Способ получения производных борсодержащих пептидов

Способ получения производных борсодержащих пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

,, Ы „„1807988 А3

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУбЛИК. (s»)s . С 07 К 5/08, 5/06, 5/08//А 61 К 37/02

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . »,84; I:: q. К: ПАТЕНТУ

2" . (2 1)4356026/04 . ". ;.: :: ..:: . : ":.:: NH (22) 03.06;88 . : ::- ". - "-. :;:: :; . (СН2)пМНСЙН2, m =3 4;у ОстатОк пинэкО, (31)059670 -: . :.: . ..:.—:.. нового или пинандиолбвого эфира; HNI,(32)05;06;87::::: —::; .; : .:-: ::: .:. -,..СвНб$0зН, HCI,. HBr „Z-0 или L-Phe, ... (33) US;: .: . -,::;: DPhe-Pro, D-Phe-Ala-1 y .. (46) 07;04.93.Бюль 13: .::::.:: Glu-Phe, Ala-йц, Giu-Qly, 6!у-Leu-Ala, руго :, (71) Е.И.Дюпон Де:Немур энд Компани (VS) :. Gfu-Ðhå, Val-×àl, 0;-Ча!-Кеи, Еуз-Pro. 1 е»-ТМ ; (72) Шарлс Ейдриен Кеттнер (VS) ui Ашокку- . мар Бйкаппа Шенви(Я} . . - (С»,Н И» », «л. C 07 С 103/52; опублик. 1982.:: .. .: Я и 1/Ч Cl, Br; y=.остаток пинаконового или

Qrun и др. Thriub. Res, 1985, 37, 145- йинандйолового эфира. Реагент:ll:;амино- .

"-, Европейский патент 0181267, -: - : . заны выше; Полученный продукт:формуль» кл. А 61 К 37/02, опублик 1986;...:: R1-Z-АНСИ((СН ) )И )Ву HW, где Й1, Z, у, Шредер 3. и Любке К; Пептиды, чА М::: W,Я и и имеют значейия, указаннЫв выи»е, ., - - »У1ир, 1967, с. 116.:: -;,, " -:" . :: обрабатывают азидом щелочногсиМталла.с. ф образованием..:соединении . Rj-БЧН- ЙЬ!Х БОРСОДЕРЖАЩИХ ПЁПТИДОЗ -: .. : веют в присутствии органичеСкой или ми»»еральной кислогы. предпочтительно дицинской химии в качестве соединений,:;.:.::: ",,: (CHQjiNHi

- ностью; широким спектром действия, рас- . подвергают взаимодействию с цийамйдом в. творы которых могут быть приготовлены без - низшем спирте при 50-150 С. Новые инги исйользования солюбилизатора; Сущность . биторы имеЮт значения К» < 0;7 мкм; облаизобретения: пройзводные борсодержащих дают-: :, r»pOTotBQSOCflàÿéòÅËü»lÜIÌ: и пептидов общей ф-лы R»-Z-NHCH(R2)-By х обезболивающим действием наряду с укахНЧЧ,-где R1-Í, Ac, Bz. Boc, BocLeu; Rz- занными-эффектами; 16.табл. малотоксичнь»х, обладающих более вь»сокой ингибирующей активностью и более, широким спектром действия,. растворы которых могут быть приготовлены без использования солюбилизатора (органического растворителя).

Поставленная цель достигается способом получения производных борсодержащих пептидов общей формулы (1) Изобретение относится к способу получения борсодержащих пептидов — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в биохимии в качестве ингибиторов трипсинподобных сериновых протеаз, например тромбин, калликреин плазмы и плазмин.

Цель изобретения — способ получения новых производных пептидной природы,—

1807988

R)-2 — NH — Н вЂ” BY HW, 12 где Ri — Н, As, Bz, Bos, Bos-Leu;

R2 — (CH2)nNH C(NH)NHz, где и = 3, 4;

Y — остаток пинаконового или пинандиолового эфира;

HW — CrHsS0>H, НС1, Нвг;

Z О или L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, А!а-1.ys, Pro-Phe, А!а-Phe, Glu-Phe, Ala-GIu, Glu-Gly, Gly-Leu-Ala, pyro-Glu-Phe, Val-Val, DVai- еи, Lys-Pro, I eu-Thr, заключающийся в том, что амин формулы (1!)

Н2М CHBY HW, (CHz) W где и = 3, 4;. W u W — Cl, B и;

Y — остаток пинаконового или пинандиопоаого эфира, вводят во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы (11!)

В1 — 2 — OH значения R1 и Z указаны выше и полученный продукт формулы (IY)

R1 Z-.NHCH — BY HW, (СН2) Щ1 значения В1, Z, Y; W, Чl и и указаны выше, обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединения формулы (У)

R -Z-NH — СН вЂ” BY HNI, (СН2) Из значения Й1, Z, Y, W и и указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кисло. ты, предпочтительно бензолсульфокислоты, с образованием соединения (У1)

R — Z-NH-CH — BY HW

1 (СН2)пй Н2 значения R, Z, Y, М/ и и указаны выше, последнее подвергают взаимодействию с цианамидом в низшем спирте при 50—

150 С.:

В описании изобретения используются следующие сокращения для аминокислотных остатков:

Ala = l=аланин

АГ9 = (=аргинин

Азп - 1=аспарэгин

Asp 1.-аспарагиновая кислота

Cys = -цистеин

6!и = 1.-глутамин

Gtu - 1=глутаминовая кислота

Gly = глицин

Н1в = l=гистидин !!е - L-иэолейцин

Leu = L-лейцин

Lys - 1=лизин

Мес = 1-метионин

Phe = L-фенилаланин

Pro = l=пролин

Ser = L-серин

Thr = L-треонин

Тгр = l=триптофан

45 пластинках KCI8F äëÿ оф-ТСХ фирмы

Whatman. Нейтральные соединения наблюдали в УФ-области и после экспонирования парами иода, Соединения, содержащие свободные аминогруппы. подкрашивали ни50

55 нгидрином; а соединения с гуанидиногруппами подкрашивали красителем Sakaguchi. Краситель Sakagvchi проявляет значительную специфичность к монозамещенным гуанидинам, например, которые содержатся в бораргининовых пептидах.

