Способ диагностики аллергии

Способ диагностики аллергии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«@д /

p„ / (21) 4929008/14 (22) 04.04,91 (46) 23.03.93, Бюл. М 11 (71) Ленинградский педиатрический медицинский институт (/2) И.М,Воронцов, Е,С,Нишева и М,А.Кириллов

ô6) Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения общего IgE человека Ставропольского НИИ вакцин и сывороток, 1986., (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано для выявления заболеваний anИзобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано для выявления заболеваний аллергического генеза у детей.

Цель предлагаемого способа — повышение точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

Утром натощак у больного из вены или из пальца берут t мл крови в пробирку.

Пробирку оставляют р при комнатной температуре на 1-1,5 часа до образования сгустка, затем пробирку центрифугируют 15 мин при 1500 об!мин, сыворотку крови отсасывают и разливают на 3 пробы; проба А — 0,05 мл сыворотки крови, проба  — 0,1 мл сыворотки, проба С-0,1 мл сыворотки. Пробу С прогревают при 56 С в течение 4 ч, а затем все три пробы замораживают и хранят до момента исследования при -20 С в .морозильной камере, „„5U „„1803873 А1 лергического генеза у детей. Цель — повышение точности диагностики. Для этого у больных с нормальным уровнем сывороточного

IgE дополнительно готовят смесь свежей и прогретой при 56 С в течение 4 ч сыворотки крови одного и того же больного при соотношении свежей и прогретой сыворотки 1:1.

Определяют содержание tgE в смеси свежей и прогретой сыворотки и при снижении содержания IgE в смеси менее чем ía 10, отсутствии изменения содержания Ig E в сме. си или при его повышении по сравнению со свежей сывороткой диагностируют аллергию.

Способ обеспечивает повышение точности диагностики на 30 — 60 по сравнению с известными способами.

1. Этап исследования — измерение уровня IgE в пробе А {осуществляют в полном соответствии с инструкцией по применению тестсистемы, иммуноферментной для определения общего 1оЕ человека; Ставропольского НИИ вакцин и сывороток), следующим образом: 1. Пробу А, содержащую 0,05 мл свежей сыворотки крови больного размораживают и разводят раствором N. 1 (прилагается к набору для определения Ig E) 1:10, т.е, к 0,05 мл исследуемой сыворотки прибавляют 0,45 мл раствора М 1.

2. Инкубация со стандартом tgE и исс-, ледуемыми образцами. Освобождают план, шет, прилагаемый к набору для определения IgE, от упаковки и маркируют, В кажду лунку 1 ряда планшета по вертикали вносят по 0,2 мл раствора N. 1 (прилагается к набору для определения IgE) в качестве отрицательного контроля. В лунки

А и В второго и третьего ряда вносят по 0,2 мл стандарта IgE (прилагается к набору) с

1803873 содержанием 100 кЕ/л положительный контроль). Затем в лунки В, С, D и т,д, этих рядов вносят по 0,2 мл раствора !ч 1, Содержимое лунок В тщательно перемешивают с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость. После перемешивания содержимое лунок В второго и третьего ряда в количестве 0,2 мл последовательно переносят в лунки С, из лунок С вЂ” в лунки 0 и т.д. и т.д., каждый раз аналогично перемешивая и осуществляя таким образом двухкратное разведение стандарта Ig E от 100 кЕ/Л до концентрации 0,8 кЕ/л. из послед-. них лунок лишние 0,2 мл содержимого отбрасывают. Во все другие лунки вносят по

0,2 мл исследуемых сывороток (проба А разведения 1:10) в дубликатах. Планшет плотно закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час для образования комплекса антиген-антитело.

3. Отмывка планшета, Планшет вынимают из термостата, жидкость из лунок удаляют отсасыванием с помощью пипетки

Пастера и водоструйного насоса. Затем каждую лунку доверху заливают раствором

N 1 (прилагается к набору для определения

IgE (на 2-3 мин., жидкость вновь удаляют, Всю процедуру промывания повторяют не менее 3 раз. По окончании отмывки планшет кладут на фильтровальную бумагу вверх дном для осушения, 4, Инкубация с коньюгатом. В каждую лунку планшета вносят по 0,2 мл раствора конъюгата N. 3 (прилагается к набору для определения IgE), планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 37 С на 1 час.

