Штамм бактерий аzоsрirilluм liроfеruм для производства удобрения под райграс пастбищный и кострец безостый

Штамм бактерий аzоsрirilluм liроfеruм для производства удобрения под райграс пастбищный и кострец безостый

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: производство микробиологических средств повышения урожая и увеличения содержания азота у небобовых растений. Сущность изобретения: штамм бактерий Azospirillum lipoferum выделен из корней райграса. Депонирован в коллекции ВНИИСХМ под Ns B-37. Штамм выращивают на среде Доберейнер в течение 72 ч. Активность азотфиксации в чистой культуре 9.11 ±0,41 мкг/мл среды/24 ч, а у известного 7,0±1,11, активность азотфиксации в ассоциации с растениями райграса 63 мкг/г корней/24 ч, костреца- 107,2 мкг/г корней/24 ч, а у известного соответственно 47,4 и 82,2 мкг/мл среды/24 ч. 6 табл. ттусе H3sm

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УВЛИК

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (21) 4916559/13 (22) 05.03.91 (46) 30,03.93. Б1ол. ¹ 12 (71) Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиолог ии (72) В.В.Волкогон, Н.Н.Мальцева, Л.И,Онищенко, В.Г.Миняйло, T.В Харченко, С.В.Лемешко и E.Н.Шевчук (73) Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1473345, кл, С 05 F 11/08, 1989.

Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожая и увеличения содержания азота у небобовых растений.

Цель изобретения — получения штамма бактерий, повышающего азотфиксирующую активность в корневой зоне райграса пастбищного и костреца безостого, урожай зеленой массы и содержание в ней азота.

Это достигается тем, что в качестве такого штамма предлагается штамм

AzospIrittum lipoferum 4014 B-37, выделенный из отмытых корней райграса пастбищного сорта "Аргона", выращенного в условиях вегетационного опыта на дерновоподзолистой почве.

„„50„„1806123 АЗ (s11s С 05 F 11/00, С 12 N 1/20 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ AZOS P IRILLUM

LIP0FERUM ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА УДОБРЕНИЯ ПОД РАЙГРАС ПАСТБИЩНЫЙ И

КОСТРЕЦ БЕЗОСТЫЙ (57) Использование: производство микробиологических средств повышения урожая и увеличения содержания азота у небобовых растений. Сущность изобретения; штамм бактерий Azosptrtltum Iipoferum выделен из корней райграса, Депонирован в коллекции

ВНИИСХМ под ¹ В-37, Штамм выращивают на среде Доберейнер в течение 72 ч.

Активность азотфиксации в чистой культуре

9,11 -0,41 мкг/ мл среды /24 ч, а у известного

7,0+-1,11, активность азотфиксации в ассоциации с растениями райграса 63 мкг/г корней/24 ч, костреца — 107,2 мкг/г корней/24 ч, а у известного соответственно 47,4 и 82,2 мкг/мл среды/24 ч. 6 табл, Штамм хранится в музее типовых культур Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии и имеет регистрационный номер В-37.

Полученный штамм Azosptrtl!um

lIpoferum 4014 B-37 характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

На полужидкой малатной среде Дсберейнер бактерия в молодом возрасте (1-2 сут) имеет вид крупных (1,0-1,5х4,0-5,0 мкм) слегка изогнутых активно подвижных палочек. При движении форма клеток S-образная. При старении культура утрачивает подвижность и характеризуется морфологическим разнообразием. Содержит включе1806123 ния поли-Р-оксимасляной кислоты. В возрасте 4-7 суток наблюдается агрегация клеток с последующими фрагментированием протоплазмы с образованием покоящихся форм, напоминающих цисты, На полужидкой мапатной среде Доберейнер образует типичную пленку серовато-белого цвета, находящуюся от ее поверхности на расстоянии около 1-2 мм.

На агаризованной среде Доберейнер с дрожжевым экстрактом колонии мелкие (12 мм в диаметре), сухие, складчатые или морщинистые, как правило целиком снимаютсл петлей. На картофельном агзре колонии значительно крупнее (в диаметре до 5 мм и более), пастовидные с перламутровым оттен ком.

