив.ный промотор левого промотора бактериофага;

Pro — остаток пролина;

Промотор — ДН К-последовательность, которая направляет транскрипцию ДНК в

РНК.

Вектор клонирования рекомбинантной

ДНК вЂ” любой автономно реплицирующий агент, включающий плазмиды и фаги, но не ограничивающийся ими, содержащий ДНКмолекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных фрагментов ДНК, Вектор экспрессии рекомбинантной

ДНК вЂ” любой вектор клонирования рекомбинэнтной ДНК, в который вводят промотор.

Рекомбинантное KS1/4 -- молекулы мо. ноклонального антитела KS1/4, экспресси руемые в клетках, трансформированных вектором, вызывающим экспрессию KS1/4.

Репликон — ДНК-последовательность, которая регулирует и обеспечивает автономную репликацию плазмиды или друГого вектора.

Фрагмент рестрикции — любая линейная последовательность генерировэййая одной или несколькими рекстриктрирующими эндонуклеазами, Восприимчивая клетка хозяина — кото- рая не может расти в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединения без устойчивого к нему ДНК-фрагмента.

Ser — остаток серина.

Структурный ген — любая ДНК вЂ” после5 довательность, кодирующая функциональный полипептид, начало включения трансляции и стопсигналы.

Т вЂ” деокситимидин.

Tc — тетрациклинустойчивый фенотип

10 или ген, несущий этот фенотип, Thr — остаток треонина.

Trp — остаток триптофана.

Туг — остаток тирозина;

Val — остаток валина.

15 На фиг,1 показана схема конструкции плазмиды PL32 (для наглядности фиг. точно не соответ ст-вую т масш табу); на фиг.2 — сайт рестрикции и функциональная кэрта плаэмиды pNM789; на фиг,3 — схема конструкции

20 плазмиды 120; на фиг,4-схема конструкции плазмиды PL110; на фиг.5 — сайт рестрикции и функциональные карты ВК вЂ” вируса и плазмиды рВК neol; на фиг,6 — сайт рестрикции и функциональные карты-плазмид

25 pLPCat и pPLcat; на фиг.7 — схема конструкции плазмиды pL133; на фиг.8 — сайт рестрикции и функциональные карты плазмид

pLPC, pSV 2hyg и р PChygl; на фиг.9 — схема конструкции плазмйды pBW25; на фиг.10—

30 схема конструкции плазмиды pBW32; на фиг.11 — сэйт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPChd и phd; на фиг.12— сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СНКС2-6 и СНКС2-18; на фиг.13—

35 сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СН2А5 и CH2A51G2; на фиг.14— сайт рестрикции и функциональные карты плазмид CH2A51G3 и СН2А5104.

Предметом настоящего изобретения яв40 ляется способ экспрессии, заключающийся в том, что конструируют рекомбинантную

ДНК-плазмиду pHI-Н!, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела

KS1/4 с аминокислотной последовательно45 стью, состоящей в основном из

Gln 11е Gln Låu Чаl Gln Ser Gly Рга Glu Leu Lys

Lys Pro CTy Glu ТЬг Чаl Lys 1Iе Ser Cys Lys Ala Ssr Cly Туг

Thr Phe Thr Asn Tyr Gly ttet Asn Тгр Чаl Lys Gln ТЬг Pro Gly

50 Lys Gly Leu Lys Tsp tIet Gly Trp I le Asn Thr Tyr Thr Cly Glu

Pro Thr Туг Ala Asp Asp Phe Lys Сlу Агу Phe Ala Phe Бег Leu

Glu Thr Ser Ala Seг Thr AIa Phe Leu G1n Ile Cln Cln Pro Gln

Аьо Net АгБ Thr Нег Аlа Thr Туг Phe Суа Чаl Arg РЬе Ile Бег

Lys Gly Asp Tyr Тгр Gly Gln Gly Thr Бег Чаl ТЬг Ча1 Ser Бег

55 трансформируют штамм культивируемых клеток, являющихся эмбриональными клетками почкй*человека, трансформированными аденовирусом т ипа 5, с помощью плазмиды pHI-HI, а затем культивируют

1780541 клетки, которые экспрессируют цепи химерного антитела, Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи является следующей

GAc стс ААС

ТСТ CGG TAT

ACY CCA GGA

CAG A?C CAC TTG CAC GGA сст мс сст GcA GAG AcA стс AAG A?c тсс тсс AAG Gc?