Пример 1,а. 1-амино-4-бром-бутилборонат пинандиол HCI.

NH2 — CH((CH2)aBr)B02-СюН я НС!

Туг = L-тирозин

Vai = 1-валин

Там, где прибавлен префикс D, упомянутые сокращения обозначают аминокислоту D-конфигурации. Там, где прибавлен префикс 0 или L, упомянутые сокращения обозначают то, что аминокислота может иметь или конфигурацию D, или конфигурацию 1, Используемый термин N-концевая защитная группа относится к различным аминоконцевым защитным группам,, используемым в синтезе пептидов; Примеры пригодных групп включают ацильную за15 щитную группу, например ацетил (Ac), бензоил (Bz), или алифатические уретановые защитные группы, например третбутоксикарбонил (Boc).

Приводимые далее в описании примеры

20 иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения. Все указанные точки плавления не откорректированы. Все части приведены в весовых частях, а температуры указаны в С. Химические сдвиги в результате спектроскопии протонного ядерного магнитного резанЬнсэ (ЯМР или ЯМР) .

1 . указаны в дельта-единицах, частях на млн., исходя из внутреннего тетраметилсиланового стандарта. Многочисленные сокращеЗ0 ния, используемые в указанных примерах, имеют следующие значения: TFA — трифторуксусная кислота; DMF-N,N-диметилформамид; МС вЂ” масс.-спектрометрия; TCX —: тонкослойная хроматография; оф-TCX — тон85. кослойная хроматография с обращенной фазой. Сложноэфирные защитные группы барных кислот имеют аббревиатуры: -СвН 12"= пинаконовая группа и -C>oH16 = пинандиоловая группа.

40 Все аминакислотные остатки представ. лены в L-конфигурации, если не оговорено особо.

TCX и оф-TCX осуществляют на пластинках из силикагеля 60 фирмы E.Merk u

1807988

4-бром-1-хлорбутилборонат пинандиол получают по методике, описанной

Maneson и др, В обычном эксперименте осуществляют гидроборирование аллилбромида (173 мл, 2 моль) бораном пирокате- 5 хина (240 мл, 2 моль) путем. прибавления борэна к аллилбромиду с последующим наrðåâàíèåì реакционной смеси в течение 4 ч до 100 С в атмосфере азота. Полученный продукт, пирокатехин 3-бромпропилборо- 10 ната (т.кип. 95 — 102 С, 0,25 мм), выделяют перегонкой с выходом 49 . Указанный пирокатехиновый эфир (124 г, 0,52 моль) трансэтерифицируют (+)эльфа-пинандиолом (88 г, 0,52 моль) при смешивании их в 15

50 мл тетрагидрофурана (THF), интенсивно перемешивая указанную смесь в течение

0,5 ч при 0 С, а затем 0,5 часа при комнатной температуре. Растворитель упаривают и прибавляют 250 мл гексана. Пирокатехин 20

: удаляют в виде кристаллического твердого вещества, Количественный выход получают путем последовательного разбавления гексаном до объема 500 и 1000 мл с выделением кристаллов при каждом разведении, При 25 упаривании растворителя получают продукт (147 г) в виде масла.

Вычислено, pl С51,85 Н7,38; Br26,54;

С1зН2202 В гВ:

Найдено, : С 52,85; Н 7,30, Br 26.58.: 30

4-бром-1-хлорбутилбороната пинандиол получают. гомологизацией соответствующего пропилбороната. Хлористый метилен (34,8 мл,.0,540 моль) растворяют в 500 мл

THF и затем медленно прибавляют к 1,54М н-бутиллития в гексэне (350 мл, 0,540 ммоль) 35 при-10Q C. Пинандйол 3-бромпропилборо: ната (148 r, 0,490 моль) растворяют в 500 мл

THF, охлаждают до точки замерзания ука. занного раствора и вводят в реакционную смесь. Хлорид цинка (33,5 г, 0,246 моль) рас- 40 творяют в 250 мл THF, охлаждают до 0 С и . прибавляют несколькими порциями к реакционной смеси. Реакционную смесь при одновременном перемешивании нагревают постепенно до комнатной температуры в 45 течение ночи, Затем растворитель упаривают, а полученный осадок растворяют в гексане и промывают водой. После просушивания над безводным сульфатом магния и фильтрования растворитель удаля- 50 ют с выходом целевого продукта (140 г), Пинандиол 1-амино-4-бромбутилбороната получают путем растворения гексэметилдисилизэна (28 r, 80 ммоль) в 30 мл THF, охлаждения полученного раствора до -78 С 55 и прибавления к нему 1,62N н-бутиллития в гексане (49,4 мл, 80 моль), Затем раствор медленно нагревают до комнатной температуры, повторно охлаждают до -78 С и прибавляют пинандиол 4-бром-1-хлорбутилбороната (28 г, 80 моль) в 20 мл THF, Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи, Растворитель удаляют упариванием, вводят сухой гексан (400 мл) и получают осадок, который выделяют фильтрованием в атмосфере азота, Фильтратохлаждаютдо-78 С идобавляют4н, HCI в диоксане (60 мл, 240 моль). Затем реакци- . онную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и при этой температуре перемешивают ее 2 ч. Полученный продукт (20 г) выделяют фильтрованием в виде твердого вещества. После просушивания в вакууме неочищенный продукт растворяют в хлороформе и нерастворившееся вещество выделяют фильтрованием. Фильтрат упаривают и осадок растворяют в этилацетэте. Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с выходом его 15,1 г (т.пл. 142-144,5 С, (а)э

+16,7+0,80, С = 1,0 в абсолютном метаноле.