5, Отмывку планшета проводят в пункте

3, повторив процедуру не мене 5 раз.

6. Приготовление субстратной смеси и инкубация -планшетов, Субстратную смесь готовят ех tempore. На 3 планшета к 60 мл раствора ¹ 5 добавить 0,06 мл раствора N

6 (реактивы для растворов N. 5 и N. 6 прила гаются к набору для определения !оЕ) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. В каждую лунку отмытых планшетов вносят по 0,2 мл свежеприготовлен. ной с убстратной смеси. Инкубируют в течение 20 — 30 мин„в зависимости от интенсивности окрашивания, при комнатной температуре в защищенном от света месте. В лунках планшета, где прошла реакция, появляется желток окрашивание разной интенсивности. Лунки первого контрольного ряда должны оставаться бесцветными. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,05 мл 50$, раствора серной кислоты, предварительно убедившись в том, что показания оптической плотности стандарта Ig Е в 100 кЕ/л находятся в пределах 0,5-1,0.

7. Учет результатов. Фотометрическая оценка. Измерение поглощения света окрашенными растворами проводят на фотометре Titertek Mult!skan MC при длине волны

492 нм, установив режим прибора на автоматический вычет показаний оптической плотности контрольного 1 ряда планшета из

10 показаний оптической плотности исследуемых образцов, Анализ считывается действительным если: — ни один из показателей отрицательного контроля не превышает оптическую плотность 0,1; — показатели максимального положительного контроля (стандарт 1оЕ в 100 кЕ/л превышает оптическую плотность в 1,0, Для каждого разведения стандарта lgE

20 определяют среднюю величину показателя оптической плотности, На графике, построенном на маштабно-координатной бумаге марки ПЛН (прилагается к набору для определения IgE) по оси абсцисс откладывают значения стандартов!gE, а по оси ординат

- показатели оптической плотности. На основании средних показателей оптической плотности, определенных для каждого стандарта, строят калибровочную кривую.

30 По калибровочной кривой на основании среднего показателя оптической плотности каждого образца вычисляют концентрацию

lgE в пробе А (свежая сыворотка больного, разведенная 1:10) с учетом разведения. Пол35 ученный результат сравнивают с возрастными нормами!9Е/М + 1G). Если полученный результат превышает возрастную норму

igE, на этом исследование прекращают, а если уровнеь Ig E в исследуемой сыворотке

40 находится в пределах возрастной нормы, проводят 2 этап исследования. 2 этап исследования — измерение соержания IgE в свежей сыворотке (проба B) и смеси свежей и прогретой сыворотки (проба В) и смеси свежей и прогретой сыворотки (проба В + проба С). Размораживают пробы В и С, В отдельной пробирке готовят смесь свежей и прогретой сыворотки, для чего из пробы В отбирают 0,05 мл сыворотки из из пробы С отбирают 0,05 мл сыворотки, перемешивают их и доливают 0,4 мл раствора М 1 (прилагается к набору для определения Ig E) с тем, чтобы конечное разведение свежей сыворотки составляло 1:10. К оставшимся 0,05 мл свежей сыворотки в пробе В и к 0,05 мл сыворотки в пробе С добивают по 0.45 мл раствора М 1 (конечное разведение обеих сывороток 1:10), Измеряют содержание IgE в пробах В, С и В+С так же, как на 1 этапе исследования, т,е. повторяют пункты 1-7

1803873 первого этапа, B пробе С содержание IgE должно равняться нулю, Определяют процент связывания Ig E прогретой сывороткой по формуле; х 100%

100— где  — содержание fgE в свежей сыворотке (проба В), В + С вЂ” содержание!9Е в смеси свежей и прогретой сыворотки (проба

В+проба С), Аллергию диагностируют, если содержание IgE в смеси свежей и прогретой сыворотки по сравнению со свежей сывороткой снижается менее чем íà 10%, не изменяется или повышается.

