Способ иммунологического определения одновалентных аналитов

Способ иммунологического определения одновалентных аналитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: для обнаружения одновалентных аналитов иммунологическим методом . Цель: повышение специфичности определения. Сущность изобретения: для обнаружения аналитов с помощью иммунологического способа используют смесь не менее двух способных специфически связываться с аналитом моноклинальных антител, перекрестная реакционноспособность которых различна при соотношении антител 0,1-10:1 и трехкратном количестве МКА по отношению к аналиту. Положительный эффект: применение смеси моноклональных антител из которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и средства, обеспечивается получение тест системы, специфичность которой улучшена по сравнению с индивидуальными веществами. 2 з.п. ф-лы. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/577

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4830882/14 (22) 31,08,90 (46) 28.02,93. Бюл, N 8 (31) P 3929119.7 (32) 01.09.89 (ЗЗ) 0Е (71) Берингер Маннхайм ГмбХ(DE) (72) Хорст Баумгартен, Михаэль Гроль и Петер Шталь (DE) (56) ЕПВ N . 0,088974, кл. G 01 N 33/54, 1983. (54) СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОДНОВАЛЕНТНЫХ АНАЛИТ0В (57) Использование. для обнаружения одновалентных аналитов иммунологическим методом. Цель; повышение специфичности

Изобретение относится к способу обнаружения аналитов с помощью иммунологического метода.

Целью изобретения является повышение специфичности определения путем подготовки рецептора с повышенной специфичностью.

Неожиданно путем применения смеси моноклональных антител, из которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и сродства. удалось получить тест-систему, специфичность которой улучшена Ilo сравнению с индивидуальными веществами.

Для иммунологического способа. известного (конкурентоспособного) обнаружения имеется множество вариантов, которые общеизвестны, Как правило, для моновалентных аналитов, в особенности гаптенов, предпочтительны два тест-принципа: либо рецептор, который связан с твердой фазой, . реагирует с пробой и маркированным аналитом, либо маркированный рецептор реа„,5U „„1799471 АЗ определения. Сущность изобретения: для обнаружения аналитов с помощью иммунологического способа используют смесь не менее двух способных специфически связываться с аналитом моноклональных антител, перекрестная реакционноспособность которых различна при соотношении антител

0,1 — 10 1 и трехкратном количестве МКА по отношению к аналиту, Положительный эффект: применение смеси моноклональных антител иэ которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и средства, обеспечивается получение тест системы, специфичность которой улучшена по сравнению с индивидуальными веществами. 2 з.п. ф-лы. гирует с пробой и связанным с твердой фазой аналитом. В случае относящегося к изобретению, как правило, антитело используется в зквимолярном количестве или в избытке.

Образовавшиеся комплексы можно разделять и известным образом оценивать маркировку.

В зависимости от соответствующего способа, предлагаемая согласно изобретению смесь антител может использоваться в качестве маркированного рецептора, связанного с твердой фазой рецептора, агглютинирующего рецептора и т.д. Для используемой согласно изобретению смеси антител выбираются моноклональные антитела, сродство которых находится н оптимальной области и которые обладают немногими перекрестными реакциями, причем перекрестная реакционноспособность лежит выше заданного значения. Перекрестные реакционные способности используемых для смеси антител различны, т.е, 1799471