Элементный анализ для

С14Нгвй02ВгС!В:

Вычислено, . С 45;87, Н 7,16, N 3,82, В

2,95.

Найдено, : С.45,76, Н 7,21, N 3,79, В

3,04.

Пример 1,б. (0,L)1-амино-4-бромбутилборонат пинакон HCI. (ОА)КНг-СН((СН2)зВг1В02-С6Н12. НЬ.

Пинакон 4-бром-1-хлорбутилборонатэ пол уча ют по методу, описан ному для получения cooTBGTGTBóþùáro пинандиола (пример 1,а), за исключением того, что вместо пинандиола используют. пинакон, пинакон

3-бром-пропилбороната (т.кип. 60-64 С, 0,35 мм) и 4-бром-1-хлорбутилбороната пинакон (т.кип. 110-112ОС, 0,20 мм) перегоняют.

Элементный анализ для

С1оН1э02 ВгС1 В:

Вычислено, : С 40,38, Н 6,45

Найдено, : С 40,70, Н 6,37.

Хлористоводородную соль пинакона 1амино-4-бромбутилбороната также получают по методике примера 1,а. Целевой продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гаксан с выходом его 52 .

Элементный анализ для

C1oH22NO2BrCtB:

Вычислено, : С 38,19, Н 7,05, N4,,45,,CI

11,27, Br 25,41.

Найдено, : С 38,28, Н 7,39, N 4,25, С!

11,68, Br 26,00.

Пример 1,в, Гидрохлорид 1-амино-4хлорбутилборонат хлористоводородная соль пинакона, 1807988 (0,L)NHz-СН((СН2)зС!)В02-С6Н12 HCI, Синтез дипептида BOC (D) Phe — Pro — ОН

Пирокатехин 3-хлорпропилборонат осуществляют вначале с получения дипеп(т.кип, 80 — 85 С, 0,30 мм) и пинакон 3-хлорп- тидного бензилового эфира, а затем удалеропилового эфира бороновой кислоты ния указанного сложного эфира (т.кип. 63 С, 0,20 мм) получают по методике 5 каталитическим гидрированием. Воспримера 1,а за исключением того, что вме- (D)Phe-OH (10,0 r, 37,7 ммоль) растворяют в . сто аллилбромида используют аллилхлорид, 50 мл THF и к полученному раствору прибава вместо пинандиола берут пинакон. ляют N-метилморфолин (4,14 мл, 37,7 о

Элементный анализ для CgН

Найдено, %: С 53,41, Н 8,15, CI 16,81. хлормуравьиной кислоты (4,90 мл, 37,7

Гомологиэацию также осуществляют по ммоль). Через 5 мин в реакционную смесь методике примера 1,а, а полученный про- вводят Н-Pro — OBZ1, HCI(9,11 г,37,7ммоль), дукт выделяют перегонкой (т.кип. 95 С,. растворенный в.50млхлороформаиохлаж0,25 мм) с 65% выходом. 15 денный до -20 С. Прибавляют триэтиламин

Элементный анализ для CgOzCI2B: (5,25 мл, 37,7 ммоль) и полученную смесь

Вычислено, %: С 47,47, Н 7,58, С! 28,02. перемешивают 1 ч при -20 С и 2 ч при комНайдено, %: С 47,17, Н 7,45; CI 27,75. натной температуре. Реакционную смесь

Хлористоводородную соль пинакона 1- фильтруют и фильтрат упаривают. Оеадок амино-4-хлорбутилового эфира бороновой 20 растворяют в этилацетате с последующим (борной) кислоты получают по методике, . промыванием 0,2н. HCI, 5%-ным водным аналогичной примеру 1,а. Целевой продукт . раствором бикарбоната натрия и насыщенвыкристаллизовываютиззтилацетата с пол- . ным водным раствором хлористого натрия. учением 8,8гпродукта(т.пл,132-135,5 С) vi Органический слой сушат над безводным

2,2 r продукта (т.пл. 145-147 С). Продукт с 25 сульфатом натрия, фильтруют и упаривают т.пл. 145-147 C используют для анализа.. с получением 15,2 r Boc — (D)Phe-Pro-OBZ1 в

Элементный анализ для C1QH22N02CIB: виде масла. Полученный бензиловый эфир

Вычислено,%; С44,47, Н8,23, N5,19, В - (15,2 г) растворяют в 100 мл метанола и

4,00. - " .: затем гидрируют при начальном давлении

Найдено, %; С 44,01, Н 8,23. N 4,77, В 30 40 фунтов/дюйм (2,812 кг/см ) в аппарате

3,80.. ..: .;:. - Парра в присутствии 0,5 г 10% палладиевой

Пример 1,г. (D,L)1-амино-5-бромпен- - . черни (Pd/С). Реакционный раствор фильт- . . тилового боронат эфира бороновой кислоты ".. руют через цели гтм и упаривают с выходом пинакон НС!.. ; .: -.:. :.: твердого вещества. Указанный твердый (О,! )ИН2-CH((CH2)4Br)802CpH12 HO.:35 продукт выделяют и промывают этилацета Пинакон 4-бромбутилового эфира боро- . том, а затем простым эфиром с получением новой кислоты получают по методу, описан- 10 г требуемого продукта (т.пл, 176,5ному для получения пинандиола . 177 С). 3-бромпропилового эфира борной кислоть! .. Элементный анализ для C>gHmNzOg, (пример 1,а); эа исключением того, что ал- 40 (%): лилбромид заменяют на 4-бром-1-бутен, а Вычислено: С 62,95, Н 7,24, N 7,73. пинандиол на пинакон, Продукт выделяют в Найдено: С 62,91, Н 7,15, N 7,53. виде масла (т.кип. 77 С, 0,3 мм), После го-: Boc(D)Phe-Pro NH-CH((CH@Br)B jpH

