Способ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита в у детей

Способ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита в у детей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого гепатита у детей. Цель - повышение точности спфсоба. Для этого в первые 3-6 месяца периода реконвалесценции определяют величину титров антител IgM класса к липопротеиду печени человека, при этом посадку липопротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере рН 7,4, при получении первичного комплекса антиген-антитело сыворотку больного раститровывают с шагом 1/3, инкубируют 10- 14 ч при температуре 4-10°С, отмывку проводят фосфатно-солевым буфером рН 7,4, в качестве конъюгата используют иммуноглобулины класса IgM, меченные пероксидазой, связывание конъюгата с антителами проводят в 1% растворе овечьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-еолевом буфере рН 7,4, при титрах антител 1,3600-1:10800 диагностируют благоприятное течение реконвалесценции , а при титрах 1:400-1:1200 диагностируют неблагоприятное течение реконвалесценции вирусного гепатита В. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s 6 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4829043/14 (22) 25.05.90 (4о) 15,03.93. Бюл. ¹ 10 (71) Рижский медицинский институт (72) А.Ф,Блюгер, Х.М.Векслер, В.Ф,Учайкин, В.А.Станевич и И.К.Шестакова (56) Приказ МЗ СССР ¹ 752 от 1981 г, по лечению и диспансеризации детей ВГВ. (54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕН )Я РЕКОНВАЛЕСЦЕНТНОГО ПЕРИОДА

ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В У

ДЕТЕЙ (57) Изобретение относится к медицине, в чаСтности к гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого гепатита у детей, Цель — повышение точности спОсоба, Для этого в первые 3 — 6 месяца периода реконвалесценции определяют веИзобретение относится к медицине, каса тся области гепатологии, в частности вопросов диагностики течения периода реко валесценции острого вирусного гепатита Ь (ОВГВ).

Целью является повышение специфичноСти диагностики.

Способ осуществляется следующим образом, Методика постановки иммуноферментного анализа

В лунки платы вносят 100 мл разведенного в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН

7,4 липопротеида печени человека (ЛПЧ) и инкубируют 10 — 16 часов при+4 — +10 С, Отклеивают плату от несвязавшегося антигена ФСБ рН 7,4; Во всех последующих. Я2 1802324 А1 личину титров антител IgM класса к липопротеиду печени человека, при этом посадку липопротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере рН

7,4, при получении первичного комплекса антиген-антитело сыворотку больного раститровывают r. шагом 1/3, инкубируют 10—

14 ч при температуре 4 — 10 С, отмывку проводят фосфатно-солевым буфером рН

7,4, в качестве конъюгата используют иммуноглобулины класса lgM, меченные пероксидаэой, связывание конъюгата с антителами проводят в 17, растворе овечьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-солевом буфере рН 7,4, при титрах антител 1,3600 — 1:10800 диагностируют благоприятное течение реконвалесценции, а при титрах 1:400-1:1200 диагностируют неблагоприятное течение реконвалесценции вирусного гепатита В, 00 стадиях отмывку проводят тем же реагентом.

В лунки платы помещают по 100 мл предварительно разведенной в ФСБ рН 7,4 от 1:400 до 1:10800 (с шагом 1/3) исследуе- М мой сыворотки больного и отрицательного 4 контроля (пул сывороток здоровых донорое). Инкубируют10 — 1б ч при 4 — 10 C. ) н

Удаляют избыток образцов из лунок.

Плату отмывают.

В лунки вносят 100 мкл конъюгата (иммуноглобулинов; меченных пероксидазой), разведенного в растворе 17 бычьего сывороточного альбумина (БСА), приготовленного на ФСБ рН 7,4. Инкубируют 1 ° при 37 С.

Удаляют избыток конъюгата из лунок, плату отмывают.

1802324

Помещают в лунки по 100 мкл субстратНоА смеси (перекиси водорода и 5-аминосалициловой кислоты). Инкубируют плату 1 ч при комнатной температуре.

Результаты определяют на фотометре при длине волны 450 мм, Если титр антител снижается ниже 1:3600 (1:1200, 1;400, меньше 1:400) это показатель неблагоприятного течения реконвалесцентного периода. Если титр повышается выше 1:3600 (1:10800, 1;32400) — это указывает на благоприятное течение периода реконвалесценции ОВГВ, Положительный эффект, достигаемый . при использовании изобретения, заключается в повышении достоверности диагностики благоприятного и неблагоприятного течения периода реконвалесценции при

ОВГВ у детей.

Было обследовано 33 ребенка больных

ВГВ, у которых в результате диспансерного наблюдения по совокупности общепринятых клинико-биохимическим критериям, выявили благоприятный (21 ребенок) и неблагоприятный (12 детей) течение периода реконвалесценции ВГВ.

Как следует из данных, ложноположительное повышение показателей активности

АлАТ при благоприятной реконвалесценции отмечается в 9 из 21 случая, т.е. в 43 ч- 11, а ложноотрицательные показатели активности АлАТ при неблагоприятной реконвалесценции отмечается в 5 из 12 случаев, т.е. 33 + 14 . Следовательно правильный ответ с помощью способа-прототипа был получен в 20 из 33 случаев, т,е. 60 и 9 .

С помощью нового способа, правильный ответ был достигнут в диагностике благоприятного варианта реконвалесцентного периода в 20 случаев, т.е, в 95, а в диагностике неблагоприятного варианта в 11 случаев, т.е. 91 .

Таким образом, с помощью нового способа правильный диагноз основных вариантов реконвалесцентного периода был установлен в 31 случаев, т.е. в 93 + 3 j.

