Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши

Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

coJvIA/1NcTvIvEcKvIx . 1 784g22 A )

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 цина. Сущность изобретения: на четвертые сутки после внутрибрюшинного введения 103 гликогена мышам внутрибрюшинно вводят среду Хенкса, содержащую ацетилированные липопротеиды низкой плотности или окисленный холестерин из расчета 2 и 1 мг холестерина на 18 г веса живого. Через

24 ч из перитонеальной полости мышей извлекают макрофаги, трансформированные в пенистые клетки. 3 табл.

1 (21) 4888847/13 ..(22) 10.12.90 (46) 30.12.92. Бюл. и 48 (71) Институт терапии СО АМН СССР (72) И.И.Душкин (56) Journal оЕ Biolnp ical С ешдв уь

1980, 255, 9344. ! (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИСТЫХ КЛЕТОК

ИЗ ИАКРОФАГОВ МЫШИ (57) Использование: биология, меди3

Изобретение относится к биологии холестерина и содержание холестерина и медицине, .в частности к методам ис- в полученных пенистых клетках. следования патогенеза и профилактики .. Недостатки указанного способа за- Ф . a epoc n®Ðoaa / . .. . .êëþ÷àþòñÿ в невысокой точности воспИэвестен способ получения пенистых роизведения условий культивирования

° ввввй клеток, схожих с леткам в атероскле- макрофагов, вариабелЬности использоротической аорте, из макрофагов, за- вания различных серий среды рщ— ключающийся в том, что полученные из : 1640, делипидизации сыворотки крови, ©© перитонеальной полости мышей рези- . .в различии материалов прйменяемой дентные макрофаги культивируют в культуральной посуды, в трудоемкости О пластиковых чашках Петри в среде : .метода культивйроцвания макрофагов в Я

RPMY-1640, содержащей 2 мМ глутати- стерильных условиях, в исйользова- M она, l03 делипидированную сывоРоткУ нии дорогостоящих питательных сред крови человека, 100 Ед/мл пеницилли- и ооорудования для клеточных кульна, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг тур. Кроме того, культивирование белка модифицированных ацетилляцией макрофагов in vitro йе позволяет липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) моделировать процессы образования хов 1 мл среды, в течение 24 .часов при лестерин-обогащенных пенистых клеток

37 С в атмосфере СО (53) и возду- в органиэмеев ха (953). В конце исследования моно- Предлагаемый способ получения слой клеток промывают средой 199 и пенистых клеток в перитонеальной исследуют влияние антиатерогенных . полости организма жйвых мышей позфармакологических препаратов на ско- .. воляет значительно упростить процерость включения 1 С-олеата в эфиры дуру метода, устранив выше перечис4 и в перитонеальную полость вводили в мл среды RPMI — 1640, содержащую 104, эмбриональную сыворотку телят, 2 мИ глютатиона, 100 Ед/мл гентамицина, брюшную стенку массировали в течение

1 мин и аспирировали шприцом 4 мл перитонеальной жидкости, в которой с помощью камеры Горячева подсчитывали количество клеток. 2 мл среды, содержащей 2 10 6 клеток, вносим в пластиковые чашки Петри диаметром

35 мм и инкубируем при 37 0 в течение 2-х часов в атмосфере СО (53) и воздуха (953). Клеточный монослой отмываем 4 раза средой RPMI — 1640 и полученные пенистые клетки характеризуем по скорости эстерификации холестерина и содержанию свободного и общего холестерина.

Определение содержания свободного и общего холестерина в пенистых клетках. Экстракцию липидов из клеток проводим, добавляя 4 мл гексана и изопропанола в объемном соотношении

3:2 в каждую чашку Петри, в течение

30 мин. Экстракт сливаем в стеклянные пробирки и органический растворитель упариваем в токе азота при 60 С. В сухом остатке определяем содержание общего и свободного холестерина в макрофагах энзиматическим методом с помощью набора реактивов нВ о-ЬаЬsistern" (финляндия) .

Оставший на чашках Петри после экстракции липидов клеточный белок растворяем в i мл 0,2 И NaOH u определяем концентрацию белка методом

Лоури. Содержание холестерина выражаем в мкг в расчете на 1 мг белка.

Определение скорости эстерификации холестерина в пенистых клетках.

К полученному клеточному монослою вносим 2 мл среды БАРМУ - 1640, содержащей 0,23 альбумин и 0,2 мИ (1 - <4 С) олеата радиоактивностью

1 мкКи/мл среды. Клетки инкубировали в течение 6 часов при температуре

37 С в атмосфере СО (5ь) и воздуха (953). После инкубации клетки промываем охлажденным до 4 С раствором

Хенкса и проводим экстракцию липидов гексаном и изопропанолом в объемом соотношении 3:2 описанным выше способом. Разделение эфиров холестерина осуществляем методом тонкослойной хроматографии на пластинах (15515 см)

"Силуфол" (ЧССР) в двух системах растворителей:гексан:диэтиловый эфир:

3 1784922 ленные недостатки. Преимущества йредлагаемого способа достигаются в результате способности макрофагов живых мышей накапливать большие количества холестерина и трансформироваться в пенистые клетки при внутрибрюшинном введении эмульсии окисленного холестерина или ацетилированных липопротеидов низкой плотности (ацетил-ЛПНП).