Штамм 4014 растет в интервале температур 6-40 С, оптимальной для культивирования является температура 35ОС.

Оптимальное значение рН вЂ” 6,8-7,0.

Штамм нуждается в биотине. Способен использовать глюкозу в качестве единственного источника углеродйого питания и энергии (что лвЛлетсл видовым признаком).

Растет и фиксирует азот в безазотных попужидких средах с глюкозой, галактозой, яблочной, янтарной, молочной и фумаровой кислотами. На полужидкой мапатной среде

Доберейнер штамм фиксирует 27,33 мкг азота на 3 мл среды за 24 часа (9,11 мкг азота на 1 мл среды). В ассоциации с растениями активность азотфиксации значительно превышает активность контрольного варианта. Например: в ассоциации с корнями райграса азотфиксирующая активность штамма составляет 63 мкг К/г корней/сутки; в контроле (без инокупяции) — 31,6 мкг M/r корней/сутки, В ассоциации с корнями костреца безостого активность азотфиксации достигает 107,2 мкг азота на 1 г корней/сутки, В KOHTpoëå {на корнях небактеризованных растений) — активность азотфиксации равнялась 53,8 мкг азота/1 г корней за сутки, Штамм не использует в качестве единственного источника углерода сахарозу, мальтозу. рамнозу, раффинозу, сорбит, дульцит, крахмал. Микроаэрофил при выращивании в безазотной среде, аэроб при выращивании на средах, снабженных связанным азотом.

На агаризованной среде Доберейнер штамм образует розовый пигмент, Пигмент не растворим в воде и не диффундирует в среду.

Клетки грамотрицательные, подвижные, монотрихи на полужидкой среде Доберейнер. Использует аммонийную форму азота, нитраты. Растет на МПА и МПБ, Име-. ет положительный тест Хью-Лейфсона; в анаэробных условиях слабое кислотообразование, газообразные продукты не образует, Катапазо- и оксидазо — положителен,.

Экзопописахариды не синтезирует. Спор не образует.

Маркерные призйаки не обнаружены.

Штамм А.lipoferum 4014 ВНИИСХМ В"0 37 растет на средах следующего состава:

Среда Доберейнер (г/л): . яблочная кислота — 3,6

KHzPO4 — 0,4

К2НРО4 0,1

Mg3O4 7HzO — 0,2

MaCl — 0,1

CaClz 6HzO — 0,02

FeCl3 — 0,01

Naz MoO4 — 0,002

Дрожжевой экстракт — 1,00

Бромтимоловый синий (0,5 спир1овой раствор) —, 5,0 (мл)

Агар — 3,0. рН вЂ”. 6,8-7,0

Картофельная среда,(r/ë):

Картофель — 200

Яблочная кислота — 25

КОН вЂ” 2,0

Сахароза — 2,5

30 Агар — 20,0 рН вЂ” 6,5

Штамм 4014 В-37 хранят и периодически пересевают (1 раз в 2 месяца) на картофельном агаре и среде Доберейнер.

Температура хранения — 4-6 С (в холодильнике). При хранении штамма под слоем минерального масла в течение 12 меслцев изменение свойств штамма не наблюдали.

Штамм Azospirillum lipoferum 4014 В-37

40 идентифицирован по определителю Берги.

Изучение активности азотфиксации штамма Azospirillum iipoferum 4014 в сравнении с прототипом проводили в условиях лабораторных и вегетационных опытов.

Пример 1. Среду Доберейнер (по 3 мл в каждом сосуде) инокулировали клетками штаммов А,tlpoferum 4014 и С-1/25. После 72 часов инкубации в термостате определяли активность азотфиксации ацетиленовым методом на хроматографе

"Chrom-4", Повторность опыта трехкратная, Результаты определения представлены в табл.1, Активность азотфиксации чистой культуры штамма 4014 достоверно выше активности прототипа.