С использование предлагаемого способа было обследовано 139 детей с различными аллергическими заболеваниями (бронхиальная астма. астматический бронхит, аллергический ларинготрахеит, поллиноз, экзема, нейродирмит, крапивница), у кОторых аллергия подтверждена кожными (скарификационными) и провокационными тестами с различными аллергенами (домашняя пыль, пыльца растений, эпидермальные и пищевые аллергены). Эти же больные были обследованы также с использованием способа-прототипа. Результаты сравнения точности предлагаемого способа и способапрототипа представлены в таблице.

Из данных-таблицы видно, что использование заявленного способа позволяет повь!сить точность диагностики на 40% по сравнению со способом прототипом.

Пример 1. Больная Таня Ш., 1 г 9 мес., поступила для обследования в детскую больницу N 1 г, Ленинграда 7.01.89 r. c диагнозом "рецидивирующий обструктивный бронхит", Из анамнеза известно, что девочка больна с декабря 1987 г., когда на форе острого респираторно заболевания появилась экспираторная одышка, сухой, навязчивый кашель. Лечилась антибиотиками, отхаркивающими средствами, но одышка, кафель, сухие хрипы в легких на фоне нормальной или субфебриэльной температуры рецидивировали каждые 1-2 месяца.

8.01,89 г. взята кровь для определения содержания IgE, Сыворотку крови больной распределяли на 3 пробы: проба А — 0,05 мл сыворотки крови, проба  — 0,1 мл сыворотки, проба C — 0,1 мл сыворотки пробу С прогрели при 56 С в течение 4 часов, затем все три пробы заморозили и хранили до момента исследования при -20 С в морозильной камере. Исследование IgE проведено 10.01.89 г, 1 этап исследования — измеряли уровень IgE e пробе А следующим образом. второго и третьего ряда в количестве 0,2 мл

25 последовательно перенесли в лунки С, из . лунок С вЂ” в лунки D и т.д., каждый рэз ана30

40

50

5

1. Пробу А, содержащую 0,5 мл свежей сыворотки крови больной разморозили и развели раствором М 1(прилагается к набору для определения !9Е Ставропольского

НИИ вакцин и сывороток) 1: 10, т.е. к 0,05 мл исследуемой сыворотки прибавили 0,45 мл раствора № .1.

2. Инкубация со стандартом IgE и исследуемым образцом. Освободили планшет, прилагаемый к набору для определения Ig E, от упаковки и примаркировали, В каждую лунку 1 ряда планшета по вертикали внесли по 0,2 мл раствора М 1 (прилагается к набору для определения IgE) в качестве отрицательного контроля, В лунки А и В второго и третьего ряда внесли по 0,2 мл стандарта

IgE (прилагается к набору) с содержанием

100 кЕ/л (положительный контроль). Затем в лунки В, С, 0 и т,д. этих рядов внесли по

0,2 мл раствора ¹ 1. Содержимое лунок В тщательно перемешали с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость.

После пе ремешива ния содержимое лунок В логично перемешивая и осуществляя таким образом, двухкратное разведение стандарта IgE от 100 кЕ/л до концентрации 0 8 кЕ/л. Из.последних лунок лишние 0,2 мл содержимого отбрасывают. В две другие лунки внесли по 0,2 исследуемой сыворотки (проба А, разведенная 1:10). Планшет плотно закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37 С на 1 час для образования комлекс-саантиген-антитело. . 3. Отмывка планшета. Планшет забрали из термостата, жидкость из лунок удалила отсасыванием с помощью пипетки Пастера и водоструйного насоса. Затем каждую лунку доверху залили раствором N. 1 (прилагается к набору для определения IgE) на 2 — 3 мин, жидкость вновь удалили. Всю процедуру промывания повторили 3 раза, По окончании отмывки планшет кладут на фильтровальную бумагу вверх дном для осушения, 4, Инкубация с коньюгатом. В каждую лунку планшета внесли по 0,2 мл раствора коньюгата № 3 (прилагается к набору для определения lgE), планшеты закрыли крыш- . кой и поместили в термостат при 3? С на 1 час, 5. Отмывку планшета проводили, как описано в пункте 3, повторив процедуру 5 раз, 6. Приготовление субстратной смеси и инкубация планшетов. Субстратную смесь готовили ex tempore. к 60 мл раствора N 5 добавили 0,06 мл расто ра N 6 (реактивы для

1803873

20 х 100 % .

