Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк pps 20, кодирующей изопенициллин-n-синтетазу, способ получения штамма сернаlоsроriuм асrемоniuм, обладающего активностью изопенициллин-n-синтетазы

Патент 1780542

Авторы

Классы МПК

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к химической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N-синтетазу Конструируют рекомЬинантную плазмидную ДНК pPS20 путем лигирования Hind III фрагмента плазмиды размером 2,5 кв и Hind III фрагмента плазмиды 335. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Cephalosporlum acremonlum ATCC 11550 с последующим культивированием, выделением целевого продукта. 1 табл

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.3 Г (51) 5- С 12 N 15/52, 15/80

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР

I (ГОСПАТЕНТ СССР) 1 . ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕ НТУ (21) 4027382/13 (22) 21.04,86 (46) 07.12.92. Бюл, 1ч . 45 (31) 725870 (32) 22.04.85 (33) US (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Томас Доминик Инголиа, Стефен Виатт

Квинер, Съюллен Мэри Сэмсон и Пол Лютер

Скэтруд (US) (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pPS 20, КОДИРУЮЩЕЙ ИЗОП ЕНИЦИЛЛИН-NСИНТЕТАЗУ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ШТАММА CEPHALOSPORIUM

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N-синтетазы.

Синтетаза изопенициллина-N является катализатором реакции, в которой из д- (L-ааминоадипил)-L- цистеинил-Д-валина образуется изопенициллин N. Эта реакция является основной стадией в биосинтезе та. ких важных антибиотиков, как пенициллины иэ Penicilllum chrysogenum, Cephalosporlum

acremonlum u Streptomyces clavuligerus, цефалоспоритов из С. acremonium и 7-метоксицефалоспоринов из S, clavuligerus.

Последовательность ДН К, кодирующую активность изопенициллин-M- синтетазы

/ выделяют из Cephaiosporium acremonlum, используют для конструирования. векторов экспрессии, которые обеспечивают экспрессию данного вещества.

Клеточные экстракты из Е. соИ, транс- формированные векторами экспрессии, де-

ACREMONIUM, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ИЗОПЕНИЦИЛЛИН-N-СИНТЕТАЗЫ (57) Изобретение относится к химической инженерии, в частности к получению последовательности ДНК, которая кодирует активность изопенициллин-N- синтетазу, Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPS20 путем лигирования Hind Ill фрагмента plT221 плазмиды размером 2,5 кв и Hind Ш фрагмента плазмиды plT 335, Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Cephalosporlum

acremonIum АТСС 11550 с последующим культивированием, выделением целевого продукта. 1 табл, монстрируют активность изопенициллин-Nсинтетазы без предварительной обработки.

В результате трансформации

Cephalosporlum векторами экспрессии in

vivo получают более высокие уровни изопенициллин-N- синтетазы в трансформантах.

ДНК, кодирующую изопенициллин-Nсинтетазу, выделяют из Cephalosporlum

acremonlum, Данную ДНК используют для конструирования векторов, которые обеспечивают экспрессию активности изопенициллин-N-синтетазы в широком круге клеток реципиентов. Все организмы, которые продуцируют генициллины и цефалсспорины, используют общие предшественники д (L/à -аминоадипил) - L

- цистеинил-Д-валин и изопенициллин.

Последовательности ДНК получают из геномной ДН К Cephalosporlum acremonlum, они являются гомологичными с нуклеотидной последовательностью соединений ДН К, кодирующих активность синтетазы изопе1780542 экспрессией гетерологическин генов в

С.acremonium.

10 10 : 20 30 40

5 -АТС ССТ ТСС СТТ ССА GTT CCA GTG GCC AAC GTC ССС ССЛ АТС GAT GTC

ИЕТ GLY SER VAL PRO VAL PRO ЧАЬ АЬЛ ASN VAL PRO АРС ILE ASP VAL

5 10 15

15 50 60 70 80. 90

TCG CCC CTA ТТС GGC GAT GAC AAG GAG AAG AAG СТС GAG СТА GCT CGC

SER PRO LEU Р)(Е GLY ASP Л$Р LYS GLU LYS LYS LEU GLU VAL ALA ARG

20 25 30

100 110 120 130 140

GCC АТС GAC GCC GCA TCG CGC САС ACA GGC ТТС ТТТ TAC GCG СТС AAC

ЛЬА П.E ASP ALA AI.À SER ARG Л$Р T((R GLY РНЕ РНЕ TYR АЬА VAI. А$К

35 40 . 45

150 160 170 180 190

CAC GGT GTC GAC CTG CCG TGG СТС TCG CGC GAG АСС ЛЛС ААЛ ТТС CAC (П$ GLY УМ. ASP LEU PRO TRP LEU SER ЛЕС FLU ТНВ ASN LYS РНЕ HIS

50 55 60

200 . 210 220 230 240

ЛТС ЛГС ЛТС ЛСС СЛС СЛС СЛС ЛАС TGG CAG CTC GCC ATC CGG GCC TAC

KT $ЕВ ILE ТЙ Л$Р GLU GLU LYS TRP GLN ЬEV Л?.А ILE АВС AI.Ë TYR

65 70 75 80

250 260 270 280

AAC ЛЛС GAG СЛС GAG ТСС СЛС ЛТС CGG GCG GGC TAC ТЛС CTG CCG АТС

ASN ЬУБ СЬЦ HIS GI.U SER GLN ILE ARG ЛЬА GLY TYB TYR LEU РВО II.E

85 90 95

290 300 310 320 330

CCG Г>СС ЛЛС ЛЛС (СС СТС СЛЛ ТСС ТТС TGC ТЛС СТС РЯС ССС ТСС ТТС

РВО С(Х 1Л$ LYS ЛЬЛ VAI. GI,U $ЕВ PHF. СЪ8 TYR ЬЕ(ASN РВ0 SER РНЕ

100 105 110

340 350 360 370 380 . AGC CCA GAC CAC ССС ССЛ ЛТС AAG GAG CCC ACC ССТ ATG CAC GAG ГТС

SER РВО ASI )(1$ PRO ARG II.Е ЬУ$ GLU РВО flfR PRO ИЕТ HIS СЬ(3 VAI.

