Штамм гриба сunnigнамеllа vеrтiсillата - трансформатор для гидроксилирования 1-бензоилпирролидина 1-бензоиламино-3,7- диметилоктадиена-2,6

Штамм гриба сunnigнамеllа vеrтiсillата - трансформатор для гидроксилирования 1-бензоилпирролидина 1-бензоиламино-3,7- диметилоктадиена-2,6

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ6ЛИК

1789557 А1 (st)s С 12 N 1/14, С 12 P 17/12

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С0 Ь 1V

1

Я СОРЬ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4882787/13 (22) 15.11,90 (46)23.01,93, Бюл. М 3 (71) МГУ им, М.В.Ломоносова (72) И.А.Паршиков, Л,И.Воробьева, Л,В.Модянова, Е.B.Äîâãèëåâè÷. П,G.Терентьев (SU ) и Xonbrep Хофман (QE) (56) Archelap А., Furstess R,; Scari О., Maury

G. Hydioxylation microbiologique des

lactanl ås, des amides et: d, imides

monocycligues раг le champignon Beauveria

suifurescens. Bull. Soc, Chim. Fr„1986, N. 2.р.

234-238.

Изобретение относится к биотехноло.гии и касается получения нового штамма

Cunninghamella verticillata ВКПМ F430, который может найти применение в микробилогическом синтезе полупродуктов лекарственных препаратов, таких как (-)-1-бензоил-3-гидроксипирролидин — ценный синтон в синтезе целой серии лекарственных прейаратов и

1-бен зоил ам ин о-5-гид рокси-3, 7-диметилоктадиен-2, 6 (гидроксицитрэльбензамид) — феромон насекомых.

Ближайшим аналогом изобретения является культуры микроскопических грибов — Cunninghamelta verticillata

АТСС 8983. Данная культура способна трансформировать бициклическое азотсодержащее гетероциклическое соединение (1), вводя гидроксильйую группу в метильнйй заместитель конденсированного пиридинового кольца (И), выход продукта трансформации определен не был (0: (54) ШТАММ ГРИБА СОИМ16НАМЕ1Л А

V E RTl C l LLATA ТРАНСФОРМАТОР ДЛ Я

ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ 1-БЕНЗОИЛПИРРОЛ ИДИ НА И 1-Б Е Н ЗОИЛ АМ ИН 0-3, 7ДИМЕТИЛОКТАДИЕ НА-2,6 (57) Использование: микробиология, биотехнология. Сущность изобретения: штамм

Cunninghamelta verticliiata ВКПМ F-430 гриба способен при 26 — 28" С стереоселективно гидроксилировать 1-бензоилпирролидин с образованием (+1-бензоил-3-гидроксипирролидина и 1-бензоиламино-3, 7-диметилоктадиен-2, 6 с выходом соответственно 38 и

20 %. 7 табл, () 0

С00Н . C()()q

Ю нон,с

С2 5 (:gH5 If а

Известна трансформация насыщенных гетероциклических соединений культурами ©© микроорганизмов, например, гриб

Beauverla basslana АТСС 7159 превращает (Я

1-бензоилпиперидин (Ш) в 4-гидроксипро- Ql изводное (IV} с выходом 18 %:

Кроме того, данная культура способна окислять аналоги цитральбензамида-ациклические амиды. Например, при. росте на

1789557

В литературе неизвестно примеров трансформации цитральбензамида ни культурой Веаичег!а basslana АТСС 7159, ни какими-либо другими культурами, К недостаткам культуры Beauveria

Ьазз!апа АТСС 7159 относятся;

1, Гидроксилирование 1-бензоилпирролидина приводит не к образованию циклического оптически активного продукта, а к гидроксилированию второго углеродного атома пирролидина и раскрытию гетероциклического кольца; при этом образование продукта происходит с маленьким выходом, всего 8 %.

2, Культура не гидроксилирует цитральбензамид и при гидроксилировании его аналогов: 1-(3-метилбутил)бензамида и

1-(1-пентил-3)-бензамида выходы продуктов реакции также малы и составляют 13 и 10 соответственно.

Целью изобретения является выделеwe нового более продуктивного штамма грибов, эффективно осуществляющего трансформацию 1-бензоилпирролидина и цитральбензамида. Продукты гидроксилирования этих соединений могут быть использованы: (+1-бензоил-3-гидроксипирролидин как синтон в синтезе серии лекарственных препаратов, а гидроксипроизводные цитральбензамида — как феромоны насекомых

Цель достигается выделением нового штамма гриба Cunninghameffa verticiffata

ВКПМ F-430 из почвы, загрязненной отходами завода "Стеклопластик", г.Ступино

Московской области.

