Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической нв-вирусной инфекции у детей

Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической нв-вирусной инфекции у детей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: клиническая иммунология вирусных инфекций, выявление вторичного иммунодефицитного состояния у детей, страдающих хроническими персистирующим вирусным гепатитом В. Цель -упрощение способа, Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют уровень а -тимозина и при его значениях менее 831 пг/мл или более 1475 пг/мл диагностируют вторичный иммунодефицит .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ CCCP) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛБСТВУ (21) 4860042/14 (22) 16.08.90 (46) 15.03.93. Бюл. М 10 (71) Ленинградский научно-исследовательски ) институт детских инфекций (72) И.А.Попова, И.В.Гользанд и Б.В.Попов (56) Тер.архив, 1989, М 2, с. 72- 76. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ НВ-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У

ДЕТЕЙ Изобретение относится к медицине, точнве клинической иммунологии вирусных инфекций и предназначено для выявления вторичного иммунодефицитного состояния ! у детей, страдающих хроническим персистирующим вирусным гепатитом "В" по содержанию гормона тимуса а1 -тимозина в сыво отке их крови. реди вирусных гепатитов ведущая роль в формировании наиболее тяжелых форм и хронизации процесса принадлежит вирусному гепатиту В (ВГ "В").

П ри В Г "В" в патогенезе инфекции важная роль принадлежит особенностям иммунного ответа заболевшего, приводящим к развитию вторичного иммунодефицитного состояния и развитию иммунного цитолиза в печфни.

В последние годы многочисленные исследования советских и зарубежных авторов подтверждают факт инициирования НВ-виpycoQ иммунокомпетентных клеток (ИКК).

Взаимодействуя с мембраной ИКК НВ-вирус нарушает их нормальное функционирование, следствием чего является стойкая

„„QJ 1802329 Al (57) Использование:. клиническая иммунология вирусных инфекций, выявление вторичного иммунодефи4итного состояния у детей, страдающих хроническими персистирующим вирусным гепатитом "В". Цель — упрощение способа, Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют уровень а1 -тимозина и при его значениях менее 831 пг!мл или более 1475 пг/мл диагностируют вторичный иммунодефицит. иммуносупрессия и формирование хронического процесса.

Характер иммунодефицита при ВГ "В" по существу и определяет клинические особенности болезни и исход заболевания в целом, Степень выраженности иммуносупрессии может определяться не только непосредственным инфицированием ИКК, но и нарушением сложных механизмов иммуно-. регуляции. с

В этой системе важная роль принадлежит функциональному состоянию тимуса и 6д его гормонам, регулирующим дифференци- Я ровку ИКК и обеспечивающим их эффектор- © ные функции. Нарушение гуморальной активности тимуса неизбежно приводит к дисбалансу Т клеточных популяций и сопровождается той или иной степенью выраженлясЪ ности иммунодефицита, В экспериментах на иммунодефицитных животных и в клинической практике (у больных первичными иммунодефицитными состояниями, ревматоидным артритом, первичным билиарным циррозом печени, красной волчанкой, ХАГ "В", карциномой легких, 1802329 бронхиальной астмой) лечение препаратами тимусных гормонов приводило к нарастанию числа ауто- и Е-РОК, увеличению выработки иммуноглобулинов, усилению реакции Т-лимфоцитов на митогены.

Среди большой группы известных в настоящее время тимусных факторов большой интерес исследователей и практических врачей привлекает группа высокоочищенных тимусных пептидов из семейства тимозинов. таких как тимозины а1, а7,/Зз, Р4 .

Па мнению большинства исследователей, основные регуляторные функции в дифференцировке Т-лимфоцитов осуществляет а1 -тимозин, под действием которого образуются Тлф, несущие СД4 маркер (Тлф хелперы-индукторы).

Таким образом а1 -тимозин определяет иммунологические феномены, опосредуемые Т-хелперами-индукторами: тимусзависимая продукция антител; продукция у И а -интерферонов; выработка МИФ (фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов) синтез инртерлейкина — 2 и др.

Кроме того, а> -тимозин, стимулируя образования эритроцитарных рецепторов на лимфоидных клетках приводит к увеличению ауто- 1 Е-PQK, Механизм действия

ai -тимозина заключается в экспрессии соответствующих рецепторов на предшественниках Т-хелп,инд.