i антитела реагируют с различными, подо- в большом количестве. Соотношение отбными обнаруживаемому веществу соеди- - дельных антител выбирается в зависимости . нениями. Т.е. антитело вступает в от данных условий. Предпочтительно исперекрестные реакции с веществами, с ico- пользуют смесь двух антител, соотношение торыми другие. антитела доказуемо не реа- 5 между которыми составляет 0,1 — 10;1. гируют или практически не реагируют (и . Путем смешения по меньшей мередвух наоборот). Перекрестная реакционноспо- антител, которые вступают с различными собйость антитела к определенному веще- соединениями в мешающие побочные реакству при этом не является никакой ции, в"целом снижается перекрестная реакабсолютной, а является относительной ве- "0 ционноспособность. Это снижение, как личиной измерения, которая:зависит от со- правило, при этом превышает эффект разответствующей тест-системы; Репером бавления, так что очевидно имеется сине(точкой отсчета) является определяемый ргетическое повышениедействия. аналит, с которым специфически связано:. Предлагаемый в изобретении способ антитело. Измерительный сигнал, который.15 позволяет использовать моноклональные достигается при реакции с аналитом, уста-, . антитела, которые не идеальны,в отношенавливается вплоть до 100%. 8 отсутствии нии специфичности. Скрининг таких, только или в присутствии аналита задаются различ-: . частично пригодных для теста антител; меные концентрации перекрестно реагирую-: . нее рисковай и поэтому дешевле и быстрее, щих веществ для тест-раствора ; С 20 Благодаря применению смеси двух или боперекрестно реагйрующим веществом за-" лее. моноклональных антител, из которых тем получается измерительный сигнал, ко- каждое. непригодно для теста само по себе тарый соответствует определенному:-.. по отдельности, можно иметь достаточно количеству собственно аналита, Отсчет идет специфические тест-Системы, так как благо-. в области самой высокой прецезионности 25 даря смешению нескольких антител с разкалибровочйой кривой; Этот..сигнал также::, личной -. .. перекрестной выражается в процентах. Перекрестная ре- .:: реакционноспособностью s целом может акция, например, 10% обозначает, что нуж- . иметься в распоряжении сйстема, которая но использовать 10-кратное количество .: удовлетворяет требованиям. перекрестно реагирующего вещества, что- 30 Изобретейие поясняется следующими бы достичь такого же измерительного сигна- . примерами.. ла, как и с помощью однократного Пример 1. Определение концентраколичества аналита. В другой тест-системе: ции стероида в растворах. для перекрестно реагирующего вещества . Для обнаружения стероидов в буфере можйо определить другое значение; Требу- 35 или жидкостях организма (сыворотка, плаземые втесте перекрестные реакции(задан-.. ма, моча и т,д.), используют ферментный ные . значейия) зависят от тест по следующему конкурентному принконцентрационного соотношения соответ- ципу: ствующего перекрестно реагирующего Be,-. Материалы; трубка (пробирка) Z игап без щества к" аналиту и поэтому могут быть .40 покрытия, стрептавидин; альбумин сывоочень различны;. ...,, ::: .:, . ротки крупного рогатого. скота (RSA); рас-Для изобретения можно применягь.мо-.:: ." .твор "субстрата: (100 ммоль/л ноклональные антитела, перекрестная ре- ::фосфат-цитратнога буфера, рН 4,4, 3,2 акционноспособность ..: которых . ммоль/л. пербората натрия, 1,9 ммоль/л относительно вещества составляет до трех- 45 ABTS/ диаммониевая соль, 2,2 -азино-ди кратного, предйочтительно вплоть"до двух- : . /3-этйл-бенэтиазолинсульфокислоты (6)/; кратного верхнего заданного значения,:-: буфер для-покрытия. 200 ммоль/л натрийЗаданная область лежит между (пределом) карбонатного буфера, рН 9,6; буфер для разграницей обнаружения и принимаемой so --:.: бавления: 50 ммоль/л натрийфосфатного внимание для соответствующего теста гра- 50 буфера, рН 6,8; 0,3% RSA; промывной расйицей погрешности. Согласно изобрете- . : "твор:0,9% NaCI, нию, используют смесь по меньшей мере ": -: . Бйотинилирование MAKS осуществля" двух моноклональных антител. Также мож- ": ется согласно !АСЯОО/(1978) 3585-3590 с но Смешивать более, чем 2 видов.монокло- "биотийом путем взаимодействия с й-оксинальных антител. Соотношение, в котором 55.. сукцйнимидбиотином в соотношении 10:1. находятся ийдивидуальные моноклональ- :: -"(Трубки) пробирки с препаратом очи. ныеантителавсмеси,выбираетсявзависи- "щенного раствора антитела (10 мкг/мл) в мости от их сродства и специфичности. Как покрывном буфере(0,2 моль/л карбонат) бийравило, антителосминимальной перекре- карбонат натрия, рН 9,6 инкубируют при стной реакционной способностью имеется комнатной температуре в течение 1 ч. Про1799471 исходит спонтанное связывание этого антитела со стенкой пробирки. Пробирки затем дополнительно обрабатывают с помощью

50 ммоль/л фосфатного буфера 0,3% альбумина в течение 15 мин и промывают.

