Ингибитор рнк-геномных бактериофагов

Ингибитор рнк-геномных бактериофагов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: для борьбы с РНК-геномными бактериофагами в микробиологической промышленности и биотехнологических экспериментах предложены нуклеазы, обладающие ДНК-полимеразной активностью, в качестве последних могут быть использованы как панкреатические дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы, а также эндонуклеазы и рибонуклеазы бактериального происхождения. 4 табл.

,,ÄÖ,, 1781295 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) с < „ " 7 )

-; "-"?.г-, 1

К:АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4832453/13 (22) 31.05.90 (46) 15.12.92. Бюл. N. 46 (71) Казанский государственный университет им. B. И. Ульянова-Ленина (SU) и Лейпцигский университет им. Карла Маркса (DD) (72) И, Б. Лещинская, Ф, Р. Шарийова, М; Н.

Филимонова (SU), Э. Штенц, А. Рокштро и

3. Клуге (Р0) (56) Адамс M., Бактериофаги, М,. Иностранная литература, 1961, с. 57.

Авторское свидетельство СССР

М 1314670, С 12 N 9/14, 1989.

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и биотехнологии и может быть использовано для защиты бактериальных штаммов, используемых в производственных процессах от.бактериофагов, вызывающих лиэис культур.

До сих пор не существует надежного способа борьбы с бактериофагами в микробиологическом производстве. Стерилизация производственных биореакторов . является дорогостоящей, сложно реализуется и не обеспечивает полной гибели бактериофагов, Целью изобретения является повышейие эффективности борьбы с PHK-содержащими бактериофагами в микробиологическом производстве.

Поставленная цель достигается прйменением в качестве ингибиторов PHK-геномных бактериофагов препаратов нуклеаз, обладающих PHK-деполимеразной актив, 2 (54) ИНГИБИТОР PHK-ГЕНОМНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ (57) Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения; для борьбы с

РНК-геномными бактериофагами в микробиологической промышленности и биотехнологических экспериментах предложены нуклеазы, обладающие ДНК-полимеразной активностью, в качестве последних могут быть использованы как панкреатические дезоксирибонуклеаэы и рибонуклеазы, а также зндонуклеазы и рибонуклеазы бактериального происхождения. 4 табл, ностью. Принципиально новые биогенные ингибиторы обладают широким спектром действия по отношению к различным группам бактериофагов и представляют собой нетоксичные экологически чистые вещества, безвредные для производственных штаммов бактерий.

Нуклеазы — белковые ферментные препараты с высокой каталитической активностью и способностью к неспецифическому расщеплению РНК по эндонуклеолитическому механизму до олиго-, три-, ди- и манонуклеотидов, в связи с чем эти ферменты способны ингибировать различные РН К-геномные бактериофаги, например фаги М 12, f 2 и QB Е соИ, а также фаг PP 7 Pseudomonas aeruginosa.

Добавление ферментов в питательную среду в количестве 2-12 мкг/мл (4000 — 5000 ед/мл) практически полностью подавляет развитие фаговой инфекции, не влияет на

1781295 рост и размножение бактерий и, следовательно, на количество и качество целевых микробных продуктов и является экологически безопасным.

Использовали следующие нуклеазы:

Рибонуклеаза Bacillus !меггпесИоз(Биназа, РН Каза Bi, ЕС 3,1.27,2) представляет собой термостабильйый фермент — эндонуклеазу, препарат которой имеет удельную активность — 1,3 х 10 ед/мг белка.

Ферментный препарат выпускается на

Экспериментальном биотехнологическом производстве ЙОС АН Латв, CCP по разра ботанному нами способу.

Рибонуклеаза Bacillus amyloliquefaciens (Барназа, РЙКаэа Ва, ЕС 3.1.27.2) представляет аналог РЙКазы Bi и производится на том же заводе. Удельная активность препарата барназы составляет 2,6 х 10 ед/мг

6 бел ка.

Эндонуклеаза Serratia marcescens (Эн"донуклеаза Sm, ЕС 3.1,30.2) представляет собой теомолабильный фермент — эндонуклеазу, атакующую ДНК и РНК, Удельная активность препарата составляет 0,35 х 10

6 ед/мг белка. Препарат производится на Вышнеполоцком заводе ферментных препаратов Миймедбйопрома СССР.

Рибонуклеаза панкреатическая (РНКаза А; ЕС 3. t.27.5), коммерческий препарат, йройзводимйй на Ленинградском фармзаводе, Представляет собой фермент, расщепляюший РНК с удельной активностью

0,35 х 10 ед/мг белка.

Дезоксирибонуклеаза панкреатическая (ДН Каза 1, ЕС 3.1.21.1), коммерческий препарат, производимый на Ленинградском фармэаводе. Представляет собой белковый ферментный препарат, расщепляющий только ДХК с удельной активностью 0,5х х10 ед/мг белка.

Все исследуемые ферменты — белки, которые быстро разлагаются"в природе, поэтому экологически безопасйы, нетоксичны для человека, животных, растений.

ПрЬтивофаговое действие препаратов было испытано в отношении РНК-содержащих бактериофагов Е, coll u Ps. aeruglnosa o èt:noëüéîààíèåì ñëåäóþùé3< сйстем:

М 12 / Е.coll W 1665 F

f 2/ Е,coll К1046

QB / Е.coll АВ 301

PP 7 / Ps.aeruginosa

Ингибиторная активность нуклеаэ в.отношении бактериофагов ойределялась с помощью луночного метода и методом определения минимальной концентрации ингибированйя в чашках Петри с двухслойным агаром.

При луночном методе в верхний питательный слой вносились бактерии и соответствующие бактериофаги, а в лунки (Д=10 мм) добавляли 0,05 мл ферментного раствора.