115 120 125 нициллина N в Streptomyces clavuligerus, Penlcilllum chrysogenum и других организмах, продуцирующих синтетазу изопенициллина й.

Соединения ДНК, кодирующие изопенициллин синтетазу, можно использовать для скринирования геномных библиотек организмов, которые продуцируют изопенициллин-N-синтетазу.

ДНК, кодирующие изопенициллин-Nсинтетазу, получают из геномной ДН К

Cephalosporlum acremonium и выделяют вместе с последовательностью, активирующей транскрипцию и трансляцию, которая контролирует экспоессию геномной

Д Н К, коди рую щей С.acre mon ium изопенициллин-N-синтетазу. Последовательность

ДНК, активирующую транскрипцию и трансляцию, используют для управления

Данная последовательность содержит

5 регуляторные сигналы IPS гена. которые расположены у 3 конца кодирующей нити

1 кодирующего участка IPS гена. Эти 3 регуляторные последовательности кодируют сигналы конца транскрипции и полиадени10 лирования мРНК и процессинга этого (Р$гена. «Наличие этих сигналов в соответствующем положении рекомбинантной ДНК повышает экспрессию целевого продукта, кодируемого вектором в Cephalosporium

15 acremonlum, Ниже приведена последовательность

ДНК. кодирующая активность синтетазы изопенициллина N и соответствующая последовательность аминокислот

1780542

490 500 510 520

GGC ТАС GCT СТС ССС СТА GGT CGC САС GAG GAC ТТС ТТС АСС CGC САС . GLY TYR АЬА 1.Е11 АЕА LEU GLY ARG ASP GLU ASP РНЕ РНЕ THR.ARG HIS

165 170 175

530 540 550 . 560 . 570

ТСС CGC CGT GAC ACG ACG СТС TCG TCG GTC GTG СТС АТС CGT ТАС CCG, SER ARG ARG ASP THR THR LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO 1 8.0 185 190

- 580 . 590 600 . 610

ТАС СТС GAC CCG ТАС CCG GAG CCG GCC ATC MG ACG GCC GAC

TYR LEU ASP PRO TYR PRO GLU PRO ALA П.Е LYS THR ALA ASP

195 200 205

GAC GGC

ASP GLY

670

ACG GTG

THR VAL. 630 640. 650 660

АСС AAG СТС AGC ТТС GAG TGG CAC GAG GAC GTG ТСС СТС ATC

THR LYS LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU .ASP VAL SER LEU П.Е

210 . 215 . .220

680 690 700 710, TTG ТАС CAG TCC СЛС GTG CAG ААТ CTG CAG СТС AAG ACC CCG

LEU TYR GLN SER ASP VAL GLN ASN LEU GLN VAL LYS THR PRO

225 . . 230 235

CAG GGC

GLN GLY

240

730 " 740 750 760

TGG CAG GAC АТС CAG ССТ GAC GAC ACG GGC ТТС СТС ATC ААС TGC GGC

TRP GLN АЯР LE GLN AIA ASP ASP THR GLY PHE LEU ILE ASN CYS GLY

245 :. . 250 ., 255

770 " 780 790 800 810

AGC ТАС АТС GCC CAT ATC ACC САС GAC ТАС ТАС CCG, 4CC CCG ATC САС

SER TYR ИЕТ ALA HIS ILE T11R ASP ASP TYR ТУК PRO ALA ÐRO П.Е HIS

260 265 270

820 830 .- . 840 850 . 860

CGC GTC ААЛ TGG GTC AhC GAG GAG CGC CAG ТСЛ СТС ССС ТТС ТТС GTC

ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN SER ЕЕц PRO РНЕ Р1Я VAL

275 . 280 285

870 880 890 900 910

АЛС CTG GGC TGG GAG GAC АСС ATC САС CCG TGG GAC ССС GCG АСС GCC

ASN LEU GLY TRP GLU ASP ТНВ ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA

290 295 . 300

390 400 410 . 420 430

ААС GTC TGG CCG GAC САС GCG AAG САС CCG GGG ТТС CGG ССС ТТС GCC

ASN VAL TRP PRO ASP GLU ALA LYS HIS PRO GLY PHE ARG ALA PHE ALA

° 130 135 140

l 440 450 460 470 480

GAG AAG ТАС ТАС ТСС GAC GTC TTC GGC СТС ТСС ТСС GCG GTG CTG CGC

GLU LYS TYR TYR TRP ASP VAL РИЕ GLY LEU SER SER ALA VAL LEU ARG

145 150 155, 160

1780542

920 930 940 950 960

AAG СЛТ GGG GCC ААС GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC АТС ТСС TAC

LYS ASP GLY ALA LYS ASP ALA ALA LYS ASP LYS PRO ALA ILE SER TYR

305 310 315 320

970 980 990 1000 .

GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG ААТ GGT

GLY GLU TYR 1.FU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY

325 330 335

CAG АСС TAA"3

GLN T1fR

В е кто р, коди рующий иэопе ни циллинN-синтетазу, модифицируют так. чтобы исключить фрагменты ДНК Cephalosporlum

acremonium, имеющиеся в векторе и кодирующие фермент. Полученный вектор обозначают как plT335, его трансформируют в клетки-реципиенты E.coll К 12JA221 и Е.coll

K12JA221/pIT335. Трансформанты депонируют в коллекции Narthern Regional Research Laboratories,Ðåîãlä, Illlnolc под регистрационным номером М RRL В-15960.