Специфические антитела добавляют в буфер для разбавления и инкубируют в течение 60 мин. Затем добавляют 600 мкл пробы (аналит, перекрестно реагирующие вещества и т.д.) и 500 мкл коньюгата фермента (Эстриол-РОД, РОД вЂ” активность; 200 mU/ìë) и инкубируют 60 мин. Для того, чтобы дополнительно исследовать перекрестную реакцию к другим стероидам, добавляют к раствору пробы различные количества испытуемого Стероида. Понижение измерительного сигнала за счет других

: стероидов обозначает перекрестную. реак- цию, высота которой на стандартной кривой может отсчитываться с помощью подлинного аналита. После дальнейшей стадии промывки . определяется актйвность пероксидазы путем добавкй раствора субстрата, для проявления красителя (1000 мкл) предварительно осуществляют- дальней; шую инкубацию (30 мин).. Измерение окрашенной смеси осуществляется при 422 нм на фотометре.

Пробирки с раствором стрептавидина инкубируют в течение 1 ч (при комнатной . температуре в покрывалом буфере и допол:. нительно обрабатывают с йомощью 50, ммоль/л фосфатного буфера, 0,3% альбумина в. течение 15 мин и промывают.

Специфические антитела добавляют в буфер для разбавления и инкубируют в течение 60 мин. Затем добавляют 600 мкл . пробы (аналит, перекрестно реагирующее

: вещество и т,д,) и 500 мкл коньюгата фер. мейта (Эстриол-РОД, РОД вЂ” активность. 200

- MU/ìë и инкубируют в течение 60 минут. .Для того, чтобы дополнительно исследовать перекрестную реакцию к другим стероидам, к раствору пробы добавляют различные количества йспытуемого стероида, Снижение

- . измерительного сигнала за счет других сте: роидов означает перекрестную реакцию, высота которой может отсчитываться на стандартной кривой с подлинным аналитам. После дальнейшей стадии промывки

"определяется активность пероксидазы путем добавки раствора субстрата; для проявления красителя (1000 мкл) осуществляют предварительно дальнейшую инкубацию (60 минут). Измерение" окрашенной смеси осуществляют при 422 нм в фотометре, Пример 2, Определение перекрест. ных реакций для смесей МЛК (Экстриол

19,6,9 и МАК Экстриол.1.26.18

Материалы . дит согласно примеру 1б

Результаты показывают, что МАК 19,6,9 сильно перекрестно реагирует с эстрадиолом и эстетролом, в то время как MAK

1,26.18 сильно перекрестно реагирует с эстриол-3-сульфатом и эстриол-3-глюкурони25 дом. Антитела используют в различных соотношениях в смеси. При различных соотношениях компонентов в смеси изменяются соответствующие перекрестные реакции, 30 Получается более оптимальная и более предпочтительная область, Пример 3. Определение перекрестных реакций для смесей МАК эстриол 19,6,9 и MAK эстриол 9В4.С2.

Осуществление определения npovcxo35 дит аналогично примеру 1а. МАК 9В4,С2 (Изготовитель IPL, Interpharrn LabaratorIea

Ltd, Negus 2iona 76110, Израиль) реагирует аналогично 1;26.18 сильно перекрестно с

ЕЗ-3-сульфатом и ЕЗ-З-глюкуронидом.

Также здесь получается MAK-концентрация, при которой XR отчетливо снижена, Пример 4. Определение перекрестных реакций для смесей МАК тестостерон

4.0

8.15,1 и МАК тестостерон 700-03

Материалы: — непокрытые пробирки Zurem

-поликлональные овечьи антитела (IgG) против мышиного Fc ф 0 мкг/мл; для покрытия пробирки) — Кротеин С

Тестостерон РОД вЂ” коньюгат (тестостерон-РОД вЂ” конъюгат готовят так, что тестостерон активируют в 3-положении с помощью карбоксиметилоксина и этерифицируют сукцинимидом. Полученный сложный эфир сочетают прямо с РОД/РОД— активность 100 mU (мл), Тестостерон

-/ЕЗ РОД-коньюгат/ЕЗ-РОД-Конъюгат ото ят так, что зкстриол активируют в 6-положении с помощью неполного сукцината и затем этерифицируют сукцинимидом, Пол5 ученный сложный эфир сочетают непосредственно с пероксидазой (500 и 100 mU РОД вЂ” активность/мл — МАК (E3) 19,6.9 (ЕСАСС89082503) биотинилируют (100 мкг/мл)