AAC ТГО СТО AAG CAG

TGG АТА AAC ACC" ТАС

АСС YYC ACA AAC TAT ССД ATG

AAG GCT TYA AAG TCC ATG GGC

CCA ACA ТАТ GCT GAT GAC ТТС

CAA ACC GCC AGC ACT GCC

АСТ GCA GAA

ТТС ТСТ TTG

AAG CGA CGG ТТТ GCC

TTT TTG CAG ATT CAA CAA CCT CAG

ААТ ATC AGG ACT ATG GCT АСА ТАТ ТТС TGT GTA AGA

ТТТ АТТ TCT

GTC TCC TCA

AAG GCC GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACG TCA GTC ACC

Молекулы легкой и тяжелой цепи насто- 15 ящего изобретения ассоциируются с отчетливыми сигнальными пептидами.

Последовательность аминокислотных остатков сигнального пептида тяжелой цепи в основном является следующей 20

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met

Ata Ala Ala Gln Ser Ala Gin Ala

Нуклеотидная последовательность этого сигнального пептида является следующей 25

ATG GAT TGG CTG TGG AAC TTG CTA TTC

CTG ATG GCA GCT GCC САА AGT GCC САА . GCA.

Новые ДНК-соединения настоящего изобретения являются производными от . 30 кДНК-клонов, полученных из мРНК от линии клеток гибридомы, которая продуцирует моноклональное антитело KS1/4. Плазмида рСКС2310 содержит полную кодирующую последовательность легкой цепи монокло- 35 нального антитела К$1/4; кодирующую последовательность сигнального пептида, ассоциируемую с легкой цепью, и 5 и 3

I нетранслированные участки этой молекулы, 5 — нетраслйрованный участок имеет ДНК- 40

1 последовательность;

5 -ТС TGA CAG ACA СТА CTG TGC СТС GTC

GT TGG GAC CTA ААА GGG СТА GTA GAA

СС GCA AGC ТТТ ТТА АТС ТСТ ССА AAG

AAG ATG АТОТСС ОССАОТАТОТТО TCAGGA 45

AGC ССТТАА АСА AAG ААО GTA АТТ AGC TAG

GGA CCA ААА ТТС ААА GAC ААО-3 .

3 - нетранслированный участок имеет.

gHK-последовательность:

5 — TAG AGA САА AGG ТСС TGA ОАС GCC 50

АСС ACC AGC ТСС CCA GCT ССА TCC TAT

СТТ ССС ТТС ТАА GGA GGT СТТ GGA GGC

ТТС CCC ACA AGC GAC АТА ССА CTG TTG

CGG TGC ТСС AAA ССТ ССТ ССС САС СТС

СТТ СТС СТС СТС СТС ССТ TTC GGC ТТТ 55

ТАТ САТ GCT ААТ АТТ TGC AGA ААА ТАТ

TCA АТА AAG TGA ОТС ТТТ GCA CTT G-3

Плазмида рСКС2310 может быть выделена обйчным способом из Е,соИ К 12

ММ294 (pGKC2310), штамм депонирован и находится в постоянном фонде коллекции культур Северной областной исследовательской лаборатории (И?тВ(), Peoria, Иллинойс. Культура Е.coll К12 MM294/ рКС2310 может быть получена иэ NRRL под входящим номером В-18356.

