Способ определения вирусов и антител к ним

Способ определения вирусов и антител к ним

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано при диагностических исследованиях для определения вирусов или антител к ним. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа, повышение его чувствительности. Цель достигается тем, что получают смесь из равных объемов вируса и сыворотки, которую вносят в систему репродукции вируса и инкубируют 15-20 мин при 37°С. В смесь добавляют флуоресцентный зонд со временем экспозиции 12-15 мин. Учет результатов реакции ведут по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле и при значении ее показателя, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента, а при значении этого показателя менее 1,5 в случае образования специфического комплекса вирус-антитело определяют наличие антител к нему. 4 табл. ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИОТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК Ы, 1787272 А3 (51)5 G 01 N 33/533

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

2, Цель изобретения — ускорение и упрощение способа, повышение его чувствительности.

Цель достигается тем, что получают смесь из равных объемов вируса и сыворотки, которую вносят в систему репродукции вируса и инкубируют 15 — 20 мин при 37 С. В смесь добавляют флуоресцентный зонд со време(21) 4843386/14 (22) 25,06.90 (46) 07.01.93. Бюл, М 1 . (71) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт

" (72) B.À.Ìèùåíêî и E.Â.Hoåîæèëoâ (73) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (56) Сюрин В.Н; и др. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных.

М,: Агропромиздат, 1986, с. 207-208. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ И

АНТИТЕЛ К НИМ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано при диагностических исследованиях . для определения вирусов или антител к ним, нем экспозиции 12-15 мин. Учет результатов реакции ведут по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле и при значении ее показателя, равном 1;5 и выше, определяют наличие инфекционного агента, а при значении этого показателя менее 1,5 в случае образования специфического комплекса "вирус-антитело" определяют наличие антител к нему . 4 табл. нее добавляют флуоресцентный зонд и че- .. " он адсорбируется на клеточной мембране, . рез 12-15 мин осуществляют учет реэульта- что, соответственно, приведет к изменению

Изобретение относится к области виру- тов реакции по отношению интенсивности сологии и может быть использовано при ди- флуоресценции смеси в опыте и контроле и агностических исследованиях для при значении ее показателя, равном 1,5 и определения вирусов и антител к ним. выше, определяют наличие инфекционного

Целью изобретения является ускорение агента, а при значении этого показателя ме- ) и упрощение способа, повышение его чувст- нее 1,5, в случае образования специфичевительности и универсальности, ского комплекса вирус-антитело

Поставленная цель достигается тем, что определяют наличие антител к нему. в известном способе определения вирусов Обнаружение вирусов и вирусоспеци- р, и антител к ним в реакции нейтрализации, фических антител проводится по феномену включающем смешивание вируса с сыво- торможения адсорбции вируса антителами роткой, внесение этой смеси в систему ре-. на клеточной мембране. При образовании продукции вируса, ее инкубацию и учет комплексавирус-антителовирустеряетсйорезультатов реакции, в соответствии с изо- . - собность связываться со специфическими бретением инкубацию смеси вируса с сиво- рецепторами клетки. В этом случае, состояроткой в системе репродукции вируса ведут ние мембраны клеток не изменяется, А в в течение 15-20 мин при 36-380С, затем в случае, если остается свободный вирус, то

1787272 состояния клеточной мембраны, которое можно определить с помощью флуоресцентного зонда.

Сущность изобретения поясняется примерами его исполнения, которые не ограничивают его обьем, Пример 1, Определение типа вируса ящура.

К 0,3 мл разведения испытуемой пробы (вирус ящура) добавляют 0,3 мл соответствующего разведения ящурной диагностической сыворотки. Затем, в 0,5 мл суспензии клеток ВНК-21 вносят 0,1 Мл йолученной смеси вирус-сыворотка и инкубируют 20 мин при 37 С, Затем, в нее добавляют флуоресцентный зонд ДСМ до конечной концентрации 1,0 мкМ и выдерживают 15 мин и после этого проводят учет результатов реакции. Подготовленные образцы флуориметрируют с помощью микроскопа Л ЮМАМ

И-2 при длине волны возбуждающего света

405 нм и длине волны флуоресценции 515 нм. Среднюю интенсивность флуоресценции {F) клеток рассчитывают по формуле — 1 Ф.

F= — — p F, П, где Fi — интенсивность флуоресценции i-ой клетки; и — число клеток (не менее 20 — 30 в каждом опыте).

Для удобства ввели константу флуоресценции (К) — постоянную величину, равную

Fîïыта отношению опыта За положительную контроля константу взяли величину, равную ипи больше 1,5. В случае, если возбудитель не нейтрализован гомологичными антителами, то он адсорбируется на клеточных рецепторах, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции зонда по сравнению со свечением его на интактных клетках в 1,5 и более раз. При значении показателя интенсивности флуоресценции, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента. Наличие вируса ящура определяют в течение 40 мин. Вирус ящура относят к тому типу, какими антителами он нейтрализован.

Пример 2. Определение антител к вирусу ящура.