Плазмиду plT335 выделяют из E.coll

K12JA221. Плазмиду plT335 используют в качестве исходного материала для конструирования плаэмиды, обозначенной р! Т337, которая обеспечивает экспрессию высокого уровня изопенициллин-N-синтетазы. Плазмиду plT337 конструируют, лигируя 1,5 кв

Ncol-BamHI: рестрикционный фрагмент с

8,7кв N col вЂ” Ncol и 1,6кв N col-BamHI рестрикционными фрагментами плазмиды

pCZ106.

Плазмида pCZ106 при низких температурах около 25 С, содержащая репликон неорганического размножения, имеет число копий около 10-15 копий на клетку хозяина

Е.соИ. При повышении температуры до около 37 число копий возрастает до около 1000 . копий на клетку хозяина Е,coll. Клетки хозяева Е.coli К12 PV308/pCZ106 депонируют в

Natthern Regional Research Laboratories, Peorid, llllnolc под регистрационным номером N- RRLB-15959.

1,5 кв NCO 1-BamHI фрагмент плазмиды plT335 содержит полную последовательность, кодирующую изопенициллин-йсинтетаэу, и сайт рестрикции Ncol, который представляет собой, 5 вЂ” CCATGG вЂ” 3

3 вЂ” 66ТАСС вЂ” 5 и содержит последовательность

5 вЂ” АТС вЂ” 3

3 вЂ” TAC - S. которая кодирует аминотерминальный метиониловый остаток иэопени25 циллин-N-синтетазы, При температурах около 37 C E.coll K12

РЧ308 / NRR L В вЂ” 15624) клетки, содержащие плаэмиду plT337, экспрессируют изопенициллин-N-синтетазу с высоким

30 уровнем, достигая 9 от полного числа клеток протеина. Неочищенные клеточные экстракты из этих Е. coll К12 PV308/plT337 тоансформантов способны катализировать превращение д /1 -c -аминоадипил вЂ” /1.-ци3S стеинил-Д-валина в изопенициллин N, тогда как клеточные экстракты из нетрансформированных Е.coll К12 PV308 клеток не могут катализировать это превращение, Трансформанты Е.coli р!Т337 экспрес- .

40 сируют изопенициллин-N-сийтетазу с высокими уровнями. достигающими 9 от полного клеточного протеина. Благодаря тому, что культивирование Е.coll менее сложно, чем культивирование природных

45 организмов, которые продуцируют данное вещество Е.coll /р!Т337, трансформанты можно испольэовать для получения изопенициллин-N-синтетазы более эффективно и экономично.

50 Векторы, повышающие внутриклеточную активность изопенициллин-N-синтетазы в клетке реципиенте, трансформированной этой плаэмидой, содержат следующие элементы:

55 1) фрагмент ДНК, кодирующий активность изопенициллин-N-синтетазы;

2) последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию, которая функционирует не только в клетке реципиенте и расположена в правигьной ориентации и

1780542

10 положении, чтобы управлять экспрессией N ñèíòåòàçó Cephalosporium acremonium.

ДНК, кодирующей фермент; Плазмида pPS20 обязательно должна со3) последовательности, обеспечиваю- держать последовательность, актирирующие репликацию, интеграцию, обеспечива- щую транскрипцию и трансляцию данного ют сохранение вектора в клетке хозяине.. 5 фермента.

Естественно, вышеописанный вектор мо- Плазмида pPS20 содержит последоважет также содержать ген, придающий ус- тельность активации транскрипции и транстойчивость к антибиотику или некоторые ляции Cephalosporium acremonlum, которая другие элементы, которые обеспечивают управляет экспрессией ДНК, кодирующей средство отбора клеток реципиентов. 10 активность изопенициллин-N-синтетазы

Плазмида pPS20является примером ти- при конструировании плазмиды pPS20, Она па вектора, сконструированйого для повы- не содержит ни делеций, ни вставок, котошения внутриклеточной. концентрации рые влияли бы на последовательность, актиизопенициллин-N-синтетазы в клетке рецй- вирующую транскип"„""ию и т"а и пиенте и о и г ф, продуцирующегоф-лактамовый ан- 15 ДНК, расположенноис 5 конца кодирующей тибиотик. Плазмиду pPS20 конструируют нити ДНК. Плазмиду pPS20 используют для путем включения 2,7 кв Hind lli рестрик- повышения способности продуцирования ционного фрагмента плазмиды plT221 в антибиотика в клетках Cephalosporium сайт рестрикции Hind ili - 2,7 кв kind ill acremonlum. рестрикционный фрагмент плазмиды 20

plT221 содержит последовательность акти- . Плазмида pPS20 содержит также ген, вирующего транскрипцию и трансляцию re- придающий устойчивость к гидромицину, . на фосфоглицераткиназы (PGK) дрожжей который функционирует в С,acremonlum, и

Saccharomyces cerevisIae, лигированного в позволяетпроизводитьотбор С.acremonlum правильном положении и ориентации для 25 /рР$20 трансформантов. управления экспрессией гена, придающего Плазмида рР$20 трансфо трансформирует сопротивляемость к гидромицину. Так как С.acremonlum через хромосомную интегра2,7 кв Hind- lll рестрикционный фрагмент цию, плазмиды plT 221 может быть включен в Плазмиды pPS20. р(Т335 содержат noHind-1И-расщепленную плазмиду р!Т335 в 30 следовательность, активирующую трансля любой издвух ориентаций, в результате ли- цию и транскрипцию Cephalosporlun, PS20,1. гирования получают плазмиду с pPS20 acremonium. Так последовательнос е ть, акти