Плаэмида рС2А52 содержит полную кодирующую последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела К$1/4. кодирующую последовательность сигнального пептида, связанного с тяжелой цепью и 5 и 3 — нетранслированные области

1 этой молекулы, Тяжелая цепь, кодируемая этой молекулой, является цепью подкласса

IgG 2А, 5 — нетранслированная область

I имеет ДН К-последовательность:

5 — TCG ТТТ GTC ТТА AGG САС САС

TGA GCC САА GTC ТТА GAC АТС-3 а 3 — нетранслируемая область имеет ДНКI последовательность:

5 — TGA GCT CAG САС ССА САА ААС

ТСТ CAG GTC САА AGA GAG АСС САС

АСТ САТ СТС САТ GCT TCC СТТ GTA

ТАА АТА AAG CAC ССА CGA ATG ССТ GGG

АСС ТАА ААА ААА ААА ААА AAA ААА AGA

CG-3

Плазмида рС2А52 может быть выделена обычным способом из E.coll

K12MM294/pG22A52, также депонированным и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coll К12

ММ294/pG2A52 может быть получена из

NRRL под входящим номером NRRL В-18357, Плазмидв СНКС2-6 содержит кодирующую КДН К-последовательность вариабельной области природной легкой цепи моноклонал ьного антитела KS1/4, к ДНК кодирующую последовательность сигнального пептида, связанного с этой легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина.

Плазмида СНКС2-6 может быть выделена обычным способом из Е. coll К12

DH5/ÑÍÊÑ2-6, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coll К12.ДН5СНКС2-6 может быть получена из NRRL под входящим номером В-18358. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды

СНКС-2-6 представлены на фиг.12.

Плазмида СН КС-2-18 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области производного с легкой цепью моноклонального антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциируемого с легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область легкой цепи человеческого имму1780541

10 ноглобулина. Вариация этой последовательности включает альтерацию кодона в 3

-конце, Вариабельная область природной легкой цепи содержит кодон агригина в 3 конце, тогда как кодон в том же положении в плаэмиде СНКС2-18 кодирует остаток глицина. Плазмида СНКС2-18 может быть выделена обычным способом из Е. coll К12

Д Н5/Сн КС2-18, также депонирован нам и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRI. Культура Е. соИ К12

ДН5/СНКС2-18 может быть получена из

NRRL под входящим номерам NRRL

B/18359. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СНКС2-18 представлены на фиг.12.

Плазмида СН 2А5 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи манаклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с указанной тяжелой цепью, и геномную ДН К-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглабулина lgGI.

Плазмидэ СН2А5 может быть выделена обычным способом из Е. coll К12 MM294/СН2А5, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур ЙЯИ .

Культура Е. coll К12 MM294/СН2А5 может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL В-18360. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды СН2А5 представлены на фиг,13.

Плазмида СН2А551С2 содержит кодирующую кДН К-последовательность вариабельной области тяжелой цепи монаклонального антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномную

ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи, человеческого иммуноглобулина IgG2. Плазмида

СН2А51С2 может быть выделена обычным способом из Е. соИ К12 ДН5/СН2А51С2, также депонированном и находящимся в постоянном фонде коллекций культур NRRL.

Культура Е. соИ К12 Н5/СН2А5102 может быть получена из NRRL под входящим номером ИЯЯ(В-18361. Сайт ресктрикции и функциональная карта плазмиды CH2A51G2 представлены на фиг,13.

Плазмида СН2А5103 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью, и геномнуюДНК-последовательность, . которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина

IgG3. Плазмида CH2A51G3 может быть выделена обычным способом из Е. соИ К12

ДН5/CH2A51G3, также депонированном и

5 находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL, Культура Е. coll К12

ДН5/CH2A51G3 может быть получена иэ

NRRL под входящим номером NRRL B18362, Сайт рестрикции и функциональная

10 карта плазмид CH2A51G3 представлены на фиг.14.

Плазмида CH2A51G4 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области тяжелой цепи моноклонального

15 антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с тяжелой цепью. и геномную

ДНК-последовательность, которая кодирует постоянную область тяжелой цепи человече20 ского иммуноглобулина IgG4. Плазмида

CH2A5iG4 может быть выделена обычным способом из Е. соИ К12 ДН5/CH2A51G4, также депонираванном и находящимся в постоянном фонде коллекции культур NRRL.