Полученй пейистых клеток с высоким содержанием холестерина и скоростью его эстерификации осуществляют с помощью следующего метода:

Окисление холестерина проводим на воздухе при температуре 60ОС в течение 6 недель. 20 мг окисленного холестерина растворяем в 60 мкл ацетона при температуре 60 С и быстро вносим 20 в 10 мл раствора Хенкса, содержащего

504 бычий сывороточный альбумин (БСА), Раствор перемешиваем на магнитной мешалке под током азота, поступающего из баллона с азотом, в течение 25 часа для удаления ацетона. Полученная эмульсия стабильная в течение

24 часов. Липопротеиды низкой плотйости (1 019-1,055 гlмл) выделяем из плазмы доноров методом ультрацентри- 39 фугирования ЛПНП (5 мг белка. в 1 мл раствора Хенкса) разбавляем (1: 1, V:V) насыщенным раствором ацетата натрия при температуре 0 С. К разбавленному таким образом раствору ЛПНП 35 (10 мг в 4 мл) периодически, один раз в 15 мин в течение часа, вносим по 2 мкл уксусного ангидрида с помощью микрошприца. Ацетилированные

ЛПНП диализуем против 20 л 0,05 И фосфатного буфера, рН 7,4, 0,85 ь хлористого натрия в течение 24 часов при 4 С. Полученные ацетилированные ЛПНП храним в течение трех суток при 4 С.. 45

Для стимуляции выхода макрофагов в перитонеальную полость 5-8 недельным мышам линии С5781 внутрибрюшинно вводили 1 мл раствора Хенкса, содержащего 104 гликоген. На четвертые сутки после введения гликогена мышам внутрибрюшинно вводим раствор ацетилированных ЛПНП или эмульсию окисленного холестерина из расчета

2 или 1 мг холестерина на 18 г веса мыши, соответственно. Через 24 часа после последнего введения из перито неальной полости мышей получаем пенистые клетки. Для этого мышей забивали г г

5 178492 :Уксусная кислота в обьемных соотношениях 60:40:1 и 90:10:1. Пластину проявляем в парах йода и радиоактивность эфиров холестерина подсчитываем в толуольном сцинтилляторе (4 г ., PP0,О, 3 r РОРОР на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Марк-III" (США) по программе 2.

Скорость эстерификации холестерина выражаем в кмоль включения

< С-олеата в эфиры холестерина на

1 мг клеточного белка за 64 инкубации по следующей Формуле:

Рад. кл х (С) Суб. вн моль

Рад.Суб клеточный белок в мг, где Рад.кл - радисактивность эфирогв холестерина клеток в, имп./мин;

Рад.Суб - радиоактивность добавляемого субстрата «Солеата в имп/мин; (C) Суб. - концентрация субстрата (олеата) в среде инкубации в нмоль.

Определив таким образом концентрацию холестерина и его эфиров и скорость эстерификации холестерина в полученных клетках, можно определить степень" трансформации макрофагов перитонеальной полости мышей в пенистые клетки и динамику накопления эфиров холе- 35 стерина в клетках.

Пример 1. Исследование срав" нительного влияния нативных ЛПНП (1-2 мг холестерина/18 r массы животного), ацетилированных ЛПНП (0,4-2 мг 40 холестерина/18 г массы животного),. очищенного перекристаллизацией холе-. стерина (1-2 мг холестерина/18 г массы животного) на содержание холестери- на и скорость его эстерификации в пе- ° 4Е ритонеальных макрофагах мыши. Через

24 часа, после внутрибрюшинного введения препаратов ЛПНП и холестерина по-, лучаем перитонеальные макрофаги и исследуем скорость эстерификации холестерийа. Результаты исследования, представленные в табл.1, показывают, что наиболее высокое (десятикратное) . повышение скорости эстерификации хо- . лестерина наблюдается при введении ми-. 55 шам ацетил-ЛПНП и окисленного холе стерина в концентрации 2 и 1 мг холе- .. стерина/18 г массы мыши, соответст венно. Как видно из табл.2, введение

2 6 окисленного холестерина и ацетил-ЛПНП повышает концентрацию эфиров холестерина в клетках в 60 раз и уровень свобсдного холестерина в 2 раза по сравнению с контролем. Десятикратное повышение скорости эстерификации холе- . стерина и 60-кратное повышение содержания эфиров холестерина в перитонеальных макрофагах свидетельствует об их трансформации в типичные пени-стые клетки, характерные для ранних стадий развития атеросклероза. г

Предлагаемый способ позволяет получить пенистые клетки, которые могут быть использованы для изучения механизмов антиатерогенного действия .

Фармакологических препаратов.