P вирующая транскрипцию и трансляцию, 2.7 кВ Hind И1-рестрикционный фраг- С.acremonium, расположена на плазмида мент плазмиды plT221 содержит ген, прида- 35 pIT335 и pPS20 и может регулировать экс.ющий устойчивость к гидромицину, прессиюширокогокругаДНКпоследовательсвязанный с последовательностью, активи- ностей. Активирующая последовательность рующей транскрипцию и трансляцию PGK закодирована на 500 вр Sàl 1-Мсоl редрожжей в правильном положении и ориен- стрикционном фрагменте расположенно т женном ации для экспрессии активности, придаю- 40 непосредственно до и рядом с ДНК, кодирущейустойчивостьк гидромицину(НмР). ющей активность фермента на плазмиде

Плазмида pPS20 содержит ген PGK- plT335 и pPS20. Фрагмент, который вклюнМР и трансформанты Cephalosporlum чает вышеуказанный 500 вр Sal 1-N col

acremonlum (pPS20 отбирают по устойчиво- рестрикционный фрагмент, содержит пости к гидромицину). Плаэмида pPS20 содер- 45 следовательность, an ивирующую трансжит также ДН К, кодирующую крипцию и трансляцию С.acremonlum, изопенициллин-N-сйнтетазу. Частичная ДН К последовательность, аклазмида pPS20 содержит почти 3 кв тивирующая транскрипцию и трансляцию фрагмент геномной ДНК, который располо- Cephalosporlum acremonlum, закодирована жен до ДНК, кодирующей изопенициллин- 50 на плазмиде plT335, вЂ” 380 вЂ” п.о

ЬААТАСТТС ААТАТТССТТ СИТА .Тратт

ЯСТТАТСААС ТТАТААЯЯАА CCAQCQAgAA ." К И ГЛУБИ !".

1780542

kjfP_#_f gTCKACAT (TTJCACCf9 ЛС А ААА !

САБАМ - 6

Последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию Cephalosporlum

acremonlurn, можно использовать для экспрессии любой ДНК последовательности, что иллюстрирует плазмида pPS 21. Плазмида рР S21 является производной плазмиды

Р1Т221, которая получена в результате замены последовательности, активирующей транскрипцию и трансляцию PGK, на последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию С.acremonlum настоящего изобретения.

Эту замену осуществляют вначале, удаляя 30 вр Хма! фрагмент из плазмиды рIT221 до образования плазмиды pps19.

Плазмиду pPS19 расщепляют BamHI, обрабатывают фрагментом Кленова полимеразы

1ДНК Е,со!1. В результате расщепления Bam

1 получают 230 вр BamHI рестрикционный фрагмент, содержащий последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию PGK, после обработки Кленова получают двунитевую ДНК вне перекрывания однонитевой BamHI. Затем крупный

7,7 кв BamHI фрагмент плаэмиды pPS19 лигируют с 0,8 кв после обработки фрагментом Кленова Ncol рестрикционного фрагмента плазмиды р!Т335, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию

С,acremonlum.

Рестрикционный фрагмент Ncol после обработки фрагментом Кленова может быть включен в одной из двух ориентаций, причем только одна из возможных ориентаций достигает цели вЂ” правильного расположения последовательности, активирующей транскрипцию и трансляцию Cephalosporium

acremonfum для управления экспрессией гена, придающего устойчивость к гидромицину. .Плаэмида pPS21A использует последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS гена для экспрессии гена, придающего. устойчивость к гидромицину в

Cephalosporlum acremonium. Промежуточную плазмиду, обозначенную pPS23, используют при конструировании плазмиды

pPS21A. Плазмиду pPS23 конструируют, выделяя 850 вр Ncol рестрикционный фрагмент плазмиды plT335, который содержит активирующую последовательность IPS гена, присоединяя линкер-совместимые с

BamHI u Ncol-однонитевые перекрывания с

850 Вр Ncol-фрагментом и лигируя - 860 вр BamHI рестрикционный фрагмент с

BamHI расщепленной плазмидой р VC8. Это приводит к двум плазмидам. обозначенным

5 pPS23 и pPS23.1. которые отличаются только по ориентации включенного BamHI рестрикционного фрагмента.

Плазмиду pPS23 гидролизуют рестрикционным ферментом BamHI и 860 вр

10 BamH! рестрикционный фрагмент. который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS, выделяют и лигируют с BamHI обработанной плазмидой pPS19. В результате такого лиги15 рования получают ряд нужных плазмид, включая плазмиду pPS21A . Плазмиду рР$21А получают при лигировании 0,86 кв

BamHI рестрикционного фрагмента плазмиды pPS23 с 7,7 кв BamHI рестрикционным

20 фрагментом плазмиды pPS19, Она содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS гена, расположенного в соответствующей ориентации для чпоавления экспрессией гена, 25 придающего устойчивость к гидромицину.

Линкеры, которые используют при конструировании плазмиды pPS23, обеспечивают сохранение соответствующего считывающего фрагмента в плазмиде pPS21A для экс30 прессии гена устойчивости к гидромицину.

Плазмида pPS22 содержит те же самые последовательности, что и плазмида

pPS21A, но BamHI рестрикционный фрагмент, который содержит последовательно35 сти активации IPS гена, ориентирован в противоположном направлении по отношению к ориентации в плазмиде pPS21A, Плазмида рР$22 не сообщает устойчивости к гидромицину Cephalosporium acremonium

40 при высоких частотах, так что плазмида

pPS22 служит удобным негативным контролем в трансформациях С,acremonlum.

