Способ определения антигепариновой активности препарата протаминов

Способ определения антигепариновой активности препарата протаминов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в области медицинской биохимии. Сущность изобретения: водный раствор протаминов центрифугируют, отбирают аликвоту и вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы от 0,5+1,0 мл/мин, промывают колонку элюентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1+0,5%, при 25-45°С и по формуле определяют антигепариновую активность. Способ позволяет определить вклад каждого компонента протамина в общую активность препарата , а также ускорить процесс определения активности препарата.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4897151/14 (22) 28.09,90 (46) 23.03.93. Бюл, М 11 (71) 2-й Московский медицинский институт им. H.È.Ïèðoãîâà (72) Л.В,Григорова, В.К.Рыбин, Н,B.Màêà ров, М,Я,Розкин и В.С,Ефимов (56) J,Biochem, 1941, ч 35, N. 7, р. 7765-82. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕПАРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА

Г1РОТАМИНОВ

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимическим методам определения биологической активности протамИнов, которые используются для нейтрализации гепарина после проведения оПераций на сердце.

Цель изобретения — ускорение способа определения антигепариновой активности протаминов и определение вклада каждого компонента протамина в общую активность препарата.

Поставленная цель достигается тем, что водный раствор протаминов центрифугиру-. ют, отбирают аликвоту и вводят в хроматогрэф при скорости подвижной фазы 0,5-1.0 мл/мин, промывают колонку элюентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации 0,1 — 0,5 при 25-45 С и опРеделяют антигепариновую активность прдтэминов по формуле:

A 1/а(A В+С-D+Е+F), где А = аСа, В-bCb, D=dCa, Е=еСь; F=4,9;

C> — концентрация компонента А, -.мг/мл;

„„. И „, l 803875 А1 (57) Использование; в области медицинской биохимии. Сущность изобретения: водный раствор протаминов центрифугируют, отбирают аликвоту и вводят в хроматограф при скорости подвижной фазы от 0,5+1,0 мл/мин, промывают колонку элюентом, содержащим трифторуксусную кислоту в концентрации

0,1+0,5, при 25-45 С и по формуле определяют антигепариновую активность. Способ позволяет определить вклад каждого компонента протамина в общую активность препарата. а также ускорить процесс определения активности препарата.

Сь — концентрация компонента В, мг/мл;

Q — концентрация исследуемого препарата, мг, Из литературных данных известно, что на антигепариновую активность препараТоВ протаминов влияет содержание основного компонента в промышленных образцах. При изучении влияния содержания протамина в препарате нэ их антигепариновую активность мы учитывали тот факт, что протамины, в частности, осетровых рыб, состоят из 2-х компонентов, имеющих различную антигепариновую активность. Нами была исследована зависимость антигепариновой активности препаратов протаминов от содержания индивидуальных компонентов А и В с использованием методов математического моделирования и планирования эксперимента.

Для разделения протаминов была использована обращеннофазовая ВЭЖХ. В качестве элюентэ использовали воднозтанольный раствор, содержащий трифторуксусную кислоту, позволяющую уменьшить

1803875

4 ионное взаимодействие протаминов с сорбентом.

Для ускорения процесс хроматографирование проводили при оптимальном интервале температур 25 — 45ОС, при комнатной температуре (18 — 20 С) скорость хроматографирования понижалась, выше верхнего предела температуры происходила деструкция белка и появлялись дополнительные пики.

В указанном интервале изменения скорости подвижной фазы происходит достаточно быстрое установление равновесия в процессе массообмена между сорбентом и поглощаемым веществом, что также вносит значительный вклад в ускорение процесса определения концентрации компонентов А и В, Было показано, что вклад в общую активность препаратов протаминов А и В различен. Для нахождения зависимости антигепариновой активности препаратов протаминов OT содержания их индивидуальных компонентов А и В был использован полинам 11 степени, Были приготовлены модельные смеси из компонентов А и В, Эксперименты реализовали в соответствии с планом второго порядка (cM.òàáëèцу), содержащим 9 экспериментальных точек в области варьирования двух переменных. Границы варьирования концентраций компонентов А и В были выбраны на основе литературных данных, а также в соответствии с рекомендациями по определению антигепариновой активности протаминов. Была определена интигепариновая активность модельных смесей, В результате обработки эксперимен тальных данных, полученных при реализации плана второго порядка было найдено уравнение регрессии:

А = а Са+ Ь Сь+ d Сз + е Сь + F, 2 2 где а,Ь,с,d,e,F — коэффициенты в уравнении регресии, С и Сь — концентрации компонентов А и B.

Коэффициенты уравнения регрессии определяли по методу наименьших квадратов, их значимость оценивали по критерию

Стьюдента. Остальные коэффициенты в уравнении были статически незначимы и нами не учитывались, Была также построена модель процесса на основании полученногб уравнения, которая адекватно описывала экспериментальные данные. Адекватность модели проверяли по критерию Фишера, Расчетная формула для определения антигепариновой активности протаминов имеет следующий вид:

А = 1/Q (236Ca + 77Cb + 26,4CaCb

° 127,5Ca + 24Сь + 4,9), (1) Таким образом, сочетание двух методов — обращеннофазовая ВЭЖК и математическое моделирование позволяет достаточно быстро оценить концентрацию индивидуальных компонентов и, на основе полученных результатов, рассчитать антигепариновую активность препаратов протаминов.