Чашки инкубировали 24 ч при 37 или 28 С (Е.coll и Ps,aeruginosa соответственно). В направлении градиента диффузии ферментов образовывались радиальные зоны ингибирования фагов, в которых отсутствовали зоны фаголизиса бактерий (негативные ко10 лонии или "бляшки" ), Средние значения зон ингибирования получали не менее чем из 9 повторностей.

Для определения оптимальных доэ препаратов нуклеаз методом минимальных концентраций ингибирования (МКИ) в верхний агаровый слой вносили бактериофаги, бактерии и ферментные препараты в разных концентрациях. После инкубирования в течение 24 ч при 37 (28ОC) определяли про15

20 цент ингибирования путем сравнения числа образованных негативных колоний с числом таких колоний в контрольных чашках, в которые фермент не вносили, Конечная кон25 центрация фермента в агаре, при которой еще происходит образование негативных колоний, считается минимальной концентрацией ингибирования.

Результаты показали, что предлагаемые в качестве ингибиторов препараты нуклеаз

30 действуют на все изучаемые бактериофаги, а именно препятствуют процессу образования негативных колоний, Были получены широкие зоны ингибиро35 вания, свидетельствующие о том, что препараты действуют в очень низких концентрациях, которые образуются в зонах диффузии ферментов.

Действие РНКаэы Bi на РНК-содержа40 щие бактериофаги(метод лунок) показаны в табл. 1.

Изучение фагоингибирования препаратов нуклеаз в концентрациях, соответствующих одинаковой каталитической активности

45 показало (табл. 2), что РНКазы В, А Ва и нуклеаза Sm в условиях, когда ферменты диффундируют из лунок в агаре, образуют зоны ингибирования 7,4. Антифаговое дейСтвие нуклеаз на примере системы М

50 12/Е,coll W 1665 F+ (метод лунок) показано в табл. 2.

7,1, 6,2 и 4,7 мм соответственно, тогда как ДНКаза 1, неспособная к разрушениям

РНК, не влйяет на РНК-геномные бактерио55 фаги, Пример 2 свидетельствует, что для фагоингибирования ферменты должны обладать PEК-деполимеразной активностью.

В табл. 3 представлены результаты определения МКИ для РНКазы Bl с использованием четырех фаговых систем. Показано, 1781295

Таблица 1

Таблица 2 что МКИ РНКазы Bl в отношение бактериофагов М 12, f 2 и PP 7 приблизительно составляет 0,6 мкг/мл агаризованной среды, что соответствует 800-1000 ед/мл. Фаг QB более устойчив к действию РНКазы, поскольку фермент в концентрации, соответствующей 780 ед/мл способен ингибировать его только на 37 .

Поэтому МКИ для этого фага выше и соответствует активности РНКазы около 7800 ед/мл.

Для сравнительной характеристики препаратов использовали такие их концентрации, при которых РНК-деполимеразная активность, рассчитанная на 1 мл агаризованной среды была одинаковой. Результаты представлены в табл, 4, Установлено, что разные препараты нуклеаз в концентрациях, соответствующих одинаковой РНКазной активности, оказывают приблизительно одинаковое противофаговое действие. МКИ препаратов РНКазы

Bi, РНКазы Ва, РНКазы А и нуклеазы Sm соответственно составляют: 3,0, 2,0, 12,0 и

12,0 мкг/мл.

Как следует из табл. 1-3, ни в одном из случаев препараты нуклеаз не оказывали вредного влияния на размножение, рост и развитие бактерий-хозяев.

Проведенные эксперименты с нуклеазами, выделенными из разных штаммов В.

InterrnedIus (4 штамма) и S. marcescens (3 штамма), а также РНКазой А, свидетельству5 ют, что источник получения фермента не оказывает влияния на его ингибирующую активность. Вероятно, любые РНКазы обладают ингибирующим действием в отношение РНК-содержащих фагов, причем

10 степень ингибирования зависит от ферментативной актибности препаратов, а также в определенной степени от сложности строения фага. Так, к примеру, наиболее устойчивым к действию нуклеаз оказался фаг ОВ

15 Е.соИ, для полного ингибирования роста i

20 Проведено также изучение действия перечисленных нуклеаз, включая панкреатическую ДНКазу, на 4НК-геномные фаги Е.coll, В.subtiils, Ps.aeruginosa, Ps.fiuorescens. Ингибирующего действия не проявил ни один

25 из исследуемых ферментных препаратов.

Формула изобретения . Применение нуклеаз. обладающих

РНК-диполимеразной активностью, в качестве ингибитора РНК-геномных бактерио.30 фагов.

Таблица 3

Определение минимальных концентраций ингибирования (МКИ) препарата РНКазы Bl для

РНК-содержащих бактериофагов. с

Данные опытов (обозначения) Бакте ио аги

М 12/ Е.coll f 2/ Е.соИ

PP 7/Ps, aeruginosa

QB/ Е.coll

6,0 (7800) 0

100

100

100

100

0,6 (780) 429

89

86

0

0,06 (78) 653

309

37

Контроль без фермента

Количество бляшек

311

683

113

Таблица 4

Определение минимальных концентраций ингибирования препаратов нуклеаз на примере фага M 12, Концентрация РНКазы в агэризованной среде, мкг/мл (ед/мл) Количество бляшек

Ингибирование фагов, %

Ингибирование бактерий

Количество бляшек

Ингибирование фагов, %

Ингибирование бактерий

Количество бляшек

Ингибирование фагов, %

Ингибироваwe бактерий

1781295

Продолжение табл. 4

Составитель Ф. Шарипова

Техред М.Моргентал Корректор С. Патрушева

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4256 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5