25 Культура E. coll К12 ДН5/СН2А5164 может быть получена из NRRL под входящим номерам NRRL В-18363, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды CH2A51G4 представлены на фиг.14.

ДН К-соединения настоящего изобретения, кодирующие рекомбинантное KS1/4 и их производные, особенно предпочтительны для конструирования векторов для трансфор35 мации и экспрессии различных цепей антитела в клетках млекопитающих и других эукариотических клетках. Хозяйские клетки многих млекопитающих обладают. необходимым механизмам для распознавания и соответствую40 щей обработки-сигнальных пептидов, находящихся на эминоконцах различных цепей антитела, рассматриваемых в настоящем изобретении. Клетки хозяина некоторых млекопитающих также обеспечивают посттранс45 ляцианные модификации, как, например, гликосилирование, наблюдаемое в молекулах антитела. Существует много разновидностей векторов для трансформации эукариотических клеток хозяина; и специфические векто50 ры, описываемые ниже, не ограничивают объема настоящего изобретения.

Векторы экспрессии настоящего изобретения, которые способствуют получению рекомбинантного KS1/4 и его химерных

55 производных, конструируются при помощи плазмиды phd. Плазмида phd конструируется из широко известных доступных исходных материалов. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды phd представленМ на фиг.11.

1780541

Плазмида phd конструировалась сначала при помощи выделения плазмиды рКС283 от Е, coll К12 ВЕ1201/рКС283. Эта культура может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL В-15830. Плазмида рКС283 содержит промотор гибрида IpppZ бактериофага il. Эту плазмиду получали иэ клеток Е. coll К12 ВЕ1201, так как эти клетки содержат термовосприимчивый с I репрессор, интегрируемый в клеточную

ДНК. Ненужный участок IacZ плазмиды рКС283 вырезали сначала путем переваривания плазмиды рекстриктирующим ферментом РЧ и 11. Затем добавляли к перевареннойДНКспецифические ДНК линкеры для превращения PV и 11 сайтов в одиночный Xhof сайт, который создавал плазмиду рКС28РХ. Подробные описания выделения плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены соответственно в примерах 1 и 2. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены на фиг.1. Как описано в примере 3, плазмида рКС283РХ трансформируется в Е.

coil К12 MO (Х) E. coli К12 MO (А+) может быть получена из NRRL под входящим номером NRRL B-15993.

Затем при помощи рестриктирующих ферментов Bg Ill u Xhol переваривали плазмиду рКС283РХ. После этого вектор очищали, ДНК линкеры с Bglii u Xhol-концами лигировали в вектор для образования плазмиды рКС283-п, Bglll-Xhol линкер также одержал Xba 1-сайт. Xho-сайт плазмиды рКС283-Z затем трансформировали в

BamHI-сайт. Это достигалось путем полного переварирования плазмиды рКС283-L рестриктирующим ферментом Xh01, с последующей обработкой ф-м Кленова и добавлением BamHI-линкерами для образования плазмиды pKC283LB.

Подробное описание конструирования плаэмид рКС283-L и pRC283-L В приводится соответственно в примерах 4 и 5, Сайт рестрикции и функциональные карты плаэмид рКС283-L u рКС283-L В представлены на фиг.1;

Периферическую ДНК Е. coll затем вырезали иэ плаэмиды рКС283РХ путем полно. го переваривания рестриктирующим ферментом Sal I с последующей обработкой

4,0kb вектора ф..том Кленова идобавлением

EcoR 1-линкероа. После рециркуляриэации путем лигиробания получали плазмиду рКС283Р RS. Затем плазмиду r ереваривали рестриктазами Pä и l выделяли 085

kb. Фрагмент рестрикции ЯЙ+ 1 - 3gh I.