Штамм Cunnfrighamelfa verticiffata

ВКПМ F-430 является природным сапрофитом и был выделен авторами из почвы, за-грязненной отходами завода

"Стеклопластик", г. Ступино Московской области.

Культура высевалась нв 4 Б сусло-агар рН 5,0. После нескольких последовательных пересевов на указанной среде была выделена чистая культура гриба, определенная как

Cunnfngharneffa vertlcillata Paine (7), Данный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов

ВНИИГенетики АН СССР под номером F430, непатогенен.

+ - 35

OOH

СНО

К С CHg

CHg f Hj

Х 620/О

coQH Н (.GOH Н3 Н3 3(Нз .

ХЦ 0,5% а 3% 50

О

HOH НЗ (НЗ

Xl 0,8% среде с глюкозой и кукурузным экстрактом культура гидроксилирует 1-(3-метилбутил)бензамид (V) в положение 3 алкильного заместителя с выходом продукта (Vl) 13 %:

СН

СН;С -СН; н,->>=f,„

V CH.....

6 5 .I

<(4 <- н -сн;мк-e-(: g

О VI Ц

Гидроксилирование в тех же условиях

1-(1-пентил-3)-бензамида (Vll) культурой

Beauveria basslana АТСС 7159 проводит к образованию оптически активного спирта (ИИ) с выходом 10 %:

ВНСОС5Н5

l сн -сн;сн-сн - сн

Yf1 ИКСОС5К5

l — з (-)-СН -f-H-СН-f-H2-СН

3 . 3

Ии ФО%

Культура бактерии Pseudomonas

aerugfnosa способна окислять аналог цитральбензамида-цитраль(!Х)с образованием 30 трех продуктов: (Xi) выход 62 %, (Xf) выход

0,8%,(ХЩ выход0,5% и(Xll1) выход1%(1): си

Наиболее близкой к изобретению является культура гриба Beanveria bassiana

АТСС 7159, которая способна при росте на

° среде с осевым и дрожжевым экстрактами 55 гидроксилировать 2-й углеродный атом 1бензоилпирролидина (ХИ) с раскрытием гетероциклического кольца и образованием N-(4-гидроксибутил)бензамид (XV), выход 8 %"

СОРЬ СОРИ

)(р XV 8%

1789557

Морфологические и культурные признаки.

Для изучения морфологии культуры испольэовали агаризованную среду Чапека.

Колонии растут быстро — на 4-й день наблюдается сплошной рост на чашке Петри; колонии войлочные, однородные, окраска наружной и обратной стороны белая, форма круглая, край ровный, эксудата не образует.

Воздушный мицелий несептированный, белый. Хламидоспоры немногочисленные, продолговатые 10-20 х 6-10 мкм, с тонкой оболочкой, одиночные, Зигоспоры шаровидные или с боков слегка сжатые, 4070 мкм в диаметре, Копулярные отроги противолежачие.

Конидиеносцы до 1,5 см высотой, 10-20 мкм в диаметре, булавовидные, с 1 — 3 ярусами неправильных мутовок веточек ниже верхушечного вздутия до 30 мкм длины.

Плодящие вздутия обратногрушевидные, верхушечное вздутие 30 — 70 мкм в диаметре, боковые 20-30 мкм, Конидии размерами 1013 мкм на главных головках и 9 — l2 мкм на боковых, белые, Образуются по всей поверхности плодущих вздутий; Форма эллиптическая, покрыты шипиками 1,5-3,0 мкм, но встречаются гладкие и шаровидные.

Физиолого-биохимические признаки, Рост в анаэробных условиях отсутству ет. Гриб способен расти при температуре

8-34 С. Оптимум рН 5,0-6,0. Рост при 55

С отсутствует, имеются споры, выдерживающие прогревание при 80О С в течение 10 мин. Культура способна использовать в качестве единственного источника углерода (минеральный фон среды Чапека): глюкозу, ксилозу, раффинозу, Д-маннит, Л-арабинозу, сахарозу. Не используют: иноэит, Л-рамнозу, Д-фруктоэу.

Для поддержания культуры используют среду следующего состава; г/л: глюкоза

20,0: пептон 10,0; агар 20,0; вода водопроводная; рН 5 0; t = 28 С. Для длительного хранения культуру Сопп! лцЬаве1!а

verticillata ВКПМ F-430 выращивают в течение 10 сут на среде следующего состава г/л; глюкоза 20,0; пептон 10,0; агар 50,0: вода водопроводная рН 5,О, приготавливают агаровые диски 4 мм в диаметре и подвергают криоконсервации в жидком азоте, используя в качестве криопротектора 20 -ный раствор глицерина в дистиллированной воде.

