6-аминонафтали-1-сульфамиды в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз

6-аминонафтали-1-сульфамиды в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз. Сущность изобретения: 6-МН2(нафталин)-502НР 2-1, где , R2 линейный или разветвленный (), СбНц, циклогексил, бензил, или Ri- R2 (Ci-C2), или Ri и R2 вместе с атомом азота образуют пиперидин, гексаметилен морфолин. Реагент 1: 6-фталимидонафталин-1- сульфамид. Реагент 2: гидразиногидрат в среде метанола при кипячении. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4920122/04 (22) 19.03.91 (46) 23.03.93. Бюл. N 11 (71) Институт биохимии Литовской АН (72) С.Ю.Бутенас, А.И.Палайма, З.А.Талайките, Р.С.Битаутайте и В.И.Дзянене (73) Институт биохимии Литовской АН (56) 6иоорганическая химия, т.15, М 4, 1989, с. 444 — 451. (54) 6-АМИНОНАФТАЛИН-1-СУЛЬФАМИДЫ В КАЧЕСТВЕ ДЕТЕКТИРУЕМЫХ

ГРУПП СУБСТРАТОВ ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДАЗ

Изобретение относится к химии аминонафталинсульфокислот, а именно, к новым замещенным 6-аминонафталин-1-сульфамидам общей формулы 1 NH

$02Й Й1Й г гдЕ R1= Н, R2= СНЗ, С2Н5, СЗН7, i-СЗНТ, С4Нд, i-C4Hg, t-C4Hg, СБН11, -Д, н,с-©, или

Й1=Е2=СН3, 2H5, — N R>Rg — — NQ

l 1

-М -N O в качестве детектирующих групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз.

Цель изобретения — изыскание в ряду аминонафталинсульфокислот новых соединений, позволяющие при использовании их в качестве детектируемых групп увеличить относительную интенсивность флуоресцен„„. Ж„„1804455 АЗ (я)5 С 07 С 311/38, G 01 N 33/50, С 07 D 295/28 (57) Использование: в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз, Сущность изобретения: 6-ИН2(нафталин)-S02NR1R2-1, где R1=H, R2 = линЕйный или разветвленный (С1 — С4), С5Н11, циклогексил, бензил, или R - = R2 (C< — C2), или R< и R2 вместе с атомом азота образуют пиперидин, гексаметилен морфолин. Реагент 1: 6-фталимидонафталин-1сульфамид. Реагент 2: гидразиногидрат в среде метанола при кипячении. 5 табл. ции и расширить ассортимент детектируемых групп субстратов, Цель достигается новыми 6-аминонафталин-1-сульфамидами общей формулы 1, синтез и физико-химические свойства которых иллюстрируется примерами.

Пример 1. 6-Фталимидонафталин-1пентилсульфамид.

13 мл (0,11 моль) пентиламина и 14 мл (0,1 моль) триэтиламина растворяют в 500 мл ацетона, добавляют в течение 10 мин

37,1 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-1сульфонилхлорида и перемешивают при

20 С 4 ч. Ацетон отгоняют при пониженном давлении, осадок заливают 1 л воды и через

20ч отсасывают продукт, Промывают водой, сушат, перекристаллизовывают из метанола и получают 40,9 г (выход 96 /) аналитически чистого продукта с т.пл. 168 — 172 С.

Найдено, (: С 65,60; Н 5,28; N 6,71; S

7,18.

С23 Н22Й2304.

Вычислено, 7;: С 65,39; Н 5,25; N 6,63; S

7,59, 1804455

Аналогично получают другие замещенные 6-фталимидонафталин-1- сульфамиды (табл. 1), Пример 2. 6-Аминонафталин-1-пентилсульфамид, 4,23 г(0,01 моль) 6-фталимидонафталин1-пентилсульфамида заливают 50 мл метанола, прикапывают 0,5 мл (0,01 моль) гидразингидрата и кипятят 4,5 ч. Метанол. отгоняют, остаток экстрагируют 2х20 мл кипящего хлороформа, экстракт упаривают и остаток перекристаллизовывают из метанола, Получают 1,86 г (выход 64 ) хроматографически и аналитически чистого продукта с т.пл. 87 — 90 С, Rf = 0,60 (алуфол; хлороформэтилацетат 1:1). ПМР-спектр (д, м.д., ДМСО): 0,63 (СНз), 1,05 (СН2), 2,71 (СН2).

Найдено, : С 61,72; Н 6,86; N 9,40; S

10,92.

C1sH2oN2S02.

Вычислено, : С 61,62; Н 6,89; N 9,58; $

10,96.