Вычислено, %, H; 310,47. ангидрид Вос — (D)Phe-Pro-OH получают

Найдено, %:Н: 310. при растворении указанной кислоты (4,94 r, Целевой продукт хлористоводородную :. 13,6 ммоль) в 30 мл THF с последующим соль пинакона 1-амино-5-бромпентилового 50 прибавлением N-метилморфолина (1,50 мл, эфира бороновой кислоты получают по ме- 13,6 ммоль). Затем реакционный раствор охтодике примера 1,а при выходе 35%. лаждают до -20 С и добавляют иаобутилоЭлементный анализ для вый эфир хлормуравьинойкислоты(1.77 мл, С11Н24МОгВгВС!; %: 13,6 ммоль). После перемешивания в течеВычислено: С 40,22, H 7,36, N 4,26, Ct 55 ние 5 мин при -20 С в реакционную смесь

10,79, Вг24,32, В 3,29. вводят амин, который получен в примере

Найдено; С 39,23. Н 7,18, N 4,04, Cl 1,а, NH2-CH((CH2)SBr)BO2 C10H16 HCI (5 г, 15,21, Br 25.66, В 3,75, 13,6 ммоль), растворенный в 10 мл охлажПример 2. Boc-(D)Phe-Pro — NH- денного хлоформа. Охлажденный тетрагидСН((СН2)з В г)В 02-С1оН ю. рофуран (10 мл) и триэтиламин (1,90 мл, 13.6

1807988 ммоль) прибавляют к реакционной смеси и перемешивают смесь в течение 1 ч при

-20 С и примерно 2 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют и оставшуюся жидкость в фильтрате упаривают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают

0,2н. HCI, 5%-ым водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, а растворитель упаривают с выходом 9 г продукта в виде масла. Указанный продукт растворяют в метаноле и хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см с LH-20.

Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают с получением 5,8 г твердого вещества. ТСХ в смеси метанол/хлороформ (1:9) показывает единичное пятно, Rr 0,70, Масс-спектроскопия (FAB) для

СззРз9Г1з06В Вг:

Вычислено: +Н: 674,30

Найдено: 674,30.

Il р и м е р 3. Вос — (D)Phe-Pro-NH—

СН((СН2)зйз)В 02 — C10H16.

Продукт примера 2. Вос — (D)Phe — Pro—

NH — СН((СН2)зВДВ02 — C1oH16 (4,4 г, . 6.54 ммоль) растворяют в 7 мл диметилформамида (ДМР) и аэид натрия (0,919 г, 14,1 ммоль) прибавляют к указанному раствору. Реакционную смесь нагревают при 100 С в течение

3 ч. Прибавляют этилацетат (100 мл) к реакционной смеси и затем промывают водой и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают. Получают 4,1 г твердого продукта. Указанный продукт хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см из

LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, оставшуюся жидкость упаривают с выходом 2,3 г названного азида. ТСХ в системе метанол:хлороформ (1 9) показывает единичное пятно, Rf

0;76.

Элементный анализ для СззН46К606В, (%), Вычислено: С 62,35, Н 7,63, N 13,33, В

1,70.

Найдено: С 63,63, Н 8,02, N 11,58. B 1.80.

Масс-спектроскопия (FAB) для

СззН4эй606В

Вычислено: Н: 637,39

Найдено: 637,49, Пример 4. Вос-(D)Phe — Pro — NH—

CH((CH2)3NH2)B02 — С1оН16 Бензолсульфокислота.

Азид примера 3 (8,80 r, 13,8 ммоль) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют нэ установке Парра при давлении 40 фун5

«бензолсульфокислота

В ос-(D)Phe-Pro — 6opoArg — С1оН16х

«бензолсул ьфокислотэ.

15 В oc — (0) P he-Pro — бороАгд — C1oH1Ф

«бензосульфокислоту, полученную в приме55

50 тов/дюйм (2,812 кг/смз) в присутсгвии

0,50 г 10% палладиевой черни и бензолсульфокислоты (2,19 г, 13,8 ммоль), Через чэс катализатор удаляют и после упаривания раствора получают 9,9 г требуемого продукта. оф-ТСХ в системе растворителей метанол:вода (85:15) показывает пятно в

УФ-области, Rf 0,91 и пятно. позитивное к нингидрину Rf 0 52.

Пример 5. Вос — (D)Phe — Pro-NHСН((СН2)з- N H — С(И Н) 1ч Н г) В 02- С1о Н16у ре 4 (4,6 г, 6,11 ммоль), нагревают с обратным холодильником при 100 С в 20 мл абсолютного этанола, содержащего цианамид (50 мг/мл), Ход реакции регулируют офТСХ в системе растворителей метанол: воды (85:15), где наблюдается исчезновение нингидринового пятна из исходного материала амина (Rf 0,54) и появление красителя

SakaguchI на полученном продукте (Rf 00,13). Указанный продукт можно обнару- . жить после нагревания с. обратным холодильником в течение 18 ч, причем его уровень постепенно повышается. Через 7 дней; когда амин нельзя обнаружить, реакционный раствор концентрируют до примерно 50 об.% пассивным упариванием.

Затем реакционный раствор фильтруют, сгущают и хроматографируют на 2,5 х 100 см колонке с LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и после упэривания получают 3,7 г требуемого продукта, Порцию продукта (2,3 г) кристаллизуют смесью этилацетат:гексан с выходом 0,89 г вещества, а остаток (1,2 г) получают порошкованием простым эфиром в виде твердого продукта.

Масс-спектроскопия (FAB) для

С34 Н 53 ч 6065 В;

Вычислено: Н: 653,42

Найдено, 653,38.

Элементный анализ для

C4oH5gN60gSB Н20, % .

Вычислено: С 57,95, Н 7,43, N 10,14, В

1,30

Найдено: С57,20, Н 7,14, N 10,94, В 1,01.