Изобретение описывается следующими примерами определения антигепариновой

"0 активности протаминов.

Пример 1. Коммерческие препараты протаминов, выделенные из гонад осетровых рыб, в количестве 10 мг растворяли в 1 мл воды, центрифугировали в течение 10

"5 минут при 3000 об/мин, отбирали аликвоту

100 мкл и вводили в хроматограф. Использовали прибор модели Du Pont 8800 (США), применяя колонку Zorbax — ODSO. (0,46х25 см), Детектирование осуществляли при

20 длине волны 220 нм, Термостатировали колонку с помощью термостата с точностью

+0,2 С, температуру колонки установили на

25 С, скорость подвижной фазы установили

0,5 мл/мин, градиент концентрации этанола

0,65 в минуту, концентрация трифторуксусной кислоты — 0,1, Значение антиге.. париновй . активности протаминов вычисляли по формуле (1). По хроматограмме были найдены значения концентраци компонентов А = 0,30 мг/мл: В = 0,58 мгl мл.

А=1/Q(A+B+С-D+Å +Р);, АаСа=708 мг

В - ЬСь = 44,7

Ед .мл

С=сСь=45 мг

2 ()=дС.=11,3 Ед ™; мг

Е =еСь-=81 мг

45 Р=н=49 Ед;

Q — концентрация исследуемого препарата, 1 мг.

Экспериментально найденные значения; А = 121,7 Ед; время определения — 35

50 минут, ошибка определения — 57, Пример 2. Пробоподготовка аналогична примеру 1, параметры хроматографирования: скорость подвижной фазы— мл/мин, температура колонки — 45 С, концентрация трифторуксусной кислоты— . 0,5 Д. Экспериментально найденные значения;, концентрация компонента А — 0-32 мг/мл; компонента  — 0,5 мг/мл, время анализа 30 минут, Расчет значения антигепариновой активности;

1803875

А=1/а(А+ В+ С-D+ E+F), Ъ

Модельные смеси протаминов и их антигепариновая активность где А = аСа =, 75,5;

В = ЬСь = 40,0;

С = сСь =.4,05;

0 = dCa = 13,05;

Е =eCb =5,6;

F = r= 4,9; Q -1 мr.

Значение А = 117 ЕД/мг, ошибка определения 6%.

Пример 3. Препарат протамина из гонад осетровых рыб, в количестве 10 мг растворяли в 1 мл дист, воды, центрифугировали, отбирали аликвоту 1.00 мкл и вводили в хроматограф. Параметры хроматографирования: скорость подвижной фазы — 0,7 мл/мин, температура колонки — 35 С, градиент концентрации этанола

0,65 в мин, концентрация трифторуксусной кислоты — 0,25 . Экспериментально найденные значения: концентрация компонента А = 0,28 мг/мл; концентрация компонента В = 0,60 мг/мл; время анализа 15 минут, Значение активности препарата А = . 1/9 (А + В + С вЂ” 0 + Е + F), где: А = аСа - 66,08;

B- ЬСь =46,2;

С =сСь =4,4;

0 = dCa = 10,0

E-еСь =89;, F = г = 4,9.-Значение А = 120,5 ЕД/мг, ошибка определения 4,1 .

Наиболее оптимальные условия для определения антйгепарийовой активности протдминов являются: GKopocTb подвижной фазы — 0,7 мл/ мин, температура колонки—

35 С, концентрация ТФУ вЂ” 0,257, что соответствует времени анализа 15 мин, ошибки определения 4, значению А = 120,5, Таким образом, при осуществлении предлагаемого способа определения активности протаминов, не только сокращается время анализа, но и достоверно определя5 ются концентрации индивидуальных компонентов протаминов, позволяющие оценить вклад в общую активность препарата отдельных компонентов, что особенно важно для клинической практики.

Формула изобретения

Способ определения антигепариновой активности препарата протаминов, включающий его растворение, центрифугирование

15 раствора, взятие аликвоты с последующей регистрацией; отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и определения вклада каждого протамина в общую активность препарата, аликвоту препарат вводят

20 в хроматограф при скорости подвижной фазы 0,5-1,0 мл/мин, промывают колонку злюЕНтОМ, СОДЕРжаЩИМ тРИфтОРУкСУСНУЮ кислоту в концентрации 0,1 — 0,5, при 25—

45 С, определяют концентрацию препарата

25 и составляющих его протаминов, в общую активность препарата и индивидуальную активность протаминов рассчитывают по формуле

30 А = 1/Q (А+ В+ С вЂ” D + Е + F), гдеА=аСа . Вь Сь; С сCb; D=dCa E=еСь;

2.

F=4,9; а, Ь, с, d, е — коэффициенты;

Са — концентрация компонента А, 35 мгlмл;

Сь — концентрация компонента В, мг/мл;

Q — концентрация исследуемого препарат, мг.