Штамм бактерий micrococcus species - продуцент рестриктазы msp 20 i

Штамм бактерий micrococcus species - продуцент рестриктазы msp 20 i

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения: штамм бактерий Mlcrococcus species, хранящийся в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5463, получен в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции как контаминант при культивировании. При выращивании штамма на с вежей .питатель ной среде при 30°С в термостатированных качалках до достижения стационарной фазы роста получают урожай клеток, из которых выделяют фермент Msp 20 I, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5- TGGCCA-3 . Рестриктазу данной специфичности применяют в генетической инженерии для создания рекомбинантных молекул и для создания физического картирования молекул ДНК. 1 ил. w Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР}

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

В (21) 4925334/13 (22) 04.04.91 (46) 30,03.93. Бюл. N 12 (71) Научно-производственное объединение

"Вектор" (72) Ю.П,Зернов, О.А,Беличенко, H.È,Ðå÷êóнова, И.С.Андреева, В.E,Ðåïèí и С.Х;Дегтярев (73) Научно-производственное объединение

"Вектор" (56) Gelinas R,E., Myers P.À., Welss G.H., Roberts R.J,, Murray К.А. Speci fic

endonuclease from Brevlbacterlum aibldum.

J, Mol. Biol. 1977, v, 114, ¹ 3, р, 433 — 440.

Polllson С, Msc, à type !! restriction

endonucleases from Mlcrococcus species

which recognIzes 5 -TGGCCA-3, Nucl, Acids

Res, 1989, р. 5858, Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению штамма продуцента эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 TGGCCA-3 . Эндонуклеаза данной специфичности может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Целью изобретения является выявление штамма-продуцента, синтезирующего эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нук,5U „, 1806191 А3 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ MICROCOCCUS

SPECIES — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ

Msp 20! (57) Использование: биотехнология и генная инженерия. Сущность изобретения, штамм бактерий Mlcrococcus species, хранящийся в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5463, получен в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции как контаминант при культивировании. При выращивании штамма на свежей питательной среде при 30 С в термостатированных качалках до достижения стационарной фазы роста получают урожай клеток, из которых выделяют фермент

Msp 20 I, способный узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 TGGCCA-3, Рестриктазу данной специфичности применяют в генетической инженерии для создания рекомбинантных молекул и для создания физического картирования молекул ДН К. 1 ил, леотидов 5 -Т66ССА-3, с высоким выходом целевого фермента.

Это достигается получением штамма

Micrococcus species ВКПМ В 5463 — продуцента эндонуклеазы рестрикции Msp 20 I.

Новый штамм выделен как контаминант при культивировании в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции, используя экспресс-метод.

Штамм депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под номером

ВКПМ В-5463.

Фермент назван Мэр 20 I согласно общепринятойй номенклатуре.

1806191

Штамм Micrococcus species обладает следующими признаками, Культурально-морфологические признаки. Клетки сферические, размером 0,5—

0,7 мкм в диаметре, расположенные одиночно, в парах, тетрадах или неправильных скоплениях. Неподвижны, не образуют эндопор, Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре 30 С. Колс1нии на СПА опаковые, желтоватые, округлые, край ровный.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб, отрицателен по оксидаэе, амилазе, аргининдегидролазе и реакции с метиловым красным, не выделяет сероводород и индол, каталазоположителен, не утилизирует малонат, цитрат, мочевину, не восстанавливает нитраты, Содержание ГЦ пар в ДНК вЂ” 77 мол. ф, Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом или в 307, глицерине при -70 С.

Выход рестриктаэы Msp 20 3000 ед/г сырой биомассы, На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда ферментами Ва! и Msp 20 !, 1-ая дорожка — гидролиз Ва!

2-ая дорожка — совместный гидролиз

Bal I u Msp 20 I

3-ая дорожка — гидролиз Msp 20

Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента, Перед началом работы клетки штаммапродуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду, Чашки

Петри помещают в термостат на 30 С. После

10-12 часовой ин кубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из (г/л): бактотриптон—

10, дрожжевой экстракт — 5, хлористый натрий — 10 и помещают в термостатированную качалку.

Культивируют при температуре 30 С, при 200 об/мин до достижения стационарной фазы роста, Клетки осаждают центрифугированием при 4 С. Выделение осуществляют по методике Blckle, Pirotta, Imber (4). Выход фермента составляет 3000 ед/г сырой биомассы, Фермент хранится при -20 С в глицерине, Пример 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК (фиг, 1), Идентичность картин гидролиза на 1 — 3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последователь10 ность нуклеотидов 5 -Т66ССА-3, Выход фермента Мэр 20 определяют по электрофоретической картине гидролиза

ДНК фага лямбда. 3а единицу активности принимают минимальное количество фер15 мента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37 С, Выход фермента составляет 3000 ед/г, активность — 5000 ед/мл, Полученный штамм обладает следую20 щими преимуществами по сравнению с известным: имеет продуктивность в 3 раза большую, чем штамм-прототип, не требует длительного культивирова25 ния, Поскольку эндонуклеаза рестрикции

Msp 20 I имеет сайт узнавания идентичный сайту Msc !, а выход фермента более высок, то Мэр 20 l может заменить прототип во

30 всех генно-инженерных работах.

Иэошиэомеры фермента в СССР до сих пор не найдены. Поэтому производство эндонуклеазы рестрикции Msp 20 позволит полностью отказаться от закупок фермента

35 за рубежом.

Внедрение штамма планируется в НИКТИ биологически активных веществ НПО

"Вектор" в 1991-1992 годах.

В настоящее время рестриктаза Msp

40 20 !, полученная иэ Mlcrococcus species, используется для выполнения различных тем

НИР во ВНИИ молекулярной биологии и

НИКТИ биологически активных веществ

НПО "Вектор", в Новосибирском институте

45 биоорганической химии С0 АН СССР, Формула изобретения

Штамм бактерий Mlcrococcus species

ВКПМ B-5463 — продуцент рестриктазы Мзр

50 20 I.

1806191

Составитель Ю. Зернов

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор С. Лисина

Редактор

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 965 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5