Пример 6. Н вЂ” (D)Phe-Pro — 6opoArg—

СюН16 2HCI, Продукт примера 5, Вос — (D)Phe-Pro— боро Arg-С1оН ы,бензолсульфокислота (1.17 г, 1,54 ммоль), подвергают взаимодействию с

5 мл 4н. хлористого водорода в диоксане в течение 15 мин при комнатной температуре.

Полученный продукт осаждают при добэв1807988 лении простого эфира, выделяют и промывают простым эфиром с просушиванием в вакууме. Затем продукт растворяют в 10 мл воды и наносят на анионно-обменную колонку 5 мл с Вио-RADAGI X8™ (СГ-форма, BI0-RADCo., Richmond, CA) с последующим промыванием колонки водой (примерно 30 мл). Элюент упаривают в вакууме, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом требуемого продукта (0,80 r).

Масс-спектроскопия (FAB) для

С29Н45М604В .

Вычислено: +Н: 553,37

Найдено: 553,40 и 538,40 (не идентифицирован).

Элементный анализ Н-(D)Phe — Pro — боpoArg-С1оН16 ° 1BSA. TFA:

Найдено; 553,4

Пример ы 7 и 8. Ас-(D)Phe-Pro — боpoArg-С1оН16 Н CI (пример 7)

Ас-(D)Phe — Pro — бороАг9 — ОН,HCI (пример 8).

Вос-(D)Phe Pro-бороАг9-С1оН16к хбензосульфокислота, продукт примера 5 (0,86 г, 1,13 ммоль) подвергают взаимодействию с безводной трифторуксусной кислотой (TFA) (примерно 5 мл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Избыток TFA удаляют упариванием, а полученный осадок порошкуют простым эфиром с выходом 0,76 продукта. Указанный продукт (0,70 r, 0,91 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл диоксана и 1 мл воды, Уксусный ангидрид (0,47 мл, 5 ммоль) и бикарбонат натрия (0,42 r, 5 ммоль) прибавляют к реак, ционному раствору, Затем полученную смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют этилацетат (50 мл) и воду {5 мл). Образовавшиеся фазы разделяют и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. После фильтрования и удаления растворителя упариванием получают 0,56 г полутвердого вещества.

Полученную пробу растворяют в 4 мл ледяной уксусной кислоты с последующим разбавлением раствора 16 мл воды. Затем сразу же наносят нэ колонку с 15 мл SP-сефадекса™ (Н -форма) и уравновешивают

20 -ым раствором уксусной кислоты. Колонку промывают 300 мл 20 -ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентраций от 100 мл 20%-ой уксусной кислоты до 100 мл 20 -ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н.хлористоводородной кислоты, Фракции, собранные в градиенте концентрации от 0,08 до 0,17н. HCI, содержат N-ацетиловый пептид(0.29 г) в виде смеси из свободной бароновой кислоты и сложного пинандиолового эфира.

Сложный эфир пинандиола и свободную бороновую кислоту разделяют хроматографией на 2,5 х 100 см колонке, содержащей

LH-20 в метаноле. Размер фракций составляет 8,2 мл. Пинандиоловый эфир (102 мг) элюируют в фракциях 41 — 43, в то время как свободную борную кислоту (131 мг) постепенно вымывают в фракциях 45 — 129.

Масс-спектроскопия (FAB) (пример 7):

Ас — (D)Phe — Pro — бороАг9 — С1оН6 для

С31Н47Й605В:

Вычислено+Н: 595,33

Найдено: 595,33

Масс-спектроскопия (FAB) (пример 8) 15 Ас — (D)Phe — Pro — 6opoArg — OH,HCI для

C21H33N605:

Вычислено+Н: 449,60 .

Найдено; 579,24 — 581,24.

Последние данные нельзя объяснить

Тем не менее данные ЯМР совпадают со структурой свободной бороновой кислоты, так как заданные полосы испускания для пинандиоловой группы, например как синглеты метильных групп при дельта 0,85 (ЗН).

1,30 (ЗН) и 1,36 (ЗН), не наблюдались, В качестве дополнительного доказательства

25 этой структуры образец продукта свободной бароновой кислоты переэтерифицируют с выходом материала примера 7. Аналитическую пробу (20 мг) обрабатывают двухкратным избытком пинандиола (14 мг) в 3 мл

30 метанола в течение 5 мин, Растворитель упаривают, а избыток пинандиола удаляют порошкованием простым эфиром указанного образца с выходом требуемого продукта(26 мг).

Масс-спектроскопия (FAB) (найдено:

595,38) и данные ЯМР совпадают со структурой, предполагаемой для этерифицированного продукта, и почти идентичны пинандиоловаму продукту примера 7.

Пример 9, Ас-Phe áoðîÀãgС1о Н16 Х С1.

По методике, описанной в примере 2, 40

TFA, который связывают с NH2—

СН((СН2)3Вг)В02-С1ОН16 HCI (продукт примера 1,а. 1 r, 2,73 ммоль), растворенного в

10 мл охлажденного THF с выходом 1,47 г белой пены. Указанный продукт перемешивают в течение ночи вместе с гексаном. Получают твердое вещество 1,01 г (т.пл.

106,5 — 109 С).

55 Элементный анализ для

C25H36N204BrB, %:

Вычислено: С 57, 81, Н 7.00, N 5,40, Br

15,40, В 2,08

Найдено: С 58,33, Н 7.33. N 4,76, Br

14,18, В 1,80. получают Ас — Phe — NH-CH((CH2)3Br)B02—

45 С1оН16. Затем получают смешанный ангидрид Ас-Phe ОН (0,565 г, 2,73 ммоль) в 10 мл

1807988

Масс-спектроскопия (FRB) для

C25H36N204B гв:

Вычислено +Н; 519,20

Найдено: 519,23.