Аналогично получают другие замещенные 6-аминонафталин-1-сульфамиды. Их физико-химические характеристики приведены в табл. 2. Для доказательства преимущества новых соединений определены их относительные интенсивности флуоресценции.

Установление относительной интенсивности флуоресценции.

Спектры снимают на спектрофлуориметре "Hibachi" MPF-4" (Япония) в относительном режиме регистрации при чувствительности 3 в кювете толщиной слоя

1 см. Длина волны возбуждения Я зб = 357 нм, ширина щели возбуждения — 10 нм, эмиссии — 4 нм. Относительную интенсивность флуоресценции рассчитывают по формуле

5 с 10 где I — высота полосы эмиссии в мм; с — концентрация в моль/л;

А — соотношение максимальной и использованной чувствительности прибора.

Для 6-аминонафталин-1-пентилсульфамида (соединение 8 в табл. 3) получают:

86 - 100 820, 3,473 10 10 3

Измерение флуоресценции 6-аминонафталин-1-пентилсул ьфамида.

0,004875 г 6-аминонафталин-1-пентилсульфамида растворяют в 10 мл 95 -ного этилового спирта, 0,2 мл этого раствора разбавляют 10 мл фосфатного буфера с рН = 7,0 (0,067 М) и снимают спектр. Концентрация измеряемого раствора с = 3,473 10 моль/л, оптическая плотность при длине волны возбуждения Озим = 0,080, Полоса эмиссии имеет максимум 1фл. = 473 нм и высоту I =86 нм.

Аналогично измерены спектры флуоресценции остальных предложенных 6-аминозамещенных и известных 5-аминозамещенных нафталинсульфамидов и сопоставлены в табл. 3.

Как видно из табл.3, предложенные со"0 единения формулы! обладают более высокой относительной интенсивностью флуоресценции (410 — 860) по сравнению с аналогом. (9-26), что обеспечивает более высокое качество синтезированных на их ос"5 нове субстратов для флуоресцентного анализа.

Применение соединений формулы 1 в качестве детектируемых групп субстратов, используемых для флуоресцентного анали20 за пептидаз, М е т о д и к а 1. Синтез бромгидрата а

6-(N -бензилоксикарбонил) аргиниламинонафталин-1-метилсул ьфамида.

25 а

3,89 г(0,01 моль) бромгидрата (N -бензилоксикарбонил)аргинина и 2,36 г (0,01 моль) 6-аминонафталин-1-метилсульфамида (1) растворяют в 15 мл сухого пиридина, 30 добавляют 30 мл сухого толуола и отгоняют толуол при пониженном давлении. Реакционную смесь охлаждают до -20 С, добавляют раствор 2,68 г (0,013 моль) дициклогексилкарбодиимида в 6 мл сухого пиридина и выдерживают 30 мин при -20 С, 1 час при+4 С и 20 ч при.+20 С. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, отгоняют пиридин при пониженном давлении, а остаток растворяют в смеси хлоро40 форм-пропанол 3:1. Этот раствор промывают 15 мл воды, 15 мл насыщенного водного раствора NaCI, содержащего 1 мл конц, HCI, 15 мл 2 -ного водного раствора аммиака и 15 мл воды. Органический слой

45 отделяют, высушивают над безводным

Na2S04, растворитель отгоняют и остаток растирают с сухим толуолом. Продукт отфильтровывают, промывают сухим толуолом, сухим диэтиловым эфиром и

50 перекристаллизовывают из пропанола. Получают 4,93 г (выход 81 ) целевого продукта с т.пл, 126-132 С; / а /о = -13,3 (с 1;

СНзОН), R< = 0,68 (бутанол-уксусная кислота — вода 4:1:2).

Найдено, ; С 49,59; Н 5,32; N 13,63; $

4,63; Br 12,42.

С25Н31М6В ГЯО5.

Вычислено, : С 49,42; Н 5,14; N 13,83;

S 5,28; Br 13,15, 1804455

SOLON Q1R g

Таблица1

Физико-химические данные 6-фталимидонафталин-1-алкилсульфамидов

О (oOo W

$0 г

К л Выход, т. пл., C Брутто-формула

Данные элементного анализа, Ф

Найдено/Вычислено

1" 1

Н СИЗ 88 186-189 СюУИ ЛН280

8 48 г

8,75

7 78 г

7,64

62 37

-»г»»

G2„29

3 91 г

3,85

8 23

Л.

8,43

7 47 г

7,36

4 23

-2.—

4,24

Ьзгзз

63, 15

208-211

2о

СЛЛ 11<8 11280

С„B 2 62 SO

Н СН,- 81

Н СН, 91

i-C Н 72

Н СН2 69

8,09

8,1З

7г28

7,1Î

4 75 г

4,60

63 82 г

63,95

176-179

201-203

8 04

Л.

