Способ получения антибиотика

Способ получения антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: микробиология , получе- tnne полиэфирных антибиотиков, относящихся к кислотным полициклическим простым эфирам. Сущность изобретения: осуществляют глубинное культивирование штамма Actlnomadura sp. ATCC 53708 в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. Культуральную жидкость или отфильтрованный мицелий экстрагируют органическим растворителем . Продукт выделяют в неочищенном или чистом виде или переводят в фармацевтически приемлемую соль щелочного металла. 1 табл.

С()К):1 Г:08(ТГКИХ

Г011ИЛПИС fM 1f.-СКИХ

РЕ ГПУЕ) ПИК

<Я1» С 12 N 1/20/

ГОсудАРстBF t

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

I эфира. имеюНастоящее изобретение относится к.но- полициклического простого дым антибиотикам на основе кислотного щего общую формулу

„,ОМе (Ъ Ме

Ме ОМе

1 (00

О

00 ,О

НО

Ме Ие (21) 4830753/13 (22) 07.08.90 (46) 07.04.93, Бюл. N. 13 (86) PCT/US 88/00358 (08.02,88) (71) Пфайзер Инк (US) (72) Джон Филип Дирлам, Уолтер Патрик

Куллен (US), Хироси Маеда и Дзунсуке Тоне (Р) (56) Аналогов в научно-технической и патентной литературе не выявлено, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА (57) Использование: микробиология, получение полиэфирных антибиотиков, относяв которой Ме представляет собой метильную группу, имеющего абсолютное стереохимическое строение, отраженное в формуле, к пригодным для фармацевтического использования катионным солям указанных соединений, к пищевым композициям, включающим указанный антибиотик и предназначенным для домашней птицы, крупного рогатого скота или свиней, к их использованию в качестве противококцидальных средств для домашней птицы, при лечении или предотвращении дизентерии у свиней. или в качестве стимулятора

„.,5Ц„„1808007 АЗ щихся к кислотным полициклическим простым эфирам. Сущность изобретения; осуществляют глубинное культивирование штамма Actlnomadura sp, АТСС 53708 в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, Культуральную жидкость или отфильтрованный мицелий экстрагируют органическим растворителем. Продукт выделяют в неочищенном или чистом виде или переводят в фармацевтически приемлемую соль щелочного металла. 1 табл, Ме

О

Н )

Н ОН Ме ОН g) роста крупного рогатого скота и свиней, к способу ферментации для их получения, и к микроорганизмам Actlnomadura, которые продуцируют указанный антибиотик согласно указанному ферментационному способу.

Соединение (1) представляет собой новое соединение ряда антибиотиков, относя. щихся К кислотным полициклическим простым эфирам, Этот ряд включает также такие широко известные агенты, как монезин (Указатель фирмы "Мерк", 10-е издание, "Мерк энд Ко. Инкорпорейтед", Рэгуэй. Н ью1808007

Джерси, 1983, ¹ по указателю 6100), нигерицин (Указатель "Мерк", N. по указателю

6100), ласалоцид (Указатель "Мерк" N no указателю 6390) и салиномицин (Указатель

"Мерк", N по указателю 8193). Этот вопрос освещен Уэстли, "Полиэфирные антибиотики", т. 22, с. 177-223 (1977), Наиболее близ. ким в структурном отношении аналогом указанного соединения является портми- цин, антибиотик независимо описанный Хзмиллом с сотр. в патенте США ¹ 4572822 и

Кусакабе с сотр, в европейской патентной заявке 158179, Tetrahedron Letters, 28, 3357-3360 (1987), J,Antibiotics 40, 237-238 (1987). Это соединение обладает альфа-водородным атомом в тетрагидрофурановом кольце В, тогда как соединение согласно настоящему изобретению имеет альфа-метильную группу. Указанные соединения известны в качестве кокцидостатических средств, в качестве средств ускорения роста— добавок к пище, и/или в качестве агентов, противодействующих развитию дизентерии у свиней.