Пример 2. Семена райграса пастбищного сорта "Аргона" и костреца беэостого

1806123 сорта "Козаровичский" замачивали отдельно в бактериальных суспензиях штаммов

А.lipoferum 4014 и А.lipoferum С-1/25 в течение 16 часов, Плотность бакте9оиальных суспензий составила около 11 10 клеток в

1 мл, После замачивания семена высевали в сосуды с 0,5 кг дерново-подзолистой почвы.

В опыте был предусмотрен контроль — высев семян не инокулированных аэоспириллами. Сосуды со всходами райграса и костреца помещали в люминостат с освещением 20000 люкс в течение 16 часов ежедневно. Температуру в люминостате поддерживали на уровне 26 С +.1, Повторность опыта — пятикратная. В каждом сосуде оставляли по 3 растения. Через 1 месяц выращивания растений в сосудах определяли азотфиксацию ацетиленовым методом.

Результаты определений активности азотфиксации в ассоциации с растениями райграса и костреца приведены в таблице 1. Как следует из таблицы, под райграсом и кострецом в ассоциации с азоспириллами активность была существенно выше чем в контроле. При этом, штамм A.iipoferum 4014 обеспечивал достоверное превышение в азотфиксации по сравнению с прототипом.

Эффективность бактеризации райграса и костреца испытывали в вегетационных и полевых опытах на дерново-подзолистой почве опытного хозяйства, УНИИСХ микробиологии. Сорт райграса — "Аргона", сорт костреца — "Казаровичский", Для получения бактериальной суспензии штаммов готовили питательную среду

Доберейнер (без агара), состав которой и риведен выше, в колбы засевали штамм бактерий и выращивали на качалке при 180-200 об/мин и 28 С в течение 3 суток. Влияние предпосевной обработки семян райграса на урожай, содержание азота в нем и активность азотфиксации в корневой зоне растений испытывали также в производственном опыте в колхозе "Червоний прапор" Черниговской области (почва — дерново-подзолистая, сорт райграса — "Вея").

Пример 3, Семена райграса замачивали отдельно в бактериальных суспензиях штаммов А,lipoferum 4014 и А.lipoferum С1/25 в течение 16 часов. Плотность бактериальной суспензии составила 11 10 клеток в 1 мл. Для бактеризации испольэовали культуры 3-суточного возраста. После замачивания семена высевали в сосуды с 1,5 кг почвы, В каждом сосуде составляли по пять растений. В опыте был предусмотрен контроль — обработка семян стерильной водой.

Повторность опыта — четырехкратная, Результаты испытания эффективности инокуляции райграса штаммами азоспирилл в вегетационном опыте представлены в табл,2.

5 Из табл.2 видно, что инокуляция семян штаммом Azospirillum lipoferum 4014 достоверно повысила урожай зеленой массы растений как по сравнению с контролем, так и с прототипом. Бактеризация способствова10 ла также увеличению содержания азота в урожае на 12,3;4.

Пример 4. В условиях вегетационного опыта испытали эффективность бактеризации костреца беэостого предлагаемым

15 штаммом и прототипом. Условия постановки и проведения опыта аналогичны вышеприведенному примеру. Результаты опыта и ри веден ы в табл.3.

Как следует из табл.З, бактеризация

20 штаммом 4014 достоверно повышает урожайность костреца безостого, а также содержание азота в надземной массе.

Инокуляция семян костреца штаммом С1/25 — прототипом, — не способствует уве25 личению показателей, Пример 5. Полевой опыт. Семена райграса пастбищного пеоед посевом отдельно обрабатывали суспензиями клеток четырехсуточных культур А.lipoferum штам30 ма С-1/25 и штамма 4014. Плотность суспензий около 11,0 10 клеток в 1 мл. Семена

9 контрольного варианта обрабатывали водой. Во все делянки опыта вносили минеральные удобрения в дозе; К4оРвоКю.

35 Повторность опыта — четыоехкратная, Площадь каждой делянки 21 м .

Данные по эффективности бактеризации райграса в полевом опыте представлены в табл.4.