100

35

45

55 растворов М 5 и М 6 прилагаются к набору для определения IgE) и тщательно перемешали стеклянной палочкой. В каждую лунку отмытых планшетов внесли по 0,2 мл свежеприготовленной субстратной смеси. Инкубировали в течение 20 мин, при комнатной температуре в защищенном от света месте, В лунках планшета, где прошла реакция, гюявилось желтое окрашивание разной ин, тенсивности, Лунки первого контрольного ряда остались бесцветными. Реакцию остановили добавлением в каждую лунку 0,05 мл

50 раствора серной кислоты, предварительно убедившись в том, что показания оптической плотности стандарта fgE в 100 кЕ/л находятся в пределах 0,5-1,0.

7. Учет результатов. Фотометрическая оценка. Измерение поглощения света окрашенными растворами проводили на фотометре Titertek Multiscan МС при длине волны 492 нм, установив режим прибора на автоматический вычет . показаний оптической плотности контрольного первого ряда планшета из показаний оптической плотности исследуемых образцов. Анализ считался действительным, т.к. ни один иэ показателей отрицательного контроля не превышал оптическую плотность 0,1, а показатели максимального положитЕльного контроля (стандарт IgE в 100 кЕ/л) превышал оптиче- 30 скую плотность в.1,0.

Построение калибровочной крИвой. Для каждого разведения стандарта IgE определяли. среднюю величину показателя оптической плотности. На графике, построенном на масштабно-координатной бумаге марки

ПЛН по оси абсцисс откладывали значения стандартов IgE, а по оси ординат — показатели оптической плотности. На основаниИ средних показателей оптической плотности, определенных для каждого стандарта, построили калибровочную кривую, По калибровочной кривой на основании среднего показателя оптической плотности образца . А сыворотки, поставленного в дубле, вычислили концентрацию IgE в пробе А с учетом разведения 1. 10, Концентрация IgE в свежей сыворотке крови больной Тани Ш. 1 года 9 месяцев составила 16 кЕ/л. Возрастиая норма Ig E в этом возрасте составляет 23 к Е/л (MIG), т.е. содержание Ig E в сыворотке крови данной больной находится в пределах возрастной нормы и по прототипу такая больная ие входит в группу больных аллергическими заболеваниями. Поскольку уровень IgE в сыворотке данной больной находился в пределах возрастной нормы был проведен второй этап исследования— измерение содержания IgE в свежей сыворотке той же больной (проба В) и в смеси свежей о прогретой сыворотки (проба В + проба С). Разморозили пробы В и С. В отдельной пробирке приготовили смесь свежей и прогретой сыворотки, для чего из пробы В отбирали 0,05 мл сыворотки и иэ пробы С отбирали 0,05 мл сыворотки перемешивали их и доливали 0,4 мл раствора N

1 (прилагается к набору для определения

IgE) с тем, чтобы конечное разведение свежей сыворотки составило 1;10, К оставшимся 0,05 мл свежей сыворотки в пробе В и К

0,05 мл прогретой сыворотки в пробе С доливали. по 0,45 мл раствора N 1 (конечное разведение обеих сывороток 1:10). Измеряли содержание IgE в пробах В, С, В+С так же, как на В пробе С содержание Ig E равнялось нулю, в пробе В было равным 16 кЕ/л, в пробе В+С вЂ” 15 кЕ/л. Определили процент связывания IgE прогретой сывороткой по формуле:

16 — 15 что было равно 100 16 х 100% =

6, т.е. прогретой сывороткой связывалось только 67; IgE, содержащегося в свежей сыворотке. По данным заявленного способа данная большая входила в группу больных аллергическими заболеваниями, что было впоследствии подтвреждено положительными скарификационными тестами с аллергенами домашней пыли) домашняя пыль серии 268+++, домашняя пыль серии

216+++) и положительным эффектом от проведенного курса специфической игипосенсибилизации (при наблюдении в течение года после проведенного курса гипосеисибилиэации у девочки зарегистрировано только два непродолжительных эпизода бронхиальной обструкции — в течение 1-2 дней, которых легко снималась приемом водной микструры с эуфиллином).