Культура Actinomadura sp. ATCC 53708 (АТСС 53708) при ферментировании в аэробных условиях в водной среде продуцирует новый антибиотик типа кислотного полициклического простого эфира — соединение общей формулы (i), описанное выше, Настоящее изобретение относится к указанному соединению формулы (l), включая его пригодные для фармацевтического использования катионные соли, и к способу его получения, включающему ферментирование указанных микроорганизмов

Actlnomadura sp. АТСС 53708 в водной питательной среде, включающей источник усваиваемого углерода и азота до образования извлечимого количества указанного соединения формулы (!), предпочтительйо в погруженных аэробных условиях. Для его использования в качестве противококцидального агента.. средства для предотвращения или лечения дизентерии у свиней и/или в качестве средства ускорения роста, соединение (I) не обязательно выделять в практически чистом виде, напротив, его можно в альтернативном варианте. использовать в неочищенном виде, либо осажденным из смеси мицелием (с выделением из ферментативной среды фильтрованием), либо в твердой форме после сушки при распылении или замораживании всей ферментационной среды.

Указанные пригодные для фармацевтического применения катионные соли включают (но не ограничиваются) соли натрия, калия, кальция, аммония, NtN -дибензилэтилендиаминэ, N-метилглюкамина, (меглу10

40 мина) и диэтаноламина, Предпочтительными катионными солями являются соли калия и натрия.

Культура, способная продуцировать антибиотик в форме полициклического эфира согласно настоящему изобретению, отвечающего формуле (1). обозначается

Actlnomadura, она помещена в Американской коллекции типов культур в Роквилле, . штат Мэриленд в качестве типовой культуры под номером АТСС 53708. Наличие депонированной культуры в Американской коллекции типов культур в Роквилле, Мэриленд, и возможность доступа к ней будут обеспечены на протяжении всей продолжительности действия патента, если патент по настоящей заявке будет выдан, Доступ к культуре обеспечен в соответствии с действием заявки под номерами 37 CFR 1.14 и 35 USC 122.

Все ограничения для широкого использования депонированной культуры снимаются немедленно после выдачи соответствующего патента.

Указанная культура была получена из образца почвы, взятого в Тузле (Стамбул, Турция), и идентифицирована в коллекции культур "Пфайзер Инкорпорейтед" под номером N 777-1. Ее описание и классификация обеспечены д-ром Д.Х.Хуангом, Обнаружено, что указанная культура продуцирует тонкие нити грибницы (гифы) актиномицетов, воздушный мицелий, на котором продуцируются цепочки коротких спор, и неразделенный субстратный мицелий. Результаты полного анализа клеток указывают на то, что данный микроорганизм принадлежит к роду Actinomadura, Культуру идентифицируют в соответст вии с описанным ниже способом, Экстракт дрожжей — солодовый экстракт агар-агар (среда /зрФ 2, Дифко) рост хороший, кремообразная масса (2са) с пятнами, имеющими цвет от темно-серого до черного (серии близкого к черному цвету — 5

45 дюймов(127 мм), 5 мл), высокая, с моршинистой поверхностью, воздушный мицелий от отсутствия до редкого, бесцветный, обратная поверхность кремовая — от палевого до желтого цвета (2са, 2еа) с черными (серии

50 близкого к серому цвету 5 мл) пятнами, рас.творимый пигмент отсутствует, Овсяной агар-агар (среда /зрФ 3, Дифко) — рост средний, кремообразная масса (2са), средней высоты, гладкая, воздушный мицелий от о сутствия до редкого, бесцвет. ный, обратная поверхность кремовая — (2са), крем растворимого пигмента (2ca).

Неорганические соли — крахмальный агар-агар (среда /зрФ 4, Дифко) — рост. плохой, кремообраэная масса (2са). тонкая.

1808007 гладкая, воздушный мицелий.от отсутствия ность кремовая — желтая (2 ic), растворимый до редкого, бесцветный. обратная поверх- пигмент отсутствует. ность кремовая — (2са), растворимый пиг- Питательный агар-агар (указанная вымент отсутствует. ше статья, среда № 14, с, 330) — рост от