К 0,3 мл соответствующих разведений вируса ящура типов А,О и С добавляют по

0 3 мл соответствующих разведений используемой сыворотки крупного рогатого скота, переболевшего ящуром. Затем, в 0,5 мл суспензии клеток ВНК вЂ” 21 вносят 0,1 мл полученной смеси вирус-сыворотка и иикубируют при 37 С вЂ” 15 мин. После этого, в смесь добавляют зонд ДСМ до конечной концентрации 5 мкММ и выдерживают с зондом 15 мин. Подготовленные образцы флуориметрируют с помощью микроскопа

ЛЮМАМ И вЂ” 2 при длине волны возбуждающего света 405 нм и длине волны флуоресценции 515 нм. Среднюю интенсивность флуоресценции {F) клеток рассчитывают по формуле:

10 где F — интенсивность флуоресценции l-ой кл етки, и — число клеток (не менее 20-30 в каждом опыте)

Для удобства учета предложена константа флуоресценции (К) — постоянная ве20 личина, равная отношению копыта гконтроля

За положительную константу берут величину, равную или больше 1,5. Эта величина характерна для проб, содержащих культуру клеток, вирус ящура, гетерологичные антитела к нему и зонд. В случае нейтрализации вируса ящура гомологичными антителами, этот показатель меньше 1,5.

Определение антител к вирусу ящура осуществляют в течение 60 мин.

Эффективность способа подтверждена результатами экспериментов, сведения о которых представлены в таблицах 1 — 3.

В таблице 1 приведены результаты определения активности сыворотки крови, отобранной от крупного рогатого скота, привитого вакциной из лапинизированного вируса ящура А22 с помощью флуоресцентного зонда на культуре клеток В Н К-21.

40 Результаты табл. 1 свидетельствуют о том, что существует прямая зависимость между дозой вируса и титром антител, С уменьшением количества вируса, использу- . емого для постановки реакции нейтрализации с помощью флуоресцентных зондов, увеличивается количество антител, т.е. титр антител, Таким образом, показано, что показатель интенсивности флуоресценции, рав50 ный 1,5 и выше, свидетельствует о наличии вируса, а значение этого показателя меньше

1,5 в.пробах, содержащих вирус + антитепо, свидетельствует о нейтрализации вируса гомопогичными антителами..

В табл. 2 приведены данные определения антител к вирусу ящура Ал в реакции нейтрализации с флуоресцентным зондом на культуре клеток СП в гипериммунной сыворотке морских свинок, используемой для постановки РСК, 1787272

Таблица 1

Зависимость показателей активности сыворотки от дозы вируса ящера Azz

Табл ица2

Результаты "шахматного "титрования сывороток морских свинок к вирусу ящура А22 предлагаемым способом на культуре клеток СП

Данные табл. 2 подтверждают показатели, представленные в табл, 1 и подтверждают, что результаты предлагаемого способа не зависят от происхождения сыворотки и культуры клеток.

В табл. 3 приведены результаты опытов, свидетельствующих об универсальности предлагаемого способа. Предлагаемый способ испытан с положительными результатами на примере возбудителей 10 разных вирусных болезней. Эти вирусы относятся к

7 разным семействам, Предлагаемый способ пригоден для выявления вирусов и антител к ним независимо оттого, являются ли они PHK или ДНК-содержащими.

Использование предлагаемого способа определения вирусов и антител к ним обеспечивает пп сравнению с реакцией нейтрализации следующие преимущества:

1) Универсальность

2) Значительное сокращение времени на исследования

3) Доступность, дешевизна

4) Повышение чувствительности

5) Значительное упрощение llocTGHQBKH опытом с имеющимися методиками

6) Повышение достоверности Исследования, особенно при исследовании вирусов, 5 имеющих замедленный цикл репродукции

7) Воэможность обнаружения вирусов, размножающихся без видимого ЦПД.

Формула изобретения

Способ определения вирусов и антител

10 к ним, включающий смешивание вируса с сывороткой, внесение этой смеси в систему репродукции вируса, инкубацию ее и учет результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, уско15 рения и упрощения способа, инкубацию системы репродукции вируса проводят в течение15 — 20 мин при36 — 38 С,далее, в нее добавляют флуоресцентный зонд. экспонируют в течение 12-15 мин, определяют ин20 тенсивность флуоресценции, рассчитывают индекс флуоресценции и при значении его

1,5 и выше определяют наличие вируса, а при значении его менее 1 5 определяют наличие антител к вирусу.. 1787272

Таблица 3. I

Характеристика вирусов и антител к ним, используемых для испытания предлагаемого способа

Семейство ви сов

Возб итель ин ек ии

Составитель C.Кулакова

Техред М.Моргентал Корректор А.Обручар

Редактор

Заказ 273 . Тираж,: Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

2

4

6

8

10

Ящура

Болезни АУески

Коронавирусной инфекции

Парагриппа-3 KPC

Вирусный диареи КРС

Болезни Тешена

Везикулярной болезнй свиней

Лейкоза

Классической чумы свиней

Везик ля ной экзантемы свиней

Пикорнавирусы герпесвирусы коронавирусы парамиксовирусы тогави русы пикорнавирусы пикорнавирусы ретровирус тога вирусы калициви сы