Ас-P he — NH-СН((С Н2)зйз)В 02-С1о Н16 получают при обработке Ac-Phe — NH—

СН((СН2)зВг)В02 — С1оН16 (3,22 г, 6,20 ммоль) натрийазидом по методике, описанной в примере 3. Полученный продукт (3,03 г) хроматографируют на колонке с Н-20, Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и упаривают, Осадок порошкуют гексаном с выходом 2;21 г указанного азида.

Бензолсульфонат Ас — Phe — бороОгп—

C)oH16 получают из указанного азида Ас—

Phe-NH-СН((СН2)зйз)В02-С1оН16 (2,21 г, 4,59 ммоль) по методике примера 4 за исключением того, что гидрирование осуществляют при атмосферном давлении. После фильтрования и упаривания растворителя путем порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (2,22 r), Ас — Phe — бороАгц — CroH16x хбензолсульфонат получают путем обработ. ки соединения Ас-Phe — бороОг9 — С1оН16 бензолсульфокислота (2 г, 3,26 ммоль) 10 мл раствора цианамида (100 мг/мл) в этаноле, Реакцию гуанидирования осуществляют по методике примера 5 за исключением того, . что реакционное время составляет 3 дня, а реакционная смесь содержит смесь из исходного материала и полученного продукта.

Указанная смесь требует дополнительной . очистки, которую по всей вероятности можно не проводить, продлив продолжительность реакции. Реакционный раствор далее концентрируют и хроматографируют на колонке 2,5 х 100 см из LH-20 в метаноле. . - Ф.ракции, содержащие требуемый продукт, обнаруженные при помощи подкрашиваю. щего агента Sakaguchi, объединяют и упаривают с выходом 1,4 г продукта. Полученный продукт (1,2 г) растворяют в 6 мл уксусной кислоты, разбавляют 30 мл воды и получают раствор молочного цвета, Этот раствор наносят на колонку объемом 30 мл с SP-Сефадексом™ С-25 ("Н-форма), доведенную до равновесного состояния 20%-ым водным раствором уксусной кислоты. Далее колонку промывают 240 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентрации от 250 мл 20%-ой уксусной кислоты до 250 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н, соляной кислоты. Фракции, элюированные из колонки в интервале от 0,12 до 0,16 н. соляной кислоты, объединяют с выходом 0,42 r требуемого пептида в виде смеси свободной борной кислоты и сложного эфира пинандиола. Указанную

55 нагревают до комнатной температуры с последующим перемешиванием ее в течение ночи. Растворитель удаляют путем упаривания. Осадок растворяют в этилацетате и промывают последовательно водой, 5%-ым раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия.

Органическую фазу полученной смеси сушат над безводным сульфатом натрия и после концентрирования получают требуемый продукт продукт в виде кристаллического твердого вещества (1,37 г, т.пл. 146,5—

148 С). При исследовании структуры кристалла получен следующий химический состав, Элементный анализ для

С2< Ha2N204BrB, %:

Вычислено: С 53,98, Н 6,92, N 6,00, Br

17,10, В 2,31.

Найдено: С 54,54, Н 6,78, N5,,89,,Br

16,46, В 3,40. смесь растворяют в метаноле (10 мл) и для этерификации свободной бороновой кислоты прибавляют 80 г пинандиола. После переме шива ния в течение 30 мин

5 растворитель упаривают, а после порошкования осадка простым эфиром получают

0,28 г требуемого продукта.

Элементный анализ для .

С26Н40М504В НС! 2Н20, %:

10 Вычислено; С 54,78, Н 8,15, N 12,30, В

1,90.

Найдено: С 55,34, Н 7,83, N 11,66, В 1,99.

Масс-спектроскопия (FRB) .для С26 Н 40М504 В;

15 Вычислено Н: 498,32

Найдено; 498,31.

Пример 10. Ас — (D,L)Phe — (ОА)-боpoArg — С16Н 12;

Промежуточное .соединение Ас20 (0Л )Р пе — (Р,L) — NH — СН вЂ” ((СН2)зВг)В02 — С6Н12 получают модифицираванием методов. описанных в примере 1 и 2. Хлорангидрид AcPhe — 0H получают при взаимодействии

Ас — Phe — ОН (30 г, 0,145 моль) с пентахлори25 дом фосфористой кислоты (30 r, 0,144 моль) в 175 мл THF при -10 С, Реакционную смесь перемешивают при 0 С приблизительно в течение 1 ч, затем разбавляют до объема 350, мл охлажденным простым эфиром, продукт

30 выделяют в виде твердого вещества, промывают холодным простым эфиром и после высушивания в вакууме получают 21 г продукта. Активированное ацетилфенилпроизводное (14,8 г, 65,6 ммоль) растворяют

35 в 40 мл THF и прибавляют к продукту взаимодействия пинакона 4-бром-1-хлорбутилбороната и гексаметилдисилизана, приготовленных в 20 ммольной концентрации, при -78 С. Затем реакционную смесь

1807988

Алкилбромид превращают в соответст- 5,33 г, 14.5 ммоль) по методике, описанной в вующий азид по методике примера 3, Про- примере 2, за исключением того, что не выдукт выкристаллизовывают из этилацетата полняют хроматографии на колонке с LH-20. (т.пл. 143-144 С). Полученный продукт выкристаллизовывают

Элементный анализ для С21Нз2%04В, 5 из этилацетатэ с выходом в первом погоне

Ж: 2,47 г продукта (т.пл. 132 — 134 С) и 5,05 г

Вычислено; С 58,74, Н 7,53, N 16,31, В продукта(т.пл, 133 — 135 С) во втором погоне.