Глицерино-аспарагиновый агар-агар 5 плохого до умеренного, кремообразная мас(среда /sp¹ 5, Дифко) — рост от плохого до са (2 са) от тонкой до слегка возвышенной, среднего, кремообразная масса (2са), тон- воздушный мицелий отсутствует. обратная кая, гладкая, воздушный мицелий отсутству- поверхность кремовая — (2са), растворимый ет, обратная поверхность кремовая — (2са), пигмент отсутствует, растворимый пигмент отсутствует, 10 Желатиновый агар-агар (Гордон и Мим, Сахарозный агар-агар по Чапеку(среда J.Bacterlol, 73, 15-27, 1957) — рост хороший, №1, Уоксман, "Актиномицеты", т.2 стр.328, кремообразная масса (2 са), высокая, мор1961) — рост от умеренного до хорошего, щинистая;воздушныймицелийотсутствует, кремообразная масса (2са), умеренно высо- обратная поверхность кремовая — палевокая,гладкая,воздушныймицелийотсутству- 15 желтая (2 са, 2 еа), растворимый пигмент ет, обратная поверхность кремовая — (2са), желтого цвета (2 еа). растворимый пигмент отсутствует. Крахмальный агар-агар (указанная выГлюкозо-аспарагиновый агар-агар (сре- ше статья) — рост хороший, кремообразная да №2, Уоксман, "Актиномицеты", т.2 стр, масса(2са),высокая, морщинистая,воздуш328, 1961) — рост умеренный. кремообраз- 20 ный мицелий отсутстует, обратная поверхная масса (2са), от тонкой до умеренно вы- ность кремовая — палево-желтая (2 са, 2 еа), сокой, от гладкой до морщинистой, растворимый пигмент отсутствует, воздушный мицелий отсутствует, обратная Картофельно-морковный агар-агар (Леповерхность кремовая — (2са), растворимый шевалье, Lab.ÑÈï, Med., 71, 934-944, 1968, пигмент отсутствует, 25 но с использованием только 30 г картофеля, Тирозиновый агар по Гордону и Смиту . 2.5 r моркови и 20 г агар-агара) — рост от (Гордон и Смит, J. Bacteriol. 69, 147-150, плохогодо умеренного, практически белый

1955) — рост от умеренного до хорошего, (почти серые серии 2 ba), тонкий, гладкий, кремообразная масса(2сэ) от слегка подня- воздушный мицелий незначителен или оттой до умеренно высокой, от гладкой до сутствует, бесцветный, обратная поверх морщинистой, воздушный мицелийотсутст- 30 ность от бесцветной до кремовой (2 са), вует, обратная поверхность кремообразной растворимый пигмент отсутствует. массы (2са), растворимый пигмент палево- Водный агар;агар (2%) — рост плохой, желтый, кремообразная масса 2 са, тонкий, гладкий, Агар-агар с кальциевой солью яблочной воздушный мицелий отсутствует или незнакислоты (Уоксман, Bacteriol Rev,, 21, 1-29, 35 чителен, бесцветный, обратная поверхность

1957) — рост незначительный, кремообраз- кремовая (2 са), растворимый пигмент отсутная масса (2са), тонкая, гладкая, воздушный ствует. мицелий отсутствует, обратная поверхность Ми черальная среда 1 по Гаузе (Гаузе с кремовая (2са), растворимый пигмент отсут- сотр. "Проблемы классификации антагониствует, 40 стических актиномицетов" англ. издание, с.

Казеиновый агар-агар (Гордон и Смит, 13, 1957) — рост от плохого до умеренного, указанная выше статья) — рост хороший, кремообразная масса(2 са), тонкая, гладкая, кремообразная масса (2са), высокая, от воздушный мицелий отсутствует или незнагладкой до морщинистой, воздушный мице- чителен, обратная поверхность кремовая (2 лий отсутствует, обратная поверхность кре- 45 са), растворимый пигмент отсутствует, мовая — палево-желтая (2са), растворимый Органическая среда 2 по Гаузе (указанпигмент желтый (2 дз). ный выше источник) — рост хороший, креАгар-агар по Беннету(Уоксман, указан- мообразная масса (2 са), вЪ сокая, ная выше статья, среда № 30) — рост хоро- морщинистая, воздушный мицелий отсутстший, кремообразная масса(2са) высокая, от 50 вует, обратная поверхность кремовая — пагладкой до морщинистой, воздушный мице- лево-желтая. (2 сэ, 2 еа), растворимый лий отсутствует, обратная поверхность кре- пигмент отсутствует. мовая — палево-желтая (2са, 2еа), Морфологические свойства. Морфолорастворимый пигмент желтый (2еа). гические свойства наблюдают 3 недели поАгар-агар по Эмерсону(указанная выше 55 сле начала инкубирования на питательной статья., среда № 28, с. 331) — рост умеренный, среде из неорганических солей — крахмалокремообраэная масса палево-желтого цвета ваго агар-агара, воздушный мицелий бес(2 са, 2 еа), высокая, морщинистая, воздуш- цветный, цвет от белого до кремового, ный мицелий отсутствует, обратная поверх- цепочки спор прямые, искривленные или