8,1З

7 05 г

7,10

4 55 г

4,60

64 15 г63,95

ЛЛИ 2л112Ь() 64 88 г

64,69

64 71 г

64,69

7 61 г

7,85

6 72 г

6,86

4 87 г

4,94

202-205

7 25

Л.

7,85

6г98

6,86

4 85 г

4,94

Н i-С„Н2 79 150-153

С НЛЛН ВС

64 47

-г64,69

7 42 г

7,85

703

6,86

5 08

»г»»«

4,94

С22И2 Н2НОЛ

213-216

Н t-C„Н, 81

Н С 81 96

7 18

7,59

6 66 г

Ь,ЬЗ

5 28

5,25

65 52 г65, 39

С,зН22Н280

168-172 (/ 94! сн 0

66 36 г

66, 34

7 28 г

7,38

6 63 г

Ь,45

5 25 г

5,10

206-209

С 24И22 Н280а

6 16

-г»

6,33

7 26

«г»7,25

67,71

67,86

4 09

«Л. »

4, 10

С22И М Н 2SO(243-247

П MP спектр (д, м.д., ДМ СО): 2,40 (СНз1. а

Остальные бромгидраты (N -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1сульфамидов синтезируют по аналогичной методике. Данные приведены в табл. 4.

M е т о д и к а 2. Взаимодействие брома гидрата 6-(N -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1-метилсульфамида с тромбином.

К 1,8 мл 1 мкМ раствора бромгидрата

6-(N -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1-метилсульфамида в 0,02 М трие-HCI буфере, рН = 7,4, 0,15 М NaCI, помещенного в кювету флуориметра и термостатированного при 250С, добавляют 200 мкл 1 мкМ раствора тромбина в том же буфере и наблюдают рост флуоресценции, фиксируя время, в течение которого в растворе образуется 0,1 мкМ концентрация 6аминонафталин-1-метилсульфамида. Для этого необходимо 38 мин.

Аналогично проводят определение дру- 25 гих пептидаз с использованием бромгидратов других аргинильных производных соединений формулы 1. Время гидролиза приведены в табл, 5.

Таким образом, соединения формулы 1 обладают в 40 раз более высокой интенсивностью флуоресценции по сравнению с аналогом и могут быть использованы в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного анализа, так как их аргинильные производные обладают различной скоростью гидролиза.

Формула изобретения

6-Аминонафталин-1-сульфамиды общей формулы NH где R1 — Н; Rz - СНз, СгН5, СзН7;

i — C3H7, C4Hg;

I caH9; t саня, С5н11, О,Н С-© или R1 — R2 — CH3, СгН5 или «tR2= "" )

- - 0; в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного определения пептидаз.

1804455

- Продслжение табл. 1

Т.пл., С

Данные элементного аналиэа, В

Найдено/Вычислено

Брутто-формула

Выход, ф

С Н М S

В 40

8,43

63 14

63,15

4 35

4,24

7 53

«А

7,36

90 151-155 Сган сь Игвое

Сну g

7 30

«и»7,85

7 03 а

6>86

64 83

64,69

5 О1 г.»4,94

С И И во

85 201-204

Сгнь Сгн,Ннь"г

6 61

6,66.

7 41 а

7,62

65 88 .--А-65,70

4 84

-ь.»4>79

-NQ

94 165-169 снгнгаигя"4

-NQ

66 20 ь.

66, 34

7 15

7,38

5 35

5,10

6471

6>45

89 168-172 С гь 192

62 46

«-г.-»

62>55

«а

7 48

7,59

4 43 а

4,29

6466

6,63

93 198-202 С Н Н

Таблица2

Характеристики 6-аминонафталин-1-сульфамидоа >то Оо "" оо2п> > Л2, 1

Кс Брутто-формула

Выход, Т. пл., С

flMP-спектр (d, .д.>Днсо>

Кт>нг с J н

S а

56 10

55,91

А

5 16

5,!2

50 . 145-148 О, 38

2,40(снг>

Си Н<гнаяса

57 72

57,58

5 72

5, 64

11 40 12 57 ь

11, 19 12,81

0,87(сне)

2,78(СНг) Н огнь- 83 109-113 О, 55 с н ияо

67(СНЗ) ° 1,23(CB)