2,53.. . При оф-ТСХ в системе метанол: вода (85:15)

Найдено: С 58,85, Н 7,48, N 16,53, В 2,93. отмечено единичное пятно. Rf 0,29, Полученный азид превращают.в соль 10 ЗлементныйанализдляСз7Н51йз06ВгВ. бензолсульфокислоты Ас (О,б)Рпе--(ОА)-бороОгп-СвНд по методике примера4за иск- Вычислено; С 61,32, Н 7,11, N 5,80, Br лючением того, что гидрирование проводят 11 03. приатмосферном давлении, . Найдено: С 61,21, Н 7,02, N 5.59, Br

Ас-(0,(.)Рhе-(D,1)бороОrn — С6Н12Х15 10,22. хбензолсульфокислота (0,243 г, 0,433 ммоль) Вос (D)Phe — Phe-NH — СН((СН2)зйз)В02подвергают взаимодействию с цианамидом -С1оН16 получают при обработке соответству(0,20 г, 0,476 ммоль) при l00 С в 2 мл абсолют- ющего алкилбромида (7,15 г, 9,87 ммоль) азиного этэнола в течение ночи. Раствор кон- дом натрия по методике, описанной в центрируютипослепорошкования простым 20 примере 3, за исключением того, что для эфиром получают 0,21 г белого вещества. очистки не нужно проводить хроматографи, При оф-ТСХ отмечено характерное положи-. ческого разделения на колонке с LH-20. Тре. тельноеокрашиваниеполосыприиспользо-" буемый продукт элюируют из смеси вании красителя Sakaguchl в случае растворителей этилацетат,гексан в виде гебороаргининовых пептидов(И0-0.55) и ди- 25 ля и после выделенйя и промывания гекса. скретное пятно (Rf 0,68), соответствующее ном получают 3 г требуемого продукта в непрореагированному исходному материа-:. первом погоне и 2,9 г во второй порции.. лу. Полученный продукт(81 мг) повторно об-.: Бензолсул ьфонат Boc-(D)Phe — Phe — борабатывают 2 мл раствора цианамида {10 . poOrn-С1оН16 получают из указанного азйда мг/мл).в течение ночи по указанной методи-.. 30 (5,37 r, 7,82 ммоль) по методике, описанной ке и после порошкования простым эфиром, в примере 4, с выходом 5,33. При оф-ГСХ в получают.71 мг целевого продукта. . .. смеси метанол:вода (85. 15) отмечается инМасс-спектроскопия (FAB) для тенсивное положительное окрашивание ниC22H37N504Et: нгидрином, Rf 0,42 и слабое пятно в

Вычислено +Н: 446,30. .. 35 УФ-области, 0;92 (образование пятна в УФНайдено:446,23и404,19(соогветствую- области при ЯГО;92 характерно для аминов .щий непрореагированному борорнитиново- или гуанидиновых соединейий, которые явму пептиду)..: .ляются солями бензолсульфокислоты).

Следует иметь в виду, что методика по Масс-спектроскопия (FAB) для примеру 5 представляет собой наилучший 40 Сз7Н5зйа06В: способ получения бороаргининовых пепти- . . Вычислено+Н: 661;76. дов и отличается в том, что используют боль- . Найдено: 661,14. ший избыток цианамида и более. Boc — (D) — Phe — Phe-бороАг9-С1оН16 полпродолжительное время взаимодействия.: учают Ilo методике, описанной в примере 5.

"Пример 11. Вос-(D)Phe-Phe-бо- 45 Бороорнитиновыйпептид(4.83г,5,90ммоль)

poArg-С1оНМи бензолсульфонат.: . обрабатывают раствором цианамида (50

Вос-(D)Phe-Phe — ÎH получают по мето- мг/мл) в 20 мл абсолютного этанола в течедике, описанной для получения дипептида . ние 7 дней. Из реакционной смеси выделяют

Вос-(0)Рйе-Pro — ОН в примере 2, После гид- порцию продукта, соответствующую 1 г исрирования сложного бензилового эфира 50 ходного материала, и нагревают отдельно полученный продукт выкристаллизовывают без обратного холодильника в течение ночи из смеси хлороформ гексан с выходом тре- с полным превращением эмина в гуанидинобуемого пептида (т.пл. 133 — 133,5 С). соединение. После хроматографии на колонЭлементный анализ для C23H28N205. -,"ь: ке с LK-20 и порошкования продукта

Вычислено: С 66,96, Н 6,86, и 6,79. 55 простым эфиром получают 0.52 г требуемого

Найдено, С 66,75, Н 6,79, N 6,56. борнила.

Вос (0)Рйе Р м МН «:Н((СН2ЦЦВ02"С10Н16 Элементный анализ для C)4HriNg0gSB, получают путем смешивания Boñ-(0)Phe-Phe-0H (6 r, 14,5 ммоль) с NHz — Вычислено: С 61,38, Н 7,16, N 9,76, В

-СН((СН2)зВг)ВОг-С1оН16 HCI (пример 1.а, 1,25, 17

1807988

30 насыщаемости раствора добавляют нужное 35

45

55

Найдено: С 59,69, Н 7,41, N 9,82, В 1.26.

Масс-спектроскопия (FAB) для

C36H55N6O6В:

Вычислено Н: 703,43

Найдено: 703,49.

Пример 12. Н-(D)Phe-Phe-бороАгд—

С16Н16 2Н С!.

Бензолсульфонат Вос — (D)Phe-Phe — боpoArg — C1oH16, полученный по примеру 11 (0,59 г, 1,25 ммоль), деблокируют по методике примера 6 за исключением того, что пробу наносят на ионнообменную колонку в 20% этаноле с последующим промыванием указанной колонки 20%-ым раствором этанола.

Продукт получают (0,424 r) в виде белого твердого вещества.

Масс-спектроскопия (FAB)- . для

C33H47N604B:

Вычислено +Н: 603,38.

Найдено; 603,41, Пример 13. Бензолсульфат Ас — Ala—

Lys(B oc) — ба роА гд — C1o Н16.