1808007

15

25

35

21 С

Хороший рост

55 крюкообразные. содержат от 2 до 9 спор на цепочку, споры глобулярные, овальной или эллиптической формы, диаметром 0,8-1,4 мкм или размером 1,1-1,8х0,8-1,2 мкм, гладкие (по данным электронной сканирующей микроскопии).

Биохимические свойства, Мелатин не продуцируется, сероводород не продуцируется, желатин разжижается, крахмал не гидролизуется, нитрат не восстанавливается до нитрита, не наблюдается ни роста, ни разложения целлюлозной питательной среды по Йенсену или Ливайну и Шенлайну, свертывание и пептониэация молока не наблюдается, положительная ферментация каэеина, отрицательная ферментация тирозина, отрицательная ферментация соли кальция яблочной кислоты, Использование карбогидратов; используются глюкоза, арабиноза, фруктоза, маннит, рамноза, сахароза, ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоза; крахмал и треалоза, не используются инозитол, рафиноза, дульситол, эритритол, галактоза, лактоэа, манйоза, мелезитоэа, мелибоэа, альфа-метил-глюкоэид, салицин, сорбит и сорбоза.

Прочие положительные результаты тестов включают использование ацетатов и пируватов, гидролиз эсулина и разложение ксантина и гипоксантина. Перечисленные ниже тесты дают отрицательные результаты: на использование бензоатов, цитратов, декстрина, лактатов, солей яблочной кислоты, солей слизневой кислоты, оксалатов, фенола, припионатов и сукцинатов, разложение аденина и тирозина и гидролиз гиппурата, Температурные соотношения

28оС . 37ос 45оС

Хороший Хороший Хороший рост рост рост

Анализ совокупности клеток.

Гидролизат совокупности клеток содержит мезо-диаминопимеловую кислоту, глюкозу, галактозу, мадуроэу, маннозу и рибозу.

Культура N 777-1 характеризуетвя кремовым субстратным мицелием, коротким бесцветным воздушным мицелием, короткими цепочками спор прямой, искривленной или крюкообразной формы и спорами с гладкой поверхностью. Используются глюкоза, арабиноза, фруктоза, маннит, рамоза, сахароза, ксилоза, адонитол, целлобиоза, глицерин, мальтоза, рибоэа, крахмал, трелоза, ацетаты и пируваты, Разлагаются ксантин, гипоксантин и эксулин. Анализ гидролизата совокупности клеток свидетельствует о наличии меэодиаминопименовой кислоты и мадуразы. Таким образом, культура N 777-1 принадлежит к роду

Actinomadura в соответствии с данным Г.Лешевалье определением, На основе приведенных выше данных уместно рассматривать культуру N 777-1 в качестве члена рода Actinomadura и приписать ей наименование Actinomadura sp

Данная культура депонирована в Американской коллекции типов культур под номером

АТСС 53708.