Аналогичным образом плазмиду рКС283-2 В переваривали рвстриктазами Язт+ 1 и Зри l и выделяли 0,3 kb орагмент

0,85 kb ЯМ+ 1 - ЯрЬ I фрагмента плазмиды рКС283Р RS затем лигировали в

3,0 kb ? + 1 - ЯрЬ 1 фрагмента вектора плазмиды рКС282-L В для образования

5 плазмиды pL32. Подробные описания конструирования плазмид рКС283 PRS и pL32 приведены в примере 6, Сайт рестрикции и функциональные карты плаэмид рКС283

PRS и pL32 представлены на фиг.1.

10 Плазмида pNM789 была получена .из

1чйй! в Е. coll К12 PV 308 (pNM789 под входящим номером В-18216. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмид

pNM789 представлены на фиг.2. Плаэмиду

15 pNM789 частично переваривали рестриктазой QQJ Il, полностью переваривали реотриктазой. Яап Н1, а затем обрабатывали щелочной фосфатазой. Затем в переваренный, обработанный фосфатаэой вектор

20 pNM789 лигировали новый Яй2 11- Ыдп1М1 линкер с целью получения плазмиды 120.

Затем плазмиду 120 полностью переваривали рестриктазами ba и BamHI и выделяли

0,6 kb КЬд1 - EgglHI ЕК-BGH-кодирующий

25 фрагмент рестрикции. Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазамиЯа1 и Ядд Н! и выделяли 3,9 kb фрагмента вектора, Затем во фрагмент 3,9 kb вектора плазмиды р1 32 лигировали 0,6 kb Xbal — BamHI

30 фрагмента плаэмиды 120для получения плазмиды р1 47, Подробные описания конструирования плаэмид 120 и pL47 приводятся в примерах 6 и 7.

Сайт рестрикции и функциональные карты плаэмид 120 и pi47 представлены

35 соответственно на фиг.3 и 4.

Плазмида pPR 12 содержит ген с 1857 термовосприимчивого pZ репрессиора, а плазмида рВ R 322 — ген, несущий устойчивость к тетрациклину. Плазмида р PR 12

40 раскрыта и заявлена в патенте США М

4436815, выданном 13 марта 1984 г. Сачт рестрикции и функциональная карта плазмиды р PR12 представлены на фиг.4. Ecol;Iсайт удаляли из плазмиды pPR 12 путам

45 первого полного переваривания плазмиды рестриктазой EcoR 1 с обработкой ф-том

Кленова. Затем вектор рециркулизовали лигированием для образования плазмиды

pBL12 hRI. Затем плазмиду pP R 12 hHI

50 переваривали рестриктазой AVal с обработкой ф-м Кленова. Переваренную AVal и озработанную ф-том Кленова плаэмиду рР R

12 ЛВ1эатемлигировали в Есо RI — линкеры, разрезали рестриктазои Ecol, а затем ре55 циркулизовали с целью получения плазмиды

pPR 12А R I. Подробные описания конструирования плаэмиды pP R l2A R 1 приводятся в примере 8. Сайт рестрикции и функциональная карта представлЕны на фиг.4.

1780541

2;9 kb Pstl — ECOR I фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12А R I выделяли после первого переваривания плазмиды" ресктриктазами Pstl и Есо R 1, Плазмиду pL47 переваривали рестриктазами Pstl и Вап1Н!, 5 и,2,6 kb Pstl-BamHI фрагмент рестрикции выделяли, При помощи отдельной реакции плазмиду р247 переваривали рестриктазами Есо R I и BamHI, а-- 1,03 kb Eco R I—

BamHI фрагмента выделяли,.--2,7 kb Pstl- 10

BamHI и..1,03 kb Eco R I — BamHI фрагмента ресктрикции плазмиды pL47 лигировали в 2,9 kb Pstl-EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I с целью образования плазмиды pL110, Подробное описание кон- 15 струирования плазмиды pL110 приводится в примере 9, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рЕ110 представлены на фиг.4.