В последние гоДы доказана неоднородность данной субпопуляции Тлф и аргументирована ее центральная роль в обеспечении эффективной иммунной реакции клеточного или гуморального типа.

B связи с вышеизложенным содержанием а1-тимозина в сыворотке крови больных

ХВГ "В" может рассматриваться как показатель состояния Т-клеточного иммунитета.

B настоящее время диагностика вторичного иммунодефицитного состояния основывается на совокупности клиникоиммунологических показателей.

Оценка иммунного статуса больного в клинике включает определение общего числа Тлф и основных субпопуляций Тлф хелперного и супрессорного типов.

Тест роэеткообразования с эритроцитами и на сегодня является несомненного надежным и весьма распространенным в клинической практике.

Оценку субпопуляций Тлф хелперного и супрессорного типа проводят также с использованием розеточного теста по наличию поверхностных Р, рецепторов для IgM и lgQ (Т и Т лимфоциты) или, чаще всего, по чувствительности роэеткообразующих клеток к теофилину (ТФР и ТФЧ лимфоциты).

Все перечисленные методы являются трудоемкими, требующими дорогостоящих

5 и дефицитных реагентов, реактивов, содержания лабораторных животных, Кроме того, для получения взвеси моноклеаров необхо- . дим большой объем крови (3 мл), который можно взять только путем венепункции. Ме"0 тоды субъективны, так как счет ведется визуально, в связи с чем возможны погрешности счета, В последнее время используют моноклональные антитела для определения общего числа Тлф и субпопуляций в методах иммунофлюоресценции и цитотоксическом тесте.

Однако метод имеет также недостатки, связанные с потерей числа Т8 субпопуляции лимфоцитов, возникающей при выделении мононуклеаров из периферической крови.

Это приводит к изменению соотношения

Т4/Т8, не отражающему истинного положения вещей.

Целью изобретения является повышение достоверности, за счет установления нового высокоинформативного показателя иммунологического статуса, а именноуровня и -тимозина, в сыворотке крови, при отклонениях которого от пределов физиологической нормы (от 831 до

1475 пг/мл) у детей, больных ХВГ "В" диагностируют вторичный иммунодефицит.

Установлена связь содержания а1 -тимозина явлением вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вирус инфекции, подтвержденного другими иммунологическими показателями в сопоставлении с характером клинических проявлений, Способ осуществляется следующим образом.

Создана тест-система на основе поликлональных (кроличьих) антител. В основе системы использован метод конкурентного (ИФА), иммуноферментного анализа, когда

45 Al жидкой фазы конкурирует за связь с AT, находящимися в комплексе с АГ твердой фазы.

Для построения референс-ряда брали шесть различных концентраций с1 -тимозина от 0,1 нг/мл до 3,2 нг/мл. Контрольными служили пробы, не содержащие антигена и антител. Рабочее разведение сыворотки кролика (1АТ) 1;10000. Обязательным условием реакции связывания между АГ и AT была продолжительная инкубация при температуре 4 С. Для предотвращения неспецифического связывания AT в отмывочный раствор фосфатного буфера и в смесь АГ+АТ добавляли 0,1 объема детергента твин-20.

1802329

Р еакцию тестировали добавлением антикроличьих антител (2АТ) фирмы "Sigma", коньюгированных с пероксидазой в рабоче" разведении 1;2000, хромогена-ортофенилендиамина и субстрата 30 перекиси водорода. Счет реакции производили на мультискане фирмы "Flow" по уменьшению

Сигнала оптической плотности при 450 нм в сравнении с контрольной пробой, не содержащей специфического антигена. Продол сительность опыта от начала реакции до считывания составляет 40 ч.

Одновременно в реакции могут быть исследованы 32 пробы сывороток крови. Ниже подробно излагается методика определения уровня а1 -тимозина с помощью тестСистемы методом конкурентного ИФА.

Порядок работы.

