Способ определения гамма-интерферона в лейкоцитах человека

Способ определения гамма-интерферона в лейкоцитах человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к способам определ|ения лейкоцитарного человеческого интер ферона. Целью изобретения является повышение чувствительности определения гам|ма-интерферона в лейкоцитах детей. Цель достигается тем, что для выявления максимальных концентраций продуцированного ин витро интерферона в ответ на вирусный интерфероноген предлагают использовать в качестве последнего вирус А/РР8/Н1М 1, культивировать лейкоциты в присутствии вируса при 37°С в течение 4-6 ч с дальнейшей индукцией при 40°С в течение 2-2,5 ч и последующим добавлением раствора цистеина на 2-2,5 ч с выделением клеток в течение 18-24 ч при температуре 30-33°С после удаления последнего. Положительный эффект способа заключается в возможности определения гамма-интерферона у маленьких детей.

СO)03 СОВЕ ВСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 И 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (Гд С ПАТЕ Н Т СССР) СПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 4853192/14 (22 14.05.90 (46 15.03.93. Бюл. ¹ 10 (71 Ленинградский научно-исследовательск и институт детских инфекций (72 О,А.Аксенов и Е.А,Мурина (56) Вопросы вирусологии, 1989, N 44, с. 463-466. (54» СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАММА-ИНТЕ1ФЕРОНА В ЛЕЙКОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медицинской ви (усологии, в частности к способам определения лейкоцитарного человеческого интерферона. Целью изобретения является повышение чувствительности определения га м1ма-и нтерфе ро на в лей коцитах детей.

Изобретение относится к медицинской вир сологии, в частности к способам определ ния лейкоцитарного человеческого интер ерона.

Целью изобретения является повышение чувствительности определения гаммаинтерферона в лейкоцитах детей. Поставленная цель достигается тем, что в из|вестном способе с помощью индуктора инт рферона — вируса гриппа А/PP/8, вносим го в культуру лимфоцитов детей и дальней него их культивирования в среде 199 или игла с 10% аутоплазмы, согласно изобретению индуктор — вирус гриппа после внеСения в культуру отмывают от клеток через 4 — 6 ч культивируют клетки в течение 4 ч

1 при, температуре 40 С, затем добавляют раствор цистеина на 2-2,5 ч, а после его удавления клетки выдерживают в течение

18-24 ч при температуре 30 — 33 С в указанн ых средах с р Н 8,0-8,2-.

„„Я „„1802328 Al

Цель достигается тем, что для выявления максимальных концентраций продуцированного "ин витро интерферона" в ответ на вирусный интерфероноген предлагают использовать в качестве последнего вирус

А/РР8/Н1№1, культивировать лейкоциты в присутствии вируса при 37 С в течение 4 — 6 ч с дальнейшей индукцией при 40 С в течение 2 — 2,5 ч и последующим добавлением раствора цистеина на 2 — 2,5 ч с выделением клеток в течение 18 — 24 ч при температуре

30-33 С после удаления последнего. Положительный эффект способа заключается в возможности определения гамма-интерферона у маленьких детей.

Культивирование лейкоцитов после индукции вирусом. гриппа проводят при температуре 40 С, что увеличивает скорость синтеза информационных PHK как для альфа-, так и для гамма-интерферона.

Вводимый в реакцию раствор цистеина

0,15-0,2- меняет структуру гликопротеидов мембран лимфоцитов, способствуя выходу более высокомолекулярных белков.

Понижение температуры и изменение рН в сторону 8,0-8,2 дифференцирует выход из клетки гамма-интерферона по отношению к альфа-интерферону, Вновь введенная совокупность признаков дает возможность выявлять способность продуцировать "ин витра" иммунный интерферон в ответ на вирусный интерфе-. роноген, что обеспечивает более ранний и повышенный выход количества гамма-интерферона лейкоцитов.

Способ осуществляется следующим образом, 1802328

У ребенка берут кровь в гепарин в объеме 0,4 мл (из вены или лучше иэ пальца), выделяют клетки белой крови центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15 мин, разводят из расчета 100-200 тыс. в 0,4 мл (2,5х105), вносят вирус гриппа

А/РР/34/Н1М1/ | из расчета 50-100 ЗИД5о.: на клетку и культивируют в течение 4 — б ч в среде Игла (или 199) с 10 аутоплазмы, не содержащей собственного интерферона, 10 температура инкубации в этой стадии

37"С. Далее лейкоцитарную взвесь отмывают от неадсорбированного вируса центрифугированием в указанных выше условиях, разводят в аналогичной среде без вируса и помещают на 4 ч в термостат при температуре 40 С. Спустя указанное время и культуре лейкоцитов добавляют

0,15-0,2 / раствор цистеина, взвесь выдерживают 2,0-2,5 ч при температуре 40 С. 20 осаждают клетки, ресуспендируют их в среде Игла с 10 аутоплазмой и культивируют в дальнейшем 18 — 24 ч при температуре 30—

33 С при рН = 8,0 — 8,2.