Плазмида рР819 содержит последовательность, активирующую транскрипцию и

45 трансляцию PG K Saccharomyces cerevlsiae в соответствующей ориентации для управления экспрессией гена. придающего устойчивость к гидромицину. Обработка плазмиды рР$19 рестрикционным ферментом BamHI

50 приводит к получению двух фрагментов: один фрагмент 230 вр содержит последовательность активации PGK, а другой фрагмент 7,6 кв содержит большую часть

1780542 последовательности, кодирующей ген. при- Плэзмида, обозначенная pPS 6, облададающий устойчивость к гидромицину.. ет повышенной способностью к интегра

В результате циркуляризации 7,6 кв . в хромосомную ДНК С. acremonium за счет

BamHI рестрикционного фрагмента плаз- присутствия ДНК, кодирующей РНК, миды рР$19 получают плазмиду рР$24, в 5 Плазмида pPS 6 содержит 3,7 кв Хма! которой нет последовательйости, активиру- рестрикционный фрагмент rPHK с генами ющей трайскрипцию и трансляцию для уп- Cephalosporlum acremonium. Присутствие равления эксйрессией гена, придающего этого Хма! фрагмента на плазмиде повышаустойчивость к гидромицину, имеющемуся ет вероятность того, что плазмида интегрина векторе, . 10 руется в С. acremonium гомологичной

Плазмиды pPS25 и pPS25Ë получают рекомбинацией при трансформации плазлигированиемдвух BamHI рестрикционных миды в С,acremonlvm. Плазмиды рР$30 и фрагментов плазмиды рР$19 с 860 pPS30,l конструируют путем включения врВавН! рестрикционным фрагментом 3,7 кв XMal рестрикционного фрагмента плазмиды pPS23. B плазмиде pPS25 обе 15 плэзмилы oPS 6, который содержит часть последовательности активирования PGK и генов rPHK С.acremonium в единственном

iPS находятся в нужной ориентации для уп- Хмэ! сайте плазмиды рР5 21А. I!лазмиды равления экспрессией гена, придающего ус- pPS30 и pPS30.I различаются только ориентойчивость к гидромицину. Плазмида pPS25 тацией Хма! рестрикционного фрагмента. содержит последовательность, активирую- 20 Плазмиды рР531 и pPS31,1 констру юlP конструируют щую S, расположенную непосредственно путем включения 3,7 кв XMal рестрикционперед кодирующей последовательностью ного фрагмента плазмиды рР$6 в единстгена, придающего устойчивость к гидроми- венный XMai сайт плазмиды рР$29, цину, и последовательность, активирующую Плазмидные векторы, использующие

PGK и расположенную непосредственно пе- 25 последовательность активации транскрип-!

Р ред последовательностью, активирующей ции и трансляции гена IPS Cephalospo i

S. Плазмида pPS25 придает устойчивость acremonlum для управления экспрессией гек гидромицину Cephalosporium acremonium.. на, придающего устойчивость к гидромициПлазмида pPS25;1 отличается от плаз- ну, значительно лучше плазмид,-которые миды pPS25 только ориентацией- 0,23 кв 30 используют последовательность, активирBamHl рестрикционного фрагмента, кото- ющую PGK Saccharomyces сегейз!ае для упь, активирурый содержит последовательность, активи- равления экспрессией гена, придающего рующую PGK. В плазмиде pPS25.1 устойчивость к гидромицину в последовательность, активирующая PGK, С.acremonium. Преимущество векторов: (1) расположена не в той ориентации, которая 35 частота трансформации, которую измеряют позволила бы последовательности, эктиви- по числу трансформантов СерЬа!озрог!ив рующей PGK, управлять экспрессией гена, acremonium, устойчивых к гидромицину на придающего устойчивость к гидромицину. микрограмм использованного при трансПлазмиду pPS28 получают при исключе-, формации вектора ДНК, в 50-300 раз выше нии из плэзмиды pPS 21А -1,85 кв Ps< I 40 прииспользовании!РЯ последовательности рестрикционного фрагмента, который со- и активации по сравнению с PGK для упрэвдержит источник репли кации ления экспрессией гена, придающего устойCephalosporium. Плазмиду pPS 29 получают чивость к гидромицину на вектор, f2J время в результате делецйи из плазмиды pPS 21 А регенерации, которое определяют как вреPst I фрагмента для получения плазмиды 45 мя, которое необходимо, чтобы колония стаpPS 28 вместе с 0;49 кв Pst I рестрикцион- ла видимой невооруженным глазом после ным фрагментом, котбрый расположен меж- трансформации, примерно на 50 g, меньше ду Cephalosporlum источником репликации при использовании активирующей последои последовательностью активации IPS гена вательности в противоположность PGK, кона плазмиде рР $21А.. 50 торую используют для управления

-3,45 кв Hind III рестрикционный фраг- экспрессией гена, придающего устойчимент плазмиды pPS 21А включают в Hind lli вость к гидромицину на вектор. сайт плазмиды plT335 до йолучения йлаз- Последовательность, активирующую мид pPS 26 и рРЗ 26Л, которые отличаются,, транскрипцию и трансляцию Cephalosporium только в плане ориентации включенного 55 acremonlum, используютдля экспрессии noHind III рестрикционного фрагмента из следовательностиДНК в С. acremonlum. Поплазмиды pPS21A. Плазмиды pPS26 и следовательность, активирующая

pPS26 Л содержат интактный IPS ген из транскрипциюи трансляцию С.acremonium.

Cephalosporium acremonium и ген, придаю- закодирована в -0,5 кв Sall вЂ” NCol рестрикщий устойчивость к гидромицину. ционном фрагменте плазмиды plT335.