Подготовка необходимых реактивов и г1 риборов; фосфатный буфер или раствор Хенкса, Na-фосфоцитратный буфер, ортофенилендиамин, 30%-ный раствор перекиси водорода, твин-20, кроличьи антитела в разв. 1:1, гф -тимозин, коньюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена, пробы сывороток для исследования; рН-метр, термостат, холодильник, автоь этическая пипетка-дозатор с наконечникаМи, высокосорбционные 96-луночные пластины фирмы "Nunk", "titiievtek", планеты для иммунологических исследований едполимер",мультискан, Постановка опыта:

Фиксация а1 -тимозина (АГ) на твердой даче для последующей инкубации: на 96-лунрчную высокосорбционную пластину наносили по 100 мкл в лунку раствор Qt -тимозинэ в, концентрации 1 мкг/мл, в контрольный ряд наносили по 100 мкл в лунку раствор фосфатного буфера, пластину герметически закрывали пленкой "парафилм" им инкубировали в течение 18 ч при 4 С в холодильнике; создание рефенс-ряда; в четыре ряда планшета "Медполимер" наносили по 50 м л в лунку раствор а1 -тимозина в концентрациях 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1)6; 3,2 мкг/мл и кроличьи антитела в разв. 1:100000 по 50 м л в лунку, в смесь добавляли 0,1 объема т и н-20; получение смеси тестируемых сывороток и кроличьих антител (АГ+АТ): в остальные восемь рядов планшеты "Медполимер" наносили сыворотки больных в разведении

1:4 по 50 мкл в лунку и кроличьи антитела в разведении 1;10000 по 50 мкл в лунку с добавлением 0,1 объема твина-20; планшету также герметически закрывали и инку5

45 бировали в течение 18 ч при 4"С в холодильнике; перенос смеси АГ+АТ на твердую фазу: пластину 3-кратно отмывали от несвязавшегося а1 -тимозина раствором фосфатного буфера с добавлением 0,1 объема твина20, на ледяной бане переносили инкубированную смесь стандартных растворов а1 -тимозина и исследуемых сывороток с кроличьими антителами на твердую фазу высокосорбционной пластины "Nunse", пластину герметизировали и инкубировали в течение 18 ч при 4 С в холодильнике; добавление в реакцию двух антител (конъюгата) антикроличьих антител, с пероксидазой в рабочем разведении 1:2000 с добавлением 0,1 объема твина-20 наносили на предварительно 3-х кратно отмытую от непрореагировавших комплексов АГ+АТ пластину "Nunk" тестирование реакции: готовили, раствор ортофенилен диамина, для чего 10 мг вещества растворяли в 10 мл Na-фасфоцитратного буфера рН 4,6; затем в раствор добавляли 4 мкл 30 -ного раствора перекиси водорода, являющегося для пероксидазы; после 3-х кратного отмывания пластины в лунки наносили по 100 мкл смеси субстрата и хромогена; счет реакции производили на мультискане при длине волны 450 нм; определение количественного содержания а1 -тимозина.

По коэффициенту поглощения (ОД) референс-ряда стандартных растворов а1тимозина) строили калибровочную кривую, с помощью которой графически находили соответствующее количество гормона в исследуемой пробе сыворотки, умножая на кратность разведения сы воротки.

Достоверность метода проверили при исследовании аналогичных стандартов гормона и одинаковых проб сывороток в радиоиммунном методе с использованием меченного I а1 -тимозина.

Средний уровень а> -тимозина в сыворотке крови здоровых детей составил

1152 + 161 пг/мл. Статистическую обработку показателей проводили с использоьанием критерия Фишера-Стьюдента (табл.1).

Пределы физиологической нормы а тимозин были определены при вычислении среднего арифметического значения

«+ 2m (т.е, от 831 и г/мл до 1475 и г!мл), одновременно с другими иммунологическими показателями у 24 здоровых детей. Для исследования требуется 0,3-0,5 мл лрови, которую можно забирать из пальца.

1802329

Таблица 1

Средние показатели содержания а> тимозина у здоровых и больных ХВГ "В" детей

Количество обследованных

Группа обследова1 нных

Фаза процесса

Частота регистрации при различных овнях а<-тимозина, а>-тимозин (в пг/мл) 831-1475 пг/мл более

1475 пг/мл менее

831 пг/мл

2429+.328 44,8 9,2

ХВГ "В"

13,8 +6,4

29 обост ение

41 44-9 1 (ХПГ) 1958+186 42,3+5,6

15,4"-4,1

42 34-5,6

11,0 6,4 вялотекуийп о ес

1153 = -161

78,0 +8,5

Здоровые ети

11,0 +6,4

Р1,2-3

Р1,2-3

Р1,2-3

Р1,2-3

Р<0,05

Клинико-лабораторному обследованию подвергались 137 детей, страдающих ХВГ

"В" (ХПГ). Исследования проводились неоднократно в динамике заболевания.