В процессе разработки нового способа экспериментально были исследованы следующие этапы его осуществления:

Оптимальные условия связывания антигена путем "пассивной" адсорбции были достигнуты при использовании фосфатносолевого буфера (ФСБ) рН 7,4. Инкубация при +4 — +10 С в течение 10-14 часов сведений к минимуму колебания в содержании связан ного антигена, что дает хорошую воспроизводимость результатов; при использовании физиологического раствора с добавкой 0,05 твин-20 связы5

55 вания антигена с подложкой не происходило, Применение 0,01 M карбонатного буфера рН 9,5 требовало большего, чем в случае с ФСБ количества антигена (в 2,5 раза), что приводило к увеличению числа ложноположительных результатов, появлению фона.

Таким образом, оптимальных результатов при связывании антигена с поверхностью платы можно достигнуть лишь при использовании ФСБ рН 7,4.

После сорбции для отмывки от избытка антигена наиболее приемлемым оказался

ФСБ рН 7,4. Использование в качестве добавки к нему твин-20 или замена его физиологическим раствором приводили к частичному снятию антигена с подложки, что приводило к увеличению фона и снижению воспроизводимости анализов.

Предварительное разведение исследуемых образцов до 1:400 с последующим шагом титрования позволяет надежно проводить инситирование антител в подходящем диагнозе концентраций с достаточной точностью определения.

Шаг титрования 1/2 не позволяет с достаточной степенью точности проводить дифференцию образцов, Шаг титрования 1/5 приводит к сужению возможности точного определения прогностически значимых титров, Исследуемые образцы инкубировали

10 — 14 часов при +4 — +10 С что позволило снизить уровень неспецифического связывания увеличить чувствительность метода, Пример 1. Ребенок П., 4-х лет, N дисп,карты 1721, с диагнозом вирусного гепатита В, В периоде реконвалесценции жалобы отсутствуют, размеры печени в пределах нормы, При определении титра антител к протеидному антигену печени класса

igM, он был равен 1;3600, что послужило обоснованием для диагноза благоприятного варианта течения реконвалесценции больной. Однако активность аланинаминотрансферазы (ANAT) выявилось 70 усл.ед. (норма до 50 усл.ед,), что бы дало основание предполагать неблагоприятный вариант течения реконвалесценции.

Последующим диспансерным наблюдением в течение полугода установлено отсутствие субъективных и объективных проявлений наличия патологического процесса печени, в частности нормализовалась АлАТ, тимоловая и сулемовая пробы, Ребенок признан здоровым. Тем самым подтверждена правильность диагноза благоприятного варианта рекон- . валесценции после перенесенного вирусного гепатита В.

1802324

С no) диаг лесц

12 де ощью способа-прототипа правильный оз благоприятного варианта реконвантного периода ВГВ был установлен у ей, из 21 ребенка, т.е, только 57 и 11% 40

Составитель Г.Крюкова

Редактор В,Трубченко Техред М.Моргентал, Корректор А.Обручар

Заказ 847 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Пример 2. Ребенок В., 3 года, N.. диспэнсерной карты 2114, с диагнозом виру ного гепатита В, период реконвалесценцйи, Ребенок, кроме ускоренной усталости, 5 жалобы не предъявлял, печень — нижний край бе выступал на 0,5 см, по правой сосковой л нии. ,ри определении титра антител к протеид ому антигену класса М, он оказался 10 повышенным, равным 1:10000, На этом основании был выставлен диагноз — благоприятный вариант течения реконвалесцентного пери да болезни. .днако активность АлАТ вЂ” 190 усл,ед. 15 (норМа до 50 усл.ед.), Это дало повод предположить диагноз неблагоприятного варианта влечения периода реконвалесценции.

Последующим диспансерным наблюдени м в течение 7 месяцев была отмече- 20 на нОрмализация активности АлАТ при нормальном содержании проведенных колл идно-осадочных проб и билирубина, на ф не отсутствия субъективных и объективных данных патологического процесса. 25

Таким образом, была подтверждена достоверность диагноза благоприятного варианта реко валесцентного периода у ребенка после перенесенного ВГВ, поставленного с помо(цью нового способа. 30

Г оказано, что диагноз благоприятногд реко валесцентного периода ВГВ был подтвержден в результате длительности 6 — 8 месяцев диспансеризации детей с учетом отсутствия клиника-биохимических призна- 35 ков активности патологического процесса, случаев, у которых активность АлАт находилась в пределах нормы, У остальных 9 реконвалесцентов активность АлАТ находилась выше нормы (65 — 195 усл,ед.). При учете титра антител к протеидному антигену печени класса IgM, правильный ответ получен в 15 из 21 случая, 14,4%, т.е. P > 0,5. Только при использовании нового способа путем определения антител к протеидному белку печени класса IgM в 20 случаев был правильно диагностирован благоприятный вариант реконвалесценции ВГВ.

Формула изобретения

Сгтособ прогнозирования течения реконвалесцентного периода острого вирусного гепатита В у детей путем исследования сывороток крови больных, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, в первые 3 — 6 месяцев периода реконвалесценции определяют величину титров антител igM класса к липопротеиду печени человека с помощью иммуноферментного анализа, при этом посадку липопротеида на полистироловые планшеты проводят в фосфатно-солевом буфере с рН

7,4, сыворотку больного рэститровыванную с шагом 1/3, инкубируют 10 — 14 ч при температуре 4 — 10 С, отмывают фосфатно-солевым буфером с рН,4, в качестве конъюгата используют иммуноглобулины класса IgМ, меченные пероксидазой и связывание коньюгата с антителами проводят в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на фосфатно-солевом буфере с рН 7,4, и при титрах антител 1;3600—

1:10800 прогнозируют благоприятное течение реконвалесценции, а при титрах 1:400—

1:1200 прогнозируют неблагоприятное течение реконвэлесценции вирусного гепатита В.