17В0542

Итак, осуществлено клонирование интактной функциональной последовательности ДНК Cephalosporium acremonium, которая кодирует не только аминокислотную последовательность синтезазы изопенициллина N, но также последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию изопенициллин-N-синтетазы в

С.acremonium, IPS ген содержит последовательность, расположенную после клонирующего участка и ответственную за сигналы окончания транскрипции мНРК полиаденилирования и процессинга, Обычно последовательности, ответственные за окончание транскрипции, полиаденилирование мРНК и процессинг содержатся в участке - 50 вр после стоп-кодона. -0,5 кв BamHI вЂ” Pst I фрагмент, который содержит IPS карбокситерминальную, кодирующую ДНК и его последующие последовательности, также содержит сигналы окончания транскрипции и мРНК полиаденилирования и процессинга

IPS гена, Плазмиду pPS 27 конструируют путем объединения 1,4 кв BamHI вЂ” Xho I рестрикционного фрагмента плазмиды plT335 и Sal ! вЂ” BamHl плазмиды pVCS (перекрывания

Sal! и Xho! совместимы) до получения плазмиды р!ТЗ36, Плазмиду PIT336 расщепляют рестрикционным ферментом Pstl и рециркуляризуютдля исключения всех последовательностей

ДНК Cephaiosporium из плазмиды за исключением 0,5 кв BamHI вЂ” Pst рестрикционного фрагмента, который содержит сигналы окончания транскрипции и мРНК полиаденилирования и процессинга IPS гена до получения плазмиды рР$35.

Затем плазмиду pPS 35 расщепляют рестрикционным ферментом HInd !!! и 2,3 кв

Hind ill рестрикционных фрагментом плазмиды pPS 29, который содержит последовательность, активирующую транскрипцию и трансляцию IPS гена, и ген, придающий устойчивость к гидромицину, включают в Hind

lll- гидролизованную плазмиду pPS 35 в нужной ориентации до получения плазмиды

pPS 27.

Производное плазмиды pPS 27 конструируют, выделяя 2,3 кв Hind Ill и 0,5 кв

Hind III вЂ” Bam Hl рестрикционные фрагменты плазмиды pPS27, и объединяют эти фрагменты с 5,9 кв Bg ill вЂ” Hind ill фрагментом плазмиды plT 335 до получения плазмиды

pPS 34. Плазмида pPS 34 содержит как ген, придающий устойчивость к гидромицину, так и ген, кодирующий синтетазу изопенициллина N, контролируемый регуляторными элементами IPS гена.

Плазмиду Р!Т 3". 6 используют в качестве исходного материала для конструирования плазмиды, которая интегрируется геном

Cephalosporium acremonium в районе гена иэопенициллин-N- синтетаэы.

Плазмиду pPS 37 используют для трансформации штамма С. acremonlum, в результате получают мутанты этого штамма, дефектные по гену IPS, если плазмида pPS

37 интегрирует в кодирующий участок IPS гена, Плаэмиду pPS 37 конструируют путем клонирования 3,45 кв Hind ill фрагмента плазмиды pPS 21А, который содержит ген, придающий устойчивость к гидромицину, под контролем последовательности IPS гена в плазмиду plT336, обработанную Nru I, Плазмида р!Т336 имеет единственный Nru I сайт, расположенный в участке IPS, Включение 3,45 кв Hind вЂ” Itl фрагмента, который имеет тупой конец после обработки ферментом Кленова, в Nru !-гидролизованную плазмиду plT336 приводит в действительности к получению двух плазмид, обозначенных как

pPS 37 и pPS 37.1 которые отличаются только по отношению к ориентации включенного фрагмента. Обе плазмиды вЂ” плазмида

pPS 37 и плазмида pPS37.1 пригодны для трансформации С. acremonium и получения устойчивых к гидромицину и с нехваткой IPS трансформантов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ll р и м е р 1, Культура Е. соИ К12 J А

221/plT335 и выделение плазмиды pIT335.

А. Культура Е,coll K12JA221/ðIT335, Лиофильную Е.coll К12 JA221/plT335 получают из Northern Regional Research

Laboiatories, Reoria, Hlinois под регистрационным номером NRR L В-15960, Один литр 1=бульона (10 г триптона, 10

r NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащий 50 мкг/мл ампициллина, засевают культурой Е.со!! К12 J А221/plT335 и инкубируют в воздушном шейкере при 37"С до достижения оптической плотности при

590 нм (О.Д. ago) 1 единицы поглощения. В это время к культуре добавляют 150 мг хлорамфеникола. Инкубирование продолжают около 16 ч, добавление хлорамфеникола ингибирует синтез протеина, но не подавляет плазмидную репликацию.

В. Выделение плаэмиды р!Т335.

Культуру, полученную в примере IA, центрифугируют в роторе со скоростью 6000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Полученную надосадочную жидкость сливают, а клеточный остаток промывают в 40 мл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 7,5 10 MM NaCI и 1, мМ ЕДТА), а затем- снова осаждают.

После повторного сливания надосадочной

1780542 жидкости клеточный остаток замораживают между 0,5 и 1,0 ед. поглощения, Когда эти в бане со смесью сухой лед-этанол, а затем значения для культуры достигаютинтервала оттаивают. Оттаявший клеточный сгусток 0,5 вЂ” 1,0 ед, поглощения в оптической плотповторно суспендируют в 10 мл раствора ности, температуру повышают до 37 C и ин25% сахарозы и 50 MM ЕДТА. Затем добав- 5 кубирование продолжают в течение 2-6 ч, ляют и перемешивают 1 мл 5 мгlмл лизо- Репликон неограниченного размножения, цимного раствора, 3 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,07 как было указано ранее, чувствителен к теми 100 мкл 10 мг/мл R ИАзы А, раствор инку- пературе и теряет контроль за числом копий бируют на льду в течение 15 мин, 3 мл лизи- при 37 С. Инкубирования при 37 С в течерующего раствора, полученного при 10 ние2 вЂ” 6чдостаточнодлянеконтролируемой смешивании 3 мл 10% Тритон-Х 100, 75 мл, репликации.