Определение уровня ai -тимозина в сыворотке крови проводили до начала лечения параллельно с оценкой иммунного статуса.

При анализе полученных результатов установлено, что содержание а> - тимозина в сыворотке крови менее 831 пг/мл и более 1475 пг/мл свидетельствует о вторичном иммунодефиците, что полностью подтверждает клинико-иммунологические показатели.

Кроме того, при сопоставлении уровня а1 -тимозина и иммунологических показателей у больных ХВГ "В" (ХПГ) отмечена зависимость характера иммунодефицита от уровня а1 -тимозина. Так, при содержании а> -тимозина ниже границ физиологической нормы явления вторичного иммунодефицита не сопровождается нарушением физиологического соотношения регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т4/Т8).

С другой стороны при отклонении содержания О -тимозина выше нормы явления вторичного иммунодефицита сопровождается относительным дес ицитом Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов, Таким образом, отклонения уровня а> -тимозина от нормы свидетельствуют не только о наличии вторичного иммунодефицита, но и характеризуют тип иммунодефицита, что в конечном итоге определяют выбор схемы иммунокоррекции (табл.2).

Предложенный способ подтверждается примерами, приведенными в табл.3, Приведенные данные свидетельствуют о высокой информативности предлагаемого способа диагностики с использованием нового иммунологического показателя а1 -ти5 моэина. Преимуществом данного способа является его объективность, в то время как другие методы субъективны (счет ведется визуально). Он также не требует дорогостоящих реагентов, реактивов и содержания

10 лабораторных животных. Для осуществления способа необходимо небольшое количе-. ство крови (0,5 мл), которую можно забирать из пальца. Кроме того, с помощью этого способа осуществляется диагностика типа

15 вторичного иммунодефицита, что определяет выбор схемы иммунокоррекции.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к применению в детских инфекционныхх стационарах, что будет способствовать .20 применению адекватных схем иммунокорригирующей терапии и тем самым выздоровлению больного или стабилизации процесса, Формула изобретения, 25 Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вирусной инфекции у детей путем исследования крови пациента и определения диагностического показателя. отличающийся тем, что, 30 с целью упрощения способа, в качестве диагностического показателя используют уровень а -тимозина, который определяют в реакции иммуноферментного анализа в сыворотке крови и при значении измеренного

35 показателя менее 831 пг/мм или более 1475 пг/мм сыворотки крови диагностируют вто, ричный иммунодефицит.

1802329

Таблица 2

Иммунологические показатели детей. больных ХВГ в (ХПГ) в зависимости от уровня сс1 ТИМИЗИНд

Таблица3

Течение болезни

Ф.И.> возраст, ист.б-ни, год

Фаза процесса

Дата оослед.

Уровень т (пг/мл) Иммунолог ичес кне показатели

ТФР Т

I I А Б С ТФЧ ТэГ число

1,5 0,89

Саша А., 3 года ист.б-ни Н 1141 °

1987 ã.

24 марта

3200 пг/мл

1556

0,43 0,6

875

14 апреля

5600 пгlмл

5600 пгlмл

875

6 апреля

0>9 0.8i

3г. 11 мес. ист.б-нн Н 1358, 1988 г.

20 апреля

600 пгlмл

2009

I !

l ° 5 1,1

Г4оЗ

8 июня

450 пг/мл

2,1 1,3

Составитель И.Попова

Редактор В.Трубченко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М.Керецман

Заказ 847 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Роман К., 8 лет, ист.б-ни Н 1557, 1987 г. вялотекущий п.роцесс

Апт 7,2

Аст 3,8

6 13 ° 3 начало рениссии

Апт 1,5

Аст 4,2

6 9,2 вялотекущий процесс

Апт 1О,1

Аст 4,2

6 9>2 вялотекущии процесс

Апт 7,6.

Аст 3,2 б 5,1 ремиссия

Апт 0>5

Аст 0,2

6 5,1

Выписан на 57 день госпитализации.

Ремиссия сохранялась в течение 3 мес., далее - вялотекущий процесс в течение

7 мес.

Выписан на 35 день

roc». e связи с на-; ступлением ремиссии, сохранявшейся в теч. 4 нес.

Дагее - вялотекущий процесс

Выписан на 35 день госпитализации в

Фазе ремиссии, сохранявшейся в теч. 1 года наблюдения