Вектор типа ВК-энхансера, рассматри- 20 ваемый в настоящем изобретении, содержит кассету ВК-энхансерэ и позднего промотора аденовируса, а также ген, несущий устойчивость к гидромицину, и мышиный ген дигидрофолат-редуктазы (dhbr). 25

Использование ВК-вируса в соединении с поздним промотором аденовируса значительно способствует усилению транскрип-. ции рекомбинатного гена в эукариотических клетках хозяина, Ген, несущий устойчивость 30 к гидромицину, используется в эукариотических клетках хозяина в качестве отборочного маркера .Машинный ген дигидрофолатредуктазы при соответствующих условиях амплифицируется в хромосоме хозяина, 35

Эта амплификация, описанная в обзоре

Schimke 1984, Cell 37:705-713, может также включать ДНК-последовательности, близко соприкасающиеся с dhfr геном. Этот dhfr. ген является селектируемым маркером в 40

dhfr отрицательных клетках и может быть использован для увеличения числа копий сегментов ДНК путем экспонирования клеток хозяина для увеличения уровней метотрексэта. 45

Плазмида pLPChd может быть использована для построения эукариотического . вектора экспрессии для экспрессии нового айтитела К$I/4, рассматриваемого в настоящем изобретении. Плазмида pLPChd со- 50 держит ген dhfr промотор аденовируса типа-2 и энхансер ВК-вируса. BK-вирус, содержащий энхансер ВК-вируса, может быть закуплен или легко выделен в больших количествах так, как описано в примере 10. 55

ВК-вирус также имеется в Американской коллекции типовых культур под входящим номером ATCCVR-837. Сайт рестрикции и функциональная карта ВК-вируса представлены на фиг,5, ВК-вирусный геном комбинировали с частью плазмиды pdBPV. MMT neo с целью построения плазмиды рВК neol и рВК пео 2.

Плазмида pdBPV-MMT пео размером около

15 kb, имеющаяся в ATCC под номером

АТСС 37224, содержит репликон и ген

P лактомазы от плазмиды рВ R 322, промотор мышиного металлотионина, помещенного в целях стимуляции экспрессии структурного гена, который кодирует фермент, несущий устойчивость к неомицину, и

8 kb ДНК бычьего вируса папилломы (В PV). Пл азмиду pd В PV-MMTneo можно переваривать рестриктирующим ферментом BamHI для получения двух фрагментов; . 8 kb фрагмента, содержащего BPV

Д Н К, и -7 kb фрагмента, содержащего другие последовательности, описанные выше, ВК-вирус имеет только один сайт рестрикции BamHI и плазмиды рВК neol и рВК пео 2 конструировали путем лигирования 7 kb BamHI фрагмента рестрикции плазмиды pdBPV ММТ пео в ДНК BamH1 — линеаризованного ВКвируса. Конструирование плаэмид рВК neol и рВК пео 2, которые отличаются только ориентацией дНК ВК-вируса, описано в примере 11. Плазмида pBK neol содержит -.2,1

kb фрагмента рестрикции Sall*-Hindlll, тогда как плазмида рВК пео 2 содержит;,1,0 kb фрагмента рестрикции. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды рВК neol представлены на фиг,5, Каждая из плазмид рВК neol и рВК пео

2 содержит полный геном ВК-вируса, включающий последовательность энхансера; поэтому являются ценными исходным материалом для вектора экспрессии настоящего изобретения, Вектор экспрессии, плазмида рВв cat, содержит последовательность ВК-энхансера в тандеме с поздним и ромотором аденовируса типа 2, помещенного для стимуляции экспрессии фермента хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT).