Пример 2. Исследование действия антагониста кальция верапамила. на скорость эстерификации холестерина в пенистых клетках. Пенистые клетки, получаем,как описано выше после внутрибрюшинного введения окисленного холестерина (1 мг/18 г массы мыши) и по" следующего культивирования их в чашках Петри. К среде для определения скорости эстерификации холестерина, которое подробно изложено выше, микрошприцом вносим верапамил B 5 мкл этило-вого спирта"йа t мл среды культивирования в конечных концентрациях 25, 50, 75 и 100 мкй. Табл.3 демонстрирует, что верапамил дозозависимо ингибирует скорость эстерификации холестерина в пенистых клетках, что, вероятно, свя-зано с его антиатерогенным действием.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить пенистые клетки в условиях их естественной трансформации из перитонеальных макрофагов живых мышей, которые могут быть использова= ны для изучения"мехайизмов атерогенеза и действия антиатерогенных препаратов.

Формула изобретения

Способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши, включающий воз- действие на макрофаги мышей окисленным холестерийом йли минопротеида- ми низкой плотности, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода жйзнеспособных клеток, воздействие осуществляют in vivo внутрибрюшинным введением вещества в дозе 1"2 мг/18 г массы мыши, затем выдерживают в течение суток и целевой продукт извлекают аспирацией.

1784ÿ22

Скорость включения " С-олеата в эфиры холестерина макрофагов, полученных после внутрибрюшинного введения нативных и ацетилированных липопротеидов, холестерина и его !" окисленных продуктов .(Ktm) »Ю ЮЮЮВ Ю»

Концентрац ия ХС в вводимом пре" парате в мг на 18 г веса мыши

Включение

«С-олеата в

ЭХС в нмоль в течение 6 часов культи-. вирования 1 макрофагов

Группа животных

° ° М Фю

0 3,56+0,063

1 7,41+0,48

2 11,25z0,52,:

0,4 6,47+0,38 - ..

1 18;9+1,31

1,5 30,08+1,76, 2 36, 11+2,31

0,5 11,23+0,36

1,0 19,6+1,02

2,0 26,4Д,26

0,5 «14,4 0,52

1,0 34,8+1,35

Достоверность всех величин по от. ношению к контролю - Р а 0,001, Табли ца 2

Содержанйе холестерина в макрофагах при внутрибрюшинном введении натйаных и .

"ацетилированных ЛПЙП, холестерйна и его,-- окисленных продуктов (И+я) Ю ЮФ

Гpyrina животных.

n = 6 ав ф» й

Концентрация

XC в вводимом препарате в мг на 18 г веса мыши

Ф Ф МЮФюююМ\В ФФю

ЭХС

CXC

Контроль

Нативные ЛПНП

Нативные ЛПНП

Ацетил ЛПНП

Ацетил ЛПНП

Ацетйл ЛПНП

Ацетил ЛПНП ее» е С»

0,59И,07

1Ц,4+0,69 "+

16, 2+.О, 94*""

19,8 1,57""»

25 5+1,94 »"

30,86+2,59" + +

38, 12+2,63» "+

18,24+0,45

20, 1 0,71. 23,5+, 15"

18,2+0,96

19,311,29

25,5+1,22ЯЯ

28,87+1,33"""

0 1,0

2,0

0,4

1,0

1,5

2,0

Контроль

Нативные

JlilHll

Нативные

ЛПНП

Ацетйл ЛПНП

Ацетил ЛПНП

Ацетил ЛПНП

Ацетил ЛПНП

Перекристаллизованный ХС

Перекристалли3088HHblH XC

Перекристаллизованный ХС

Окисленный ХС

Окисленный ХС

Содержание ХС в мкг на 1 мг клеточного белка..

1784922

Продолжение табл. 2

I pynna животных и 6

Содержание ХС в мкг на 1 мг клеточного белка

СХС

ЭХС

20,39+0,74

11, 42+0,6 Я "

l 9, 13+1, 74"

0,5

19,6+0,86

1,0

26,27+1,84"

27,1 «+1, 65"

33,27+1,49»

25,43И, 17„"+

16,73 1,46"""

38,05 3,42" "

2,0

0,5

1,0

Достоверность отличий по отношению к контролю:; одна звездочка Р (0,01 две -"- P < 0,002 три -"- P (0,001

Таблица 3

Влияние верапамила на скорость включения 1 С-олеата в эфиры холестерина пенистых клеток (М+ш) Составитель М.Душкин

Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь и

Тираж Подписное комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

РедакторЛ. Павлова

За каз 4362

BHHHIIH Государственного

113035, Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Перекристаллизованный ХС

Перекристаллизованный ХС

Перекристаллизованный ХС

Окисленный ХС

Окисленный ХС

Концентрация

ХС в вводимом препарате в мг на 18 r веса мыши

Концентрация верапамила в среде инкубации клеток в мкМ

100

Включение С-олеата в эфиры холестерина в нмоль/мг клеточного белка за 6 часов инкубации

34,8+1,36

26,7+1,12

19,2+0,91

11,1+0,82

6,3+0,54