В табл, I приведены существенные отличия изобретения от прототипа.

Поставленная цель достигается выращиванием культуры Cunninghamella

verticillata ВКПМ F-430 на модифицированной среде Чапека, указанной ниже, в течение 4 сут при температуре 20-34 С, рН среды 5,0-7,0, Предпочтительной температурой процесса является 26 — 28 С и рН 5,0.

Пример 1, Культуру Cunninghamella

verticillata ВКПМ F-430 выращивают на качалке при 26 — 28 С в конических колбах на

750 мл по 100 мл среды следующего состава, г/л: сахароза 20,0; МайОз 2,0; КН2РО4 1,0;

MgSO4. 7НгО 0,5; KCI 0,5; FeSO< 0,01; пептон 5.0; вода дистиллированная, рН 5,0.

Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Данную среду используют для выращивания посевного материала и ферментационную для проведения трансформации. Посевной материал выращивают 2 сут и вносят 5 мл на

15 летового.детектора (А = 220 нм); скорость подачи элюэнта 100 мл/мин; обьем пробы 2 мл; чувствительность 0,4; время измерения

0,6 с, скорость движения ленты самописца

720 мм/ч. Углы вращения измеряли на приборе ЕПО-1, ВНИИПродмаш. Иэ 100 мг 1бензоилпирролидина получают 41,7 мг (38,0

%) 1-бенэоил-3-гидроксипирролидина

55 (табл. 2). (-)-1-бензоил-3-гидроксипирролидин: время удержания (ВЭЖХ) 235 с, масс100 мл ферментационной среды. Через сутки культивирования вносят субстрат для трансформации — 1-бенэоилпирролидин в

20 количестве100м/ги культивируют на качалке еще 1-3 сут. Биомассу отделяют фильтрованием через бумажный фильтр на воронке

Бюхнера. Фильтрат упаривают в вакууме при 50О С. Упаренную культуралъную жид25 кость доводят до рН 7,0, добавляя 40 7,-ный раствор NaOH и экстрагируют в жидкостном экстракторе хлороформом в течение 30 ч (экстрагировать можно неупаренную культуральную жидкость). Хлороформенный экс30 тракт упаривают в вакууме досуха и остаток растворяют в небольшом количеств этанола.

Выделение продуктов трансформации осуществляли с помощью флешхроматогра35 фии на колонке с силикагелем (Silicaqel

40/100, Chemapot, ЧССР), используя систему растворителей гексанэтилацетат-мета-. нол 10; 10: 2, Полученные соединения идентифицировали на основании их физи40 ко-химических и спектральных свойств: хроматографической подвижности, ВЭЖХ и масс-спектров. Масс-спектральный анализ проводили на приборе Varian MAT-112S при энергии ионизации 80 эВ с прямым вводом

45 вещества в иойный источник. Оценку чистоты веществ и количественное определение осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе

"Милихром" с использованием ультрафио1789557

Выделен новый гриб Cunninghamefla

vertleilfata 8KflW F-430. Штамм способен стереоселективно гидроксилировать 1бензоилпирролидйн, что ранее не было отмечено у других грибов; кроме того, он способен трансформировать соединения терпенового ряда, в частности цитрэльбензамид. что расширяет область его применения;

Ф ар мула из о бр ете н и я лированйя 1-бензоилпирролидина и 1Штамм гриба Cunnighameila verticillata бензоиламино-3, 7-диметилоктадиена-2, В КПМ F-430 — трансформатор для гидрокси- 6. спектр: M 191 (30), 190 (8), 174 (3), 173 (2,5), 162 (2,5), 146 (9), 114 (5), 105 (100), 99 (20), 86 (7,5), 85 (10), 77 (50), 70 (70), 57 (15), 56 (25), 55(15); спектр ПМР: 1.76-2.16 (ЗН, м, З-Н и

4-Н), 3.40 — 3.83 (4Н, м, 2-Н и 5-Н), i а! о = 5

-46.56 (С 1,89, зтанол). Хроматографическая подвижность на силикагеле "Merk"

К1езе19е! 60 Fzgp Art. 5554 — Rg — 0,26.

Выход продукта трансформации 1-бензоилпирролидина в зависимости от speMe-,10 ни инкубации при рН 5,0и t= 26-28 С.