Плазмида pSV2 cat служит в качестве подходящего источника САТ-гена и может быть взята из АТСС под входящим номером АТСС

37155, ДНК человеческого аденовируса типа 2 является коммерчески доступной и может быть взята из АТСС под номером

ATCCVR-2, Иллюстративную плазмиду

pBZcat конструировали путем лигирования содержащего поздний промотор Accl-PVU II фрагмента рестрикции ДНК человеческого аденовируса типа 2 в BCII-линкеры с тупым концом, которые соединяются только с PVU

II-концом Accl-PVU II фрагмента рестрикции. Полученный в результате фрагмент затем лигировали в 4,51 kb ACCI-PVU фрагмента рестрикции плазмиды pSV2cat с целью получения промежуточной плэзмиды

1780541

10

45

55

pLPcat. Целевую плазмиду pBLcat конструировали иэ плазмиды pLPcat путем лигирования начала репликации и энхансер-содержащего(1,28kb) АссН Чи И-фрагмента рестрикции

ДНК BK-вируса в 4,81 kb Accl-Stu фрагмента рестрикции плазмиды р1 Рсва. Конструирование плазмиды рВ1сатописзно ниже в примере

12. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPcat u pBLcat представлены на фиг.6.

Затем из плазмид рНС7, pSV2-dpt и pSV2

Р-глобина конструировали плазмиду pL133.

Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность, которая кодирует человеческий белок. С, Плаэмида рНС7 может быть выделена из Е. coll К12 RR1/ рН С7, которая имеется в NRRL под номером NRRL 1-15926.

Плазмиду рНС7 разрезали рестриказой

Baml и выделяли 1.25 kb фрагмента рестрикции. Затем добавляли линкеры и фрагмент разрезали рестриказами Apal u HI nd И, а после этого выделяли 1,23 kb фрагмента рестрикции. Далее плазмиду рНС7 разрезали рестрикаэой Pst, 0,88 kb фрагмента рестриказы выделяли, добавляли линкеры, фрагмент снова разрезали рестриктазами и выделяли 0,19 kb Apal-Bg II фрагмента рестрикции. Плазмиду pSV2 gpt (АТСС 37145) переваривали рестриктазами Hind III u Bg

lll и выделяли 5,1 kb фрагмента. - 1,23 kb фрагмента рестрикции Hlndl1l-Apal,- 0,19 kb фрагмента Apal-Bg III и 5,1 kb фрагмента

Hindlll-Bglll ëèrèðoâaëè вместе для получения промежуточной плазмиды pSV 2-НРС8.

Более подробное обьяснение конструирования плаэмиды psV2-НРС8 приводится в примере 13. Схема этого конструирования представлена на фиг,7.

Затем плаэмиду pSV2-НРС8 разрезали рестриктазами Hindlll u Sall и выделяли

-0,29 kb фрагмента рестрикции. Таким же образом разрезали также плазмиду pSV2НРС8 рестриктазами Bg ill u Sall и выделяли фрагмент рестрикции (1,15 kb).

Плазмиду pSV2- Р-глобин (ЯВИ B-15928) разрезали рестриктазами Bg IИ и Hind 1И, выделяли 4,2 kb фрагмента рестрикции. Эти три фрагмента затем лигировали вместе с целью получения р1 133.Плазмиду pL133 переваривали рестриктазой Hlndlll, затем обрабатывали щелочной фосфатаэой.

Плазмиду pBLcat также разрезали рестриктазой Htndlll и выделяли n0,87 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в вектор разрезанной Hind Ill.è обработанной фосфатаэой плазмиды pL133 с целью получения плазмиды pLPC. Так как фрагмент

Hlndlll плаэмиды pBLcat может быть встав. лен в плазмиду pL133 в двух ориентациях следует отметить, что pLPC является плазмидой, где надлежащая ориентация обеспечивает 1 kb фрагмента Ndll Stul. Плаэмида

pLPC подобно плаэмиде pL133 содержит энхансер, ранний и поздний промоторы, Т-антиген связывающие сайты и начало репликации

SV40. Подробные протоколы конструирования плаэмид pL133 и pLPC приведены в примерах

13 и 14. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pL133 и pLPC представлены соответственно на фиг.7 и 8, Элементы SV40, присутствующие на плазмиде pLPC, расположены слишком близко и трудно различимы. Связывание Тантигена с Т-антигенсвязывающими сайтами, необходимое для SV40 репликации и применяемое для усиления транскрипции из SV40 позднего промотора, неожиданно имело подобное действие на ВК поздний промотор. Так как высокий уровень Т-антигенстимулированной репликации плазмиды, содержащей SV40 начала ренликации, является обычно летальным для клеток хозяина ни плазмида pLPC, ни плазмида р1 133 не могут стабильно поддерживаться в качестве эписомных (экстрахромосомных) элементов в присутствии SV40 T-антигена, а скорее эти две плазмиды должны интегрироваться в хромосомной ДНК-клетке хозяина для своего стабильного существования.