0,25 M ЕДТА, рН 8,15 мл 1М Трис-HCI, pH После инкубирования при 37 С в тече8,0 и 7 мл воды, добавляют к клеткам; обра- ние 2 вЂ” 6 ч клетки собирают и выделяют плазботанным лизоцимом, перемешивают и миную ДНК pCZ106. Получают около 5 мг полученный раствор инкубируют на льду в 15 плазмидной ДНК pCZ106 и суспендируют в течение еще 15 мин. Лизированные клетки 5 мл ТЕ буфера. замораживают в бане со смесью сухой лед- В. Ncol u BamHI расщепление плазмиэтанол, а затем оттаивают. ды pCZ106 и выделение 8,7 кв Ncol вЂ” Ncol u

Клеточные осколки удаляют из раствора 1,6 кв Ncol- BamHI рестрикционных фрагцентрифугированием при 25000 об/мин в 20 ментов плазмиды pCZ106. течение 40 мин в SW 27 роторе и экстраги- Приблизительно 25 мкг, что соответстрованием буферированным фенолом. После вует25 мкл, плазмидной ДНК рС2106 добавдобавления 30,44 r CSCI и 1 мл 5 мг/мл ляют и перемешивают с 10 мкг 10Х BamHI раствора этидиумбромида обьем раствора реакционного буфера вЂ” 1,5 М NaCl, 60 мМ устанавливают 40 мл и помещают в кювету 25 трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ MgClz и 1 мг/мл

VTi 50 ультрацентрифуги, После герметиза- бычьей сыворотки альбумина (BSA), 5 мкл ции кюветы раствор центрифугируют в VTI (50 единиц) рестрикционного фермента

50 роторе при 42000 об/мин в течение 16 ч. BamHI,5мкл(50единиц) рестрикционного

Полученную плазмидную полосу визуализи- фермента Ncol и 55 мкл Н О. Полученный руют, облучая ультрафиолетовым светом, 30 реакционный раствор инкубируют при 37 С выделяют, а затем помещают в VTI 75 кюве- в течение 4 ч, после чего реакция практичету и ротор и центрифугируют при 50000, ски завершается, об/мин в течение 16 ч. Все необходимые Ncol вЂ” BamHI реакционную смесь обраизменения в объеме осуществляют, добав- батывают электрофоретически на 1%-ном ляя TES, содержащий 0,761 гlмл CSCI, Плаз- 35 агарозном геле до четкого отделения целемидную полосу снова выделяют, вых фрагментов 1,6 кв Ilcol-BamHI и 8,7 экстрагируют насыщенным солевым изо- квйсо!-Ксо!отдругогопродукта расщеплепропанолом для удаления этидиумбромида ния., 0,3 кв рестрикционного фрагмента. и разбавляют 1; 3 ТЕ$ буфером. Затем к Визуализацию обработанной электрофорераствору добавляют два обьема зтанола и 40 зом ДНК осуществляют подкрашиванием инкубируютв течение ночи при-20 С. Плаз- геля в разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) мидную ДНК таблетируют центрифугирова- этидиумбромида и экспонированием поднием раствора в SS 34 роторе в течение 15 крашенного геля длинноволновым ультра-. мин при 10000 об/мин. фиолетом. После определения положения

1 мг плазмидной р!Т335 ДНК.. получен- 45 целевых фрагмейтов s геле делают небольной таким способом, суспендируют в 1 мл шую щель перед каждым из целевых фрагTE буфера (10 мМ Трис-HCI, рН 8,0 и 1 мМ ментов и,в каждую щель помещают

ЕДТА) и хранят при -20 С. - - -- .: небольшие кусочки мембраны, При продолПример 2. Конструирование плазми- жении электрофореза ДНК нековалентно ды plT337. А. Культура Е.соИ К12 PV308/рС 50 связывается с ДЕАЕ мембраной. После того

Z106 и выделение плазмиды pCZ106. как целевые фрагменты связывают с ДЕАЕ

Лиофил культуры E.coll К12 мембраной, эти мембраны извлекают и проРЧ308/pCZ106 получают из Северных реги- мывают буфером с малым содержанием соональных исследовательских лабораторий, ли (100 мМ KCI, 0,1 М ЕДТА и 20 мМ

Пеория, Иллинойс, под регистрационным 55 Трис-HCI, рН 8). Затем каждую мембрану. номером N. RR LB-15959, Лиофил использу- помещают в небольшую ампулу и погружают для инокулирования 1 л L-бульона, со- ютвбуферсвысокимсодержаниемсоли(1М держащего 50 мкгlмл канамицина, а затем NaCI, 0,1 мМ ЕДТА и 20 мМ Трис-HCI, pH 8) инокулированный бульон инкубируют при и инкубируют при 65 С в течение 1 ч для о

25 С в воздушном шнейкере до О.Д, 59ц удлинения ДНК из ДЕАД бумаги. После ин19

1780542

20 кубирования при 65ОС инкубационный буфер собирают и мембрану промывают концентрированным солевым раствором.

Промывочный раствор сливают с инкубационным буфером перед сбором целевых фрагментов ДН К, . Обьем раствора ДНК с высоким содержанием соли устанавливают так, чтобы концентрация NaCI была 0.25 М и затем добавляют три объема холодного абсолютированного этанола. Затем полученные растворы смешивают и помещают при-70 С на 10 вЂ” 20 мин. После охлаждения растворы центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. После еще одного осаждения для удаления остаточной соли ДН К таблетки промывают этанолом, сушат, повторно суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ и они содержат 5,0 мкг целевых 1,6 кв Ncol-ВагпН! и 8,7 кв Ncol вЂ” Ncol рестрикционных фрагментов плазмиды pCZ106, Полученные очи, щенные фрагменты отдельно растворяют s

25 мкл ТЕ буфера и хранят при -20 С.

С.Ncol u BamHI гидролиэ плазмиды

PIT335 и выделение 1,5 кв Ncol вЂ” BamHI фрагмента, который кодирует изопеницил. лин-N-синтетазу, Приблизительно 25 мкг соответствующих 25 мкл ДНК плазмиды plT335 расщепляют рестриктазами Ncol и BamHI, Ncoi вЂ” BamHI, обработанную ДН К, rioMeщают на 1 ) -ный агарозный гель и выделяют целевой 1,5 кв Ncol-BamHI фрагмент.