Предлагаемый способ по сравнению с 25 прототипом имеет следующие существенные отличия. Полученная после постановки предлагаемым способом индукции интерферона в лейкоцитах детей вирусным индуктором интерферона (25-36,5 ч 30 индукции) надосадочная жидкость после и н а кт ива ции остаточного вируса — индуктора антисывороткой — содержала температурно- и кислотолабильный интерферон, инактивирующийся к гамма-интерферону. 35

Имеет место принцип получения такого интерферона (с активностью 200-2000 ME) с применением ряда новых, отличных от прототипа методических отличий, т.е. 4-х часовое инкубирование при температуре 40ОС 40 ведет к более выраженному синтезу и РНК и белка, причем время инкубации ограничивает выход основной массы синтезируемого к этому времени интерферона, Добавление препарата аминокислоты — 45 цистеина по известным нам причинам усиливает выход гамма-интерферона за счет изменения пространственной конфигурации гликопротеидов мембран, меняющих ее транспортные характеристики. 50

Последующее инкубирование праймированных лейкоцитов при температуре

30 С s условиях рН 8,0 — 8,2 менее разрушает выходящий из клеток у-интерферон, Преимуществами предлагаемого спосо- 55 ба получения ин витро гамма-интерферона является ряд важных моментов. Во-первых, при необходимости обследования ребенка на способность его лейкоцитов продуцировать гамма-интерферон трудно получить ощутимые количества этого типа интерферона, так как используется минимальное количество лейкоцитарных клеток (2-5х105) мл. Как индуктор интерферона в такого рода исследовании (на определение интерфероногенного статуса по гамма-интерферону) целесообразно использовать вирус, могущий инфицировать человека, но не актуальный в настоящий период, в этом случае мы более приближаемся к истинным показателям в отличие от использования различных лектинов или энтеротоксинов грамм-положительных или токсинов грамм-отрицательных бактерий, Штамм вируса А/РР/8 явился в разрабатываемом способе наиболее сильным интерфероногеном из группы вирусов гриппа, испытанных нами. Во-вторых, использование температуры 40 С в начале индукции более отражает условия синтеза и-PHK (для гамма-интерферона) и самого интерферона при инфекционном процессе у детей с наличием выраженной лихорадки. В то же время ряд методических приемов, хотя и не отражают условий инфекционного процесса, однако способствуют максимальному синтезу и выходу этого типа интерферона.

Пример. У ребенка B.È; при определении интерферона по прототипному способу титра интерферона в культуре лейкоцитов в его крови на 1 сут 1;40; 2 сут

1:80; 3 сут 1:80. По тестам на гамма-интерферон при обработке рН титры его стали соответственно 1:40, 1;80, 1:10, однако после обработки антисыворотки к альфа-интерферону его активность резко упала до <

1:10, <1:10, <1:10.

При определении интерферона по заявляемому способу титры были соответственно 1:320, после обработки рН 5,0 <1;10, сыворотка к гамма-интерферону снимала активность интерферона до 1:10, при обработке сыворотки к альфа-интерферону

1:320.

Значимость предлагаемого способа выявления гамма-интерферона при его индукции в лейкоцитах не вызывает сомнений, При возможном лечении интерфероном различных вирусных инфекций выяснение интерферонового статуса, т.е. наличие в крови различных типов интерферонов, а также способности лейкоцитов к их продукции крайне важно для определения оптимальных схем интерферонолечения. Кроме того, изучение интерферонового статуса необходимо при различных иммунодефицитных состояниях (включая СПИД), где. страдает, главным образом, функция синтеза гаммаинтерферона, как основного интерферонового иммуномодулятора иммунитета

1802328 логическим тестированием в ней активности гамма-интерферона, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения гамма-интер4ерона в лейко5 цитах детей, в качестве ь ндуктора используют вирус гриппа штамма А (PPB), культивирование в присутствии вируса проводят при 37 С в течение 4 — 6 ч, далее лейкоциты отмывают от неадсорбированного

10 вируса и инкубируют в питательной среде при 40 С в течение 4 ч, после чего в среду вносят 0,15-0,20 -ный раствор цистеина и дополнительно инкубируют при 40 С в течение 2,6-2,5 ч, отмывают, культивируют в пи15 тательной среде при температуре 30 С, рН

8,0 — 8,2 в течение 18-24 ч. организма. Особенно важно значение разработанного способа для определения гамма-интерферона у маленьких детей, учитывая необходимость взятия минимального количества крови, а также роли интерферона в системе гормонов роста, регулирующих рост и развитие ребенка.

Формула изобретения

Способ определения гамма-интерферона в лейкоцитах человека путем выделения лейкоцитов из крови, ресуспендирования в питательной среде, внесения в среду индуктора — вируса гриппа, культивирования ин-. дуцированных лейкоцитов с последующим отделением культуральной жидкости и биоСоставитель П.Бонарцев

Редактор В.Трубченко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M.Êåðåöìàí

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 847 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5