40 Как свидетельствуют полученные результаты, предпосевнгя инокуляция семян райграса штаммом А.lipoferum 4014 значительно и достоверно увеличивает урожайность зеленой массы райграса и

45 содержание азота в урожае. Кроме того, в корневой зоне райграса, инокулированного штаммом 4014, значительно возрастает активность азотфиксации. В опыте подтверждается эффективность штамма-прототипа, 50 однако она уступает эффективности заявляемого штамма, Пример 6. Полевой опыт, Семена костреца безостого инокулировали аналогично описанному в предыдущем примере.

55 Данные по эффективности бактеризации костреца безостого приведены в табл.5.

Как следует изтабл.5, инокугяция штаммом-прототипом костреца беэостого не приводит к достоверному увеличению уро1806123 жая травы. Бактеризация штаммом N. 4014 достоверно увеличивает урожай костреца и содержание азота в нем.

Активность азотфиксации также наибольшая в варианте со штаммом A,lipoferum 5

4014.

Пример 6, Производственный опыт.

Семена райграса пастбищного обрабатывали экспериментальными партиями торфяного препарата на основе штаммов 10

А.lipoferum С-1/25 и 4014 В-37. Препарат на основе предлагаемого штамма готовится следующим образом.

1-я стадия — получение посевного материала. 15

Маточной культурой, выращенной в колбах, засевают колбы или другие сосуды из расчета 4-5 к обьему питательной среды следующего состава (об. ), Меласса — 2 20

Кукурузный экстракт — 2

Вода — остальное рН вЂ” 7,0-7,2

В ы ращивание п осев ното мате риала проводят на круговой качалке с 180-200 25 об/мин при 30-32 С в течение 24-х. часов, Посевной материал используется для засева питательной среды вышеприведенного состава в бутылях или ферментерах при глубинном выращивании культуры. 30

2-я стадия — получение инокулюма, Посевную культуру вносят в среду в бу тылях или ферментерах в количестве 4-б от ее обьема. Культивирование проводят при 30-32 С на постоянно работающей ка- 35 чалке. Выращивание ведут в течение 48 часов.

3-я стадия — инокуляция торфа и термостатирование, Перед инокуляцией s стерильный торф вносят стерильный 50 -й 40 раствор декстрина из расчета 8/ от предполагаемого обьема инокулюма. В пакеты с торфом и декстрином вносят инокулюм (50 мл íà l40 г торфа). Конечная влажность препарата составляет 45-55 . Пакеты с инокулированным торфом выдерживают при температуре 35 С в течение 15 дней для увеличения титра бактериальных клеток.

Срок годности препарата — до 6 месяцев. В

1 r препарата, содержится 3-5 млрд. клеток бактерий. На одну гектарную норму семян необходимо 200 r препарата. Обработанные препаратом семена высевали зернотуковой сеялкой поделяночно. Площадь каждой делянки равнялась 2200 м . Учитывали урожай зеленой массы, Результаты производственного опыта (среднее за 2 года) приведены в табл,G.

Как свидетельствуют полученные данные, инокуляция была аффективной по всем трем.агрофонам, причем штамм 4014 В-37 во всех случаях обеспечивал более существенную прибавку, чем штамм-прототип. Обращает внимание то обстоятельство, что при инокуляции штаммом 4014 В-37 получена прибавка больше, чем при внесении 80 кг минерального азота на гектар. Эти данные говорят о том, что применение предлагаемого штамма для производства бактериального удобрения позволит значительно сократить дозы вносимых азотных удобрений.

Таким образом, предпосевная обработка семян райграса пастбищного и костреца безостого активным ассоциативным азотфиксатором Azospirillum iipoferum К 4014

ВНИИСХМ В-37 увеличивает активность азотфиксации в корневой зоне, повышает урожай зеленой массы трав, что позволяет сократить применение азотных минеральных удобрений под данные культуры.

Формула изобретения

Штамм бактерий Azospirillum lipoferum

ВНИИСХМ В-З? для производства удобре-, ния под райграс пастбищный и кострец безостый.

1806123

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

1806123

12 — среднее за вегетационный период

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Составитель В.Волкогон

Редактор А.Павловская Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор E,Ïàïï

Заказ 962 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5