Получают приблизительно 5 мкг целевого фрагмента, суспендированного в 25 мкл ТК буфера, и хранят при -20 С.

Д. Окончательное конструирование плазмиды р1Т337, 5 мкл 1,6 кв Ncol-BamHI и 2,5 мкл 8,7 йсо Ncol фрагментов плазмиды pCZ106лигируют с 5 мкл 1,5 кв Ncol-BamHI фрагмента плазмиды р1Т335 до получения плазмиды plT337. Реакционный объем составляет 30 мкл и включает указанные фрагменты ДНК, 1,1 мкл (100 ед) Т4

ДНКлигазы, 3 мкл 10Х лигирующего буфера (0,05М Трис-HCI, рН 7,8, 100 мМ МоС12, 200 . MM дитиотреитола QTT), 10 мМ АТР, и 1 мг/мл BSA) и 13,4 мкл Н20. Реакционную смесь инкубируют при 15 С в течение 2 ч, после чего реакция практически завершается. Лигированная ДНК составляет целевую плазмидную ДНК plT337.

Пример 3. Конструирование Е.coll

К12 PV308/р1Т337 и анализ Е.coll продуцирующей иэопенициллин-N-синтетазы.

А. Конструирование Е .coll К12

РЧ308/р! Т337, 50 мл культуры Е.coll К12 PV308/N.RR

LB вЂ” 15624/ в L-бульоне выращивают до

О.Д. 590 0 5 единиц поглощения, Культуру охлаждают на льду в течение 10 мин и клетки собирают центрифугированием. Клетки повторно суспендируют в 25 мл холодного 100 мМ CaCI2 и инкубируют на льду в течение 25 мин. Клетки еще раз осаждают цейтрифугированием, повторно суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМ CaCI2 и инкубируют на льду в течение ночи. 200

10 мкл этой клеточной суспензйи смешивают с легированной ДНК и инкубируют на льду в течение 20 мин, а затем клетки собирают центрифугированием. Клетки повторно суспендируют в 1 мл L-бульона и эту суспенэию

15 инкубируют при 25 С в течение часа, Аликвотные части смеси клеток помещают на

1:агарные (1=бульон с 15 г/л агара) пластины. содержащие 50 мкг/мл канамицина и эти пластины инкубируют при 25ОС. Транс20

55 форманты Е.coll K12 PV308/pIT337 проверяют отбором на устойчивость к канамицину и рестрйкционным. ферментным анализом плазмидной ДНК трансформантов. Плазмидную ДНК получают иэ

Е.coll К12 PV308-plT337 трансформантов, но в меньшем количестве и опускают стадии

CS CI-градиента.

B. Культура Е,coll К12 P V308/plT337 для экспрессии активности синтетазы изопенициллина N;

Некоторые иэоляты E.coll К12

РЧ308/р!Т337 инокулируют в 5 мл аликвотных частей L -бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, и эти культуры инкубируют в воздушном шейкере при 25ОС до тех пор, пока О.Д.ggo не составил 0,2 ед. поглощения. Затем культуры переносят в воэдушный шейкер при 37 С и инкубируют в течение приблизительно 6 ч.

Спустя 6 ч инкубирования. при 37 С собирают по 1 мл каждой культуры и клетки спрессовывают центрифугированием. Клеточные лепешки по отдельности промывают

1 мл 10 мМ NaCI, а затем повторно суспендируют в 1 мл IPS экстракционного буфера (0,05 М Трис-HCI, рН 8.0 0,01 М KCI и 0,01 М

Mg SO4). Затем клетки обрабатывают ультразвуком импульсами по 5,6 с. Время между импульсами облучения ультразвуком составляет 60 с и полученную смесь выдерживают в бане лед-этанол во время этой процедуры. После обработки ультразвуком клеточную смесь центрифугируют для удаления осколков, а затем используют непосредственно в анализе.

С, Анализ активности пенициллин-Nсинтетаэы.

Реакцию контроля фермента проводят в полном объеме 500 мкл. Для начала реакции

1 мл раствора 1,4 мМд (L -а аминоадипил) 1780542

- L -цистеинил-Д-валина и 3,75 мМ ДТТ ос- пептона 5 r, Dlfco дрожжевого экстракта 1,5 тавляют реагировать при комнатной темпе- г, хлористого натрия 3,5 r, безводного двуратуре в течение 30-60 мин для приведения замещенного калий фосфата 3,7 r, монокалюбых димерных трипептидов в мономер- лий фосфата 1,3 г, Difco бычьего экстракта ную форму, 50 мкл каждого из последующих 5 1,5 в 1 л деионизированной воды. Раствор исходных растворов помещают аликвотны- доводят до кипения, охлаждают до 25оС ми частями в каждую контрольную ампулу доводятдо рН 71н.HCI или1н,.NaOM, a затем (стерильные, стеклянные ампулы 13 х 100 выдерживают в автоклаве в течение 20 мин мм1: при 121ОC и давлении 1,055 кг/CM перед

500 мМ Трис-HCl,рН 7,4, 100 мМ KCI, 10 употреблением, Засеянный агар помещают

100 MM М9804, 2 мМ ЕеЯО4 и 6,7 мМ аскор- в пластины 100 х 15 мм в количестве 15 мл биновой кислоты. Затем добавляют различ- засеваемого arapa на пластину, Углубления ные количества экстракта, разбавленного получают отсасыванием 5 мл пипеткой, кажводой до объема 150 мкл, Около 100 мкл дое углубление было 10 мм диаметром. аликвотных частей раствора трипептида до- 15 После подготовки пластин образцы побавляют затем в каждую ампулу, добавлени- мещают в эти углубления, пластины помеем трипептида начинают реакцию. Каждую щают в инкубатор при