10 — MAK (ЕЗ) 1.26,18 (ЕСАСС 89082502) биотинилируют (1000 мкг/мл). Концентра-. ции используемых, перекрестно реагирую-. щих веществ: Эстриол (ЕЗ): О, 5, 10, 20, 40 нг/мл) в тесте 1:5 разбавление/Экстрадиол

15 (Е2): 10, 100 нг/мл. Эстетрол (Е4): 10, 100 нг/мл. Е3-3-сульфат; 50, 100 нг/мл ЕЗ-3глюкуронид: 50, 100 нг/мл

Осуществление определения происхо1799471

4-андростен-3.17-дион = андростендион

2, Способ поп.1,отличающийся тем, что используют смесь двух моноклональных антител в соотношении 0,1 — 10:1.

3, Способ по пп. 1 или 2, о т л и ч а юшийся тем, что используют трехкратно количество маноклональных антител по отношению к аналиту с перекрестной реакционнослособностью к одному или нескольким веществам.

Составитель В. Брусиковская

Тех ред М.Моргентал Корректор С. Юско

Редактор

Заказ 793 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

11-кето-тестостерон

МАК тестостерон! 8,15,1 (ЕСАСС

89082501) 5

Мак, тестостерон 700-03 (изготовитель:

Med(х 81otech 1пс., Forester City, СА 94404, США: Bert — N

Т-700-03).

Концентрация используемых перекре- 10 стно реагирующих веществ: тестостерон: О. 1,25, 2,5. 5, 10, 20, 40 нг/мл андростендион: 2,5, 5, 10. 20, 40, 80, 160.

320, 640 нг/мл 15

11-кето-тестостерон; 2,5, 5, 10, 20. 40, 80. 160, 320, 640 нг/мл определение осуществляют аналогично примеру 1а, Результат: .20

MAK 8, t5.1 и МАК 700-03 являются специфическими антителами против тестостерона. однако. показывают относительно высокий

XR к андростендиону. соответственно, 11кето-тестостерону. 25

Неприсовдиненные антитела используются в различных соотношениях в смеси.

Пример, 5. Определение перекрестной реакции дя смесей МАК фенобарбитал

Z.341.115 и MAK фенобарбитал 2,93.37 30

Материалы: трубы дурана без покрытия, поликлональное антитело овцы (IgG) против мыши — Fcy (г/мл) для нанесения покрытия на трубы), 35 . кротеин С, коньюгат фенобарбитала-РОД (коныюгат фенобарбитала-РОД получают в результате того, что производят активирование через N в 1-положении бутиратом и этери- 40 фикацию посредством сукцинимида. Образованный сложный эфир связывают непосредственно с РОД (активность РОД

100 милли-единиц/мл), фенобарбитал, 45 секобарбитал, амобарбитал, пентобарбитал; примидон, МАК фенобарбитал 2.341.115 (ECACC 50

90071903), МАК фенобарбитал 2.93.37 (ЕСАСС

90071904).

Концентрация введенных перекрестно реагирующих веществ: фенобарбитал: О. 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125 нг/мл секобарбитал: 0.2, 1,иг!мл, амобарбитал: 0,2. 1,иг/мл пентобарбитал: 0,2, 1 р гlмл примидон: 1,5р н/мл.

Определение производят аналогично примеру 1а.

Результат:

МАК 2.341, 115 и MAK 2,93.37 представляют специфические антитела относительно фенобарбитала, но показывают сравнительно высокие перекрестные реакции, во-первых, к примидону (МАК 2.341.115), во-вторых. к секобарбиталу. амобарбиталу и пентобарбиталу (МАК 2.93.37), Антитела применяют в различных соотношениях между частями смеси.

На перекрестную реакцию МАК-смеси относительно фенобартитала может оказывать влияние смешивание. И здесь может применяться соотношение между частями смеси, при котором все перекрестные реакции лежат ниже ожидаемых величин.

Формула изобретения

1. Способ иммунологического определения одновалентных аналитов путем конкурентного связывания определяемого аналита с определенным количеством мар. кированного или иммобилиэованного моноклонального антитела. отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности, используют смесь не менее двух моноклональных антител, специфически способных связываться с аналитом, перекрестная реакционноспособность которых различна.