Обладающее свойствами антибиотика соединение формулы (I) согласно настоящему изобретению легко продуцируется указанной культурой Actinomadura в результате выращивания последней при температуре в пределах от примерно 24 до примерно 36 С в условиях погружения при перемешивании и аэрации среды, состоящей из источников карбогидратов, таких как сахар, крахмал, глицерин; органических азотсодержащих соединений, таких как соевая мука, касаминовые кислоты, дрожжевой экстракт; среды для роста, например растворимые зерновые фракции, рыбная мука, мука из семян хлопчатника; минеральных солей, содержащих следовые количества таких элементов, как железо, кобальт, медь, цинк, и др, и карбоната кальция или фосфатов в качестве буферных агентов, После завершения выращивания антибиотик может быть легко экстрагирован из питательного бульона посредством органического растворителя, например н-бутанола, метилиэобутилкетона, или хлороформа при рН в диапазоне от 4,0 до 8,0 посредством фильтрования мицелия, который содержит осажденный антибиотик (фильтрат при этом отбрасывают), или в результате непосредственной сушки при распылении или при охлаждении питательного бульона, В альтернативном варианте мицелий или высушенный бульон в цело -1 экстрагируют одним из перечисленых выше органических растворителей. Затем очищенное соединение, обладающее свойствами антибиотика, при желании выделяют из органического экстракта с использованием стандартных методов концентрирования, соле- или кислотообразования, хроматографии, осаждения и/или кристаллизации — в соответствии с приведенными ниже примерами, В соответствии с обычными способами ферментации вначале получают инокулум посредством разрушения растительных клеток, с выращиванием его в подходящей среде, из срезов или сосудов Ру. инокулированных Actlnomadura sp. ATCC. 53708, Пол1808007

55 учаемые при этом растительные клетки в свою очередь используют для инокулирования колб для встряхивания или емкостей для инокулирования, которые также содержат подходящую среду для роста. В альтернативном варианте емкости для инокулирования инокулируют из колб для встряхивания.

После соответствующего периода вьгращивания (обычно от 120,до 144 ч пребывания во встряхиваемых колбах и от 168 до 196 ч пребывания в емкостях для инокулирования), фермент, также содержащий подходящую среду для роста, инокулируют в асептических условиях с растительным питательным бульоном из колб для встряхивания или емкостей для инокулирования, После завершения выращивания (обычно продолжающегоя 120-196 ч) антибиотик выделяют по желанию в очищенном или неочищенном виде с использованием того или иного способа из числа перечисленных выше или с использованием специфических способов, описанных ниже в примерах.

Соединение формулы (I) подвергают испытаниям in vitro на наличие бактерицидной активности с использованием стандартных способов, в соответствии с которыми измеряют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) по отношению к одному или нескольким микроорганизмам, выраженную в мкг/мл. Подобная методика рекомендована, в частности, в соответствии с результатами совместных международных исследований по чувствительности антибиотиков (Эриксон и Шеррис, Acta Pathologica et Microbiologia

Sqandinav., Supp. 217, Section В, 64-68 (1971), согласно которой используется агарагаровая мозговая сердечная вытяжка(ВН1) и устройства для реплликации инокула, Пробирки с препаратом, выращиваемым в течение ночи, подвергают 100-кратному разбавлению для использования в качестве стандартного инокулята (от 20000 до 100000 клеток в примерно 20 мл помещают на поверхность агар-агара, 29 мл агар-агара

ВН1/чашку). Для проведения испытания берут примерно двукратные разбавления испытуемоro соединения при начальной концентрации испытуемого соединения, равной 200 мкг/мл. При рассмотрении результатов после выдерживания культуры в течение 18 ч при 37 С единичные колонии не принимают во внимание. Способность воздействия на микроорганизм (МИК) для данного испытуемого микроорганизма представляет собой минимальную концентрацию соединения, при которой наблюдается полное ингибирование роста при наблюдении невооруженным глазом. Как и

50 в случае прочих полициклических простых эфиров, обладающих свойствами антибио тиков, соединения согласно настоящему изобретению формулы (l) обычно демонстрируют грамположительную противобактерийную активность, а также активность против Treponema hyodysenteriae (агент, вызывающий дизентерию у свиней, о чем свидетельствует материал, приведенный в таблице).

Данные по эффективности соединений формулы (!) и их солей против кокцидозных инфекционных заболеваний цыплят получают согласно описанному ниже способу.

Группам по 3-4 цыплят породы белый леггорн возрастом 10 сут дают питание в виде пюре, содержащее равномерно распределенное в нем соединение формулы (!) или его соли натрия и/или калия, После выдерживания птиц на укаэанном рационе в течение

24 ч каждому из цыплят инокулируют через рот оциты конкретных видов испытуемых микроорганизмов рода Eime ia. Другим группам иэ 3-5 цыплят в возрасте 10 сут дают аналогичную пищу в виде пюре, не содержащую соединений формулы (I) или