Полная структура области ВК-энхансера полностью совпадает со структурой 40 для

ВК-энхансера начала репликации, ранних и поздних промоторов и ВК-аналога Т-антигенсвяэывающих сайтов являются близко расположенными и поэтому трудно различимыми на ВК-вирусной ДНК. Однако при выращивании в присутствии BK-Ò-антигена плазмида, содержащая ВК начало репликации и Т-антигенсвязывающие сайти, не реплицируется до некоторого предела, который . является летальным, и стабильно поддерживается в качестве эписомного элемента в клетке хозяина. Более того репликация, стимулированная Т-антигеном, может быть использована для увеличения числа копий вектора, содержащего ВН-начало репликаций, так, что если приложить давление отбора, большее число копий плазмиды, будет интегрироваться в хромосомную ДН К-клетки хозяина. Очевидно, вследствие сходных структурно-функциональных соотношений между ВК- и SV40 Т-антигенами и их соответствующих связывающих сайтов ВК-репликация также стимулируется SV40 Т-антигеном.

Эписомное поддержание вектора экспрессии рекомбинантной ДНК не всегда является предпочтительным при интеграции в хромосому клетки хозяина. Однако из-за отсутствия селектируемого маркера, функцио17

1780541

10

30

55 нирующего в эукариотических клетках, идентификация стабильных эукариотических трансформантов плаэмиды pLPC является затруднительной, если только плазмида pLPC не трансформируется совместно с другими плазмидами, содержащими селектируемый маркер.

Следовательно, плазмида pLPC была модифицирована с целью получения производных плаэмид, являющихся селектируемыми в эукариотических клетках хозяина. Это достигается лигированием плазмиды pLPC в часть плазмиды pSV2 hyg плазмиды, которая содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину. Плаэмида pSV2 hyg может быть получена из Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL), Пеория, 1 61640, под номером NRRL В-18039.

Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pSV2 hyg представлены на фиг.8.

Плаэмиду SV2 hyg переваривали рестриктазой BamHI, и выделяли 2,5 kB фрагмента ректрикции BamHI, который содержит полный ген, несущий устойчивость к гидромицину, затем обрабатывали ферментом Кленова (большой фрагмент, полученный при дроблении субтилизином

Е, coli ДНК-полимеразы 1) и после этого лигировали в обработанные ферментом

Кленова 5.82 kb Ndel-Stul фрагмента рестрикции плазмиды pLPC с целью получения плазмид pLPChyg 1 и pLPChyg 2.

Плаэмиды pLPChyg 1 и pLPChyg 2 отличаются между собой только ориентацией фрагмента, несущего устойчивоСть к гидромицину. Плаэмида pLPChyg содержит п 5,0 kb фрагмента Hindll, тогда как плазмида

pLPChyg 2 содержит 1,0 kb фрагмента. Протокол конструирования для плазмид р РСйу9 и pLPChyg 2 приводится в примере 15, Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPChyg 1 представлены на фиг.8.

Затем конструировали плазмиду pBL32, которая содержит мышиный ген (dhfr) гидрофолат-редуктазы. Плазмиду рТРА102 (NRRL В-15834) разрезали рестриктазой 1й

ill и выделяли 4,4 kb фрагмента ресктрикции. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, добавляли линкеры и затем разрезали рестриктазами HindiÈ вЂ” BamHI c целью получениям2 kb фрагмента рестрикции, затем путем лигирования 288 п,о, Cla1 — EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102 в Cia I — EcoR I в разрезанный вектор рКС