2,68(СН ) 59 Зб

59,07

10 ВЗ. 11 70

10, 60 12, 13 б 27 б, 10

О, 61 Сьз Н<ь ИгЯОг

10 58 12 04

10,60 12, 13

0>85(СН>), 3 ° 21(СН) «А

58 88

59>07 б 09 а

6,10

78 140-144 О,51 С„Н„И,ЯО, Н г-Сант

0,77(сна), 1,14(CB ), 2,72(CB ) 11 37

11,52

Н С Нр 27 76-79

Ф 9

60 56

60, 41 б 45

6,52

10 20

10,06

0,48 Сл> Н >аN .Яог

Н i-Сь ну 79 48-50 б 62

-А

6,52

О ° 70(CBS)> 1»45(CB) °

2,48(СН ) 60 40

«А

60,41

11 02 а==

11,52

А

9 93

10,06

0,57 с>ьн>ьигяот н с-с„ну

60 58

60,41 б 60

6,52

11 21 а

11,52

10 Об

10,06 (снз) 67 198 200 0 53 С>4 Н>ь ИгЯСЦ

9 40

9,58

О, 63(сну) > 1, 05 (СНг), 2,71(СН >

6172 686

61, 62 6,89

10 92

10, 96

87 90 0>60 C»4 H N SO с„.н

63 15

63, 13

6 64

6,62

9 13

9,20

10>53

10,59

Н O 55 137-14Î н Н, С-© 59 148-15о

1>21(CH ), 2,86(СН) 0,69 С>ьнгьнеяог

5 19

5,16

9 21

10,26

65 52

65,36

8 82

8,97

3,97(СНг), 7,07(санг>

О» 67 С>тНы ИгSOé

57 56

57,58

81 92-94 О ° 63 С кнь>И ЯО

5 66

5,64

12 00

12,81

11 30

11,19

60 26

60,41

6 52

6,52

10 14

10,06

11 54

11,52

Сгну Сгнг 71 106-108 О, 74 С>ь Н»ь ИгЯОг ьнг б 37.

6,25

62 22

»»»»l

62,05

9 52

9,65

10 21

11,04

-NQ

1,30(CB ), 2,96(Снг) 77 139-143 0,78

»» >ь г

71 187 190 0>81

63 31

63,13 б 77

6,62

9 09

9,20

10 61

10,53

1»43(снг» 3»25(сна) 2,94(СН ) ° 3,50(СН ) -М/ 0

\ /

57 72

57,52

5 65

5,52

9 64

9,58

10 64

10,97

0,63

74 79-83

-Н/ 0

1 /

С та Нгь>14M4

С>ЬНьангяоь

Данные элементного анализа,2

Найдено/Вычислено

I.

11 96 13 11

11,85 13,57

2 ° 63 (СН3)

0»93(сня)> 3,22(СН ) 1804455

Продолжение табл,4 пл., С

Н, Rp

Брутто-форм

Данные элементного аналиэа

Найдено/Вычислено

ПНР-спектры (<Р, м. д., ДМСО), Н„Н в (в в ) в ) в, а

52 65

52,65

5 79 12 50 4 23

5,64 12,70 4,85

-NQ

1,30(CHg)

2, 99 (СН а) 11 23

12, 10

93 117-123

-12,8 0>71 Ст Н Н ВтЯоу

53 11

53, 33

602 12 57 402

5>82 12 ° 44 4>74

-13, 8 О, 7 3 Сто Н ут Нв Br SO<

1>45(CH )

3,го(сн,) Л вЂ” =

11 32

11,83

91 107-11 3

86 119-125

50 88

50, 68

544 1252 428

5,32 12,66 4,83

11 56

12,04

-12,3 0>69 Сэ Н Н ВтЯоа

2>95(СНэ) Таблица5

Я ремв (мин) 1 p>/-ного гидролиза соединений ФоРмУлы Т тромбином, фактром Ха, активированным протеином (АПС) плазмином, урокиназой и тканевым активатором плазминогена (ТАП) Янв- (м"-z) HB„

$02М

R1

Протеазы 94

АПС плазмин.

1 уро ки- ТАП наза. тромбин фактор Ха

120 2520

34 3040

3 с н н

30 и

3 7 с H„ с4н9

34

34

33

> С„Н9

45

34 -С Н9 с н„

45

Н

Н

510

46

2110 13240

3120 13410

200 1160

1080 2110

45 15

165 14

6540 13360

360 1760

90

6640 13170

3340 13300

81 3 1420

171 1710

90

-N 0 l

Н

Н2С снз з сгн5- сана

1Ж1Г 2

15 2510

50 2220

8 550

17 2470

45 1310

12 510

12 1040

12 270

660 1810

270 1540

220 3120

1260 4810

28 1460

200 3160

1280 14510

43 1930

2520 7240