Ас — Ala-Lys(Boc) — OH получают путем сопряженной реакции N-оксиянтарной кислоты имидоэфира Ас — Ala — ОН. полученного по методу Anderson, с Н вЂ” Lys(Boc) — ОН. N-оксикукцинимид Ас — Ala — OH (6,25 г, 27,4 ммоль) растворяют в 30 мл диоксана и прибавляют к раствору Н вЂ” Lys(Boc) — ОН (7,50 r, 30,4 ммоль), который растворен в смеси, состоящей из 30 мл 1 í. NaOH и триэтиламина (2,12 мп, 15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, а затем подкисляют соляной кислотой. Для получения требуемой количество сухого хлорида натрия. Продукт экстрагируют в этилацетате и затем промывают 0,2 н. HCI, полученной в насыщенном водном растворе хлористого натрия. Растворитель удаляют путем упаривания. После кристаллизации продукта из смеси этилацетат:гексан получают 7.,3 г требуемого продукта (т. пл. 86-89 С).

Ас-А1а — Lys(Boc)+JH — СН((СН2)3Вг)ВО2-С1оН16 йолучают по методике примера 2 за исключением того, что получаемый продукт очищают фракционированной кристаллизацией из этилацетата. B продукте (1,13 г), полученном во второй и третьей фракциях, отмечается единичное пятно при оф-TCX в смеси растворителей метанол:вода (85;15) при значении Rf 0,51. Тонкослойную пластинку подвергают воздействию паров хлористоводородной кислоты, на которой после прибавления нингидринового индикатора обнаруживают целевой амин.

Ac — Al а — Lys(B ос) — NH-С Н((С H2)ÇNÇ)B 02—

-C1OH16 получают из соответствующего алкилбромида (1,95 r, 2,9 ммоль) по методике, описанной в примере 3. за исключением то15

25 го, что очистку продукта осуществляют кристаллизацией его из зтилацетата, а не хроматографией ía LH-20. После кристаллизации неочищенного продукта (1,6 г) получают 0,55 г чистого продукта (т,пл.

79 — 84 С) и 0,96 г осадка, Ниже представлен химический состав кристаллического продукта.

Элементный анализ для СзоН52Й707В, % °

Вычислено: С 56,86, Н 8,29, N 15,48, В

1,71.

Найдено: С 56,76, Н 8,26, N 15,89, В 1,65.

Бензолсульфонат Ас-Ala Lys(Boc)-бороОгп— - С16Н16 получают из соответствующего алкилазида (0,433 r, 0,683 ммоль) по методике, описанной в примере 4. После удаления катализатора и растворителя получают названный продукт(0,45r) при порошковании простым эфиром, Масс-спектроскопия (FAB) для

СЗОН54К507В:

Вычислено. Н: 608,42, Найдено: 608,49.

Бензолсульфонат Ac — Ala — Lys(Boc) — боpoArg С1оН16 получают при взаимодействии соответствующего бороорнитинового пептида с цианамидом по методике, описанной в примере 5, Хроматографические фракции, содержащие требуемый продукт, порошкуют простым эфиром с выходом 0,83 г продукта в виде белого твердого вещества.

Элементный анализ для C37H62N7010BS, % °

Вычислено: С 55,00, Н 7,75. N t2,14, В

1,34

Найдено: С 54,09, Н 7,53, N12,,22, В 1,34.

Пример 14. Ас Ala-1.ys-бороАгд-С1оН16х х 2HCl.

Б ензолсул ьфонат As — Ala-Lys(Boc) — боpoArg — C1oH16 (0,200 r, 0,248 ммоль) деблокируют по методике примера 6. После ионнообменной хроматографии, упаривания растворителя, просушивания в вакууме и порошкования простым эфиром получают

0,14 г требуемого продукта, Масс-спектроскопия (FAB) для

C26H46N705B:

Вычислено Н: 550,39, Найдено: 550,42.

Пример 15. Бензолсульфонат BocLeu — Gly — Leu — Ala — бороАгд — С1оН16.

Вос — Leu — Ala — QBzLполучают по методике синтеза дипептидов, описанной в примере 2. Вос-Leu — Ala — OBzL (23,7 г, 57,7 ммоль) растворяют в 40 мл безводной трифторуксусной кислоты, Через 15 мин удаля ют избыток трифторуксусной кислоты путем упаривания и после обработки полученного

1807988

19 анализ осадка простым эфиром получают трифторацетат Н вЂ” еа — Ala — OBzL в виде кристаллического продукта (22,8 r).

Элементный анализ для C>8H25Nz05Fg, %:

Вычислено; С 53,19, Н 6.21, N 6,89.

Найдено: С 53,37, Н 5 68, N 6,84.

Boc-Gly — Leu — А!а-OBzL получают реакцией сопряжения Вос — Gly — ОН (5,70 г, 32,6 ммоль) с Н-Leu-Ala-0BzL по методике смешанного ангидрида, описанной в примере

2. Продукт(13.8 r) получают в виде аморфного твердого вещества. Вос-Gly-Leu — AlaOBzL деблокируют трифторуксусной кислотой по методике, описанной для приготовления Н-Leu Ala-QBzL, за исключением того, что трифторацетатная соль может быть растворена в простом эфире. Продукт растворяют в этилацетате и очищают безводным хлористым водородом. После осаждения полученного продукта при добавлении простого эфира получают 7,7 г хлорида Н-Gly-Leu — Ala — ОВг1 в первом сборе, Boc — Leu-Gly — Leu — Ala — OBzL получают сопряженной реакцией Boc — Leu — ОН (2,62 r, 10,5 ммоль) с Н вЂ” Gly-Leu — Ala — OBzl no методике получения смешанного ангидрида, описанной в примере 2. После кристаллизации полученного продукта из смеси этилацетат:гексан получают в первом сборе 2,7 г названного продукта (т.пл. 95 — 96 С).

Элементный анализ для Cz8H46N407