История больной Тани Ш, М 314.

Пример 2, Больной Филипп M„13 лет, поступил для обследования в аллергологическое отделение детской больницы М 1, 3,04.89 г. (История болезни ¹ 4316) для обследования по поводу рецидивирующей крапивницы. Болен с 3 лет, когда впервые после перегрева на солнце появилась генерализованная крапивница, которая держалась в течение недели. В последующем проявления крапивницы отмечены при воздействии таких неспецифических факторов, как физическая нагрузка, переохлаждение, на фоне острых респираторных заболеваний. С помощью прототипа у больного измерено содержание общего IgE в сыворотке крови, которое было равным 68 кЕ/л (возра1803873

30

40

Сравнение точности заявляемого способа и способа-прототипа стная норма — до 85 кЕ/л), т.е. по данным прототипа больной не входил в группу больных с аллергическими заболеваниями. При оценке содержания fgE в смеси свежей и прогретой сыворотки и в свежей сыворотке по заявленному способу оказалось, что содержащиее Ig Е в свежей сыворотке и в смеси свежей и прогретой сыворотки было равным (68 кЕ/л), т.е. IgE не связывался прогретой сывороткой, что свидетельствовало в пользу аллергической природы заболевания у данного больного. При постановке кожных скарификационных проб выявлена сенсибилизация к облигатным пищевым аллергенам (белок куриного яйца +++, треска

+++, апельсин +++, клубника +++). Рекомен-. дована гипоаллергенная диета, которую больной строго соблюдал. При наблюдении в течение года рецидивов крапивницы не отмечено.

Пример 3. Арсентий С,,11 мес. (история болезни hL 8063),поступил для обследоваНия в и лечения в детскую больницу N 1

26.06.89 r, с диагнозом рецидивирующий средний отит, Болен с 2 мес., когда после

nepleaopa на искусственное вскармливание ежемесячно стал болеть отитами. Антибактериальная терапия была не эффективной.

Заподозрен аллергический генеэ заболе-. вания. С помощью способа прототипа определен уровень сывороточного IgE, который был равен 11 кЕ/л (возрастная норма 13 кЕ/л), т.е. по данным способа-прототипа больной не страдал аллергическим заболеванием. С помощью предлагаемого способа определили содержание IgE в свежей сыворотКе и в смеси свежей и прогретой сыворотки, которое было равно соответственно

11 KE/ë и 13 кЕ/, те. в смеси свежей и прогретой сыворотки содержание IgE было выше, чем в свежей сыворотке и больной мог врыть отнесен к аллергологическим больным, Поставлены кожные пробы с аллергенами, которые оказались положительными с аллергенами коровьего молока +++ и с аллергеном белка куриного яйца++, Перевод больного на безмолочную гипоаллергенную диету привел к стиханию симптомов отита.

Под контролем отоларинголога была проведена провокационная проба с коровьим молоком, которая привела к возобновлению симпотов отита. После выписки из стацио10 нара больной строго соблюдал безмолоч. ную диету, при наблюдении в течение 14 месяцев рецидивов отита не отмечено.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики аллергии на 40 по сравнению со способом-прототипом за счет воэможности выявления специфических для аллергии особенностей антигенной структуры молекулы IgE и наличия в сыворотке крови специфических для аллергии ингибирующих факторов, Способ может быть использован при скриннинговых массовых обследованиях для отбора деталей, подлежащих аллергологическому обследованию, а также при сложностях дифференциальной диагностики аллергических и неаллергических заболеваний.

Формула изобретения

Способ диагностики аллергии путем onределения содержания иммуноглобулина Е в свежей сыворотке крови больного, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа при обследовании детей, дополнительно лицам с нормальными показателями иммуноглобулина определяют содержащие иммуноглобулина Е в смеси свежей и прогретой при температуре 56 С в течение 4-х часов сывороток, взятых в соотношении 1:1 и при снижении его количества менее, чем на 10 или отсутствии изменений, или повышении по сравнению с показателями свежей сыворотки диагностируют аллергию.