Из табл. 2 видно, что реакция полностью проходит за 3 сут и увеличение времени трансформации до 4 сут не приводит к увеличению выхода продуктов трансформа- 15 ции, П р и и е р 2. Реакцию с i-бензоилпирролидином проводят аналогично примеру 1 при t = 26-28 С в течение 3 сут, но при разных значениях рН, как показано в 20 табл. 3

Из табл. 3 видно. что увеличение или уменьшение рН приводит к увеличению выхода продуктов, и наилучший выход мьt имеем при рН 5,0, . 25

П р» м е р 3, Реакцию с 1-бензаилпирролидином проводят аналогично примеру 1 при рН 0,5 в течение 3 сут, но при разных температурах, как показано в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что процесс микроби- 30 ологического окисления протекает при тем- . пературе 20-34 С, но оптимальным является интервал 26-28О С, наиболее благоприятный для роста гриба и работы ферментных систем, 35

Пример 4. Реакцию с цитральбен-. замидом проводят аналогично примеру 1 при рН 5.0 и t = 26 — 28 С, но при разном времени трансформации, как показано в табл. 5. 40

Из табл. 5 видно, что из 100 мг цитральбензамида за 3 сут трансформации получают 21,2 мг (19,8 %) гидроксицитральбензамида и увеличение времени трансформации до 4 сут не приводит к увеличению выхода продукта. Хроматографическая подвижность гидроксицитральбензамида на силикагеле

"Merk", Kleselgef 60 Fgw, Art. 5554 - R f -0,40

Масс-спектр: M+ 273 (25), 232 (40), 214 (15), 187 (100), 152 (55), 134 (9), 77 (50).

Пример 5. Реакцию с цитральбензамидом проводят аналогично примеру 1 при

t = 26-28 С в течение 3 сут, но при разных значениях рН, как показано в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что увеличение или уменьшение рН не приводит к увеличению выхода продукта, и наибольший выход мы имеем при рН 5,0.

Пример 6, Реакцию с цитральбензамидом проводят аналогично примеру 1 при рН 5,0, в течение 3 сут, но при разных значениях температуры, как показано в табл. 7.

Из табл, 7 видно, что процесс микробиологического окисления протекает от 20 до

34 С, но оптимальным является интервал

26-28 С, наиболее благоприятный для роста гриба и работы ферментных систем.

1789557

S

«(х

Ф О

CL а

Y с о

Щ у

Е

Ф

Ф

Ф

Е

m .с

СЧ

СО

С Ъ с о

СЧ

Z о

С)

tl) х Э с с О

С ) о

Ф"- С)

s Á т СьФ IX1

О.

Е 01 о ц (б

Q

Ж

Л."

Ю

О

О а

«С

S т

2, о

Ю о

Х

Х X о

«

S с о

CL

CL

S с с

5 о

Ф

«

О

Х с

S о

lo

CL с о

z

Ф

CL

ICI о

lО

Ф

z

Ф

Ф

l о о (, 72

Ж

1 »

v (3

L»

m с

Ф Й

Ф х

Ф (б

Е

Ф

> о

Е6

Ф с

Б

lО о

S

=г

Е

О. о е о х

Ь

Е и

z о о

S

Ж о

CV

«

Е

m /Ъ

X O

Ф л

u mm

О CL

=Т

S о

М о

О.

«

l»

«

Я

m /Ъ

z у Ф

Ф о о ц:)

С» о

z o

Я 0

М

Д

«Г

»юъ

CO о а Я ю сФЪ S

« О (3 2 о о

«С ч

Х Ф5 о о

М о (., О. х

2 щ

CV

Щ

Х о

«

S Ж

О а о

S с о о о о х

5 Ф

1 щ Ф «( с S

Б

О

Я Ф

z z

Ф ю л

Ф

X о

СЧ

z о

«(S с о ИЪ

О. ХЮ EO с О с о о

1789557

Таблица 2

Выход продукта трансформации 1-бензоилпирролидина в зависимости от времени инкубации при рН 5,0 и t= 26-28 С

Таблица выход продукта трансформации 1-бензоилпирролидина в зависимости от рН среды

Таблица 4

Выход продукта трансформации 1-бензоилпирролидина в зависимости от температуры проведения процесса

5 Таблица 6

Выход продукта трансформации цитральбензамида в зависимости от рН среды

М (Выход продукта трансформации цитральбензамида в зависимости от длительности процесса

1789557

Таблица 7

Выход продукта трансформации цитральбензамида в зависимости от температуры

Составитель Ю,Попов

Техред М.Моргентал

Корректор Н.Слободяник

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 329 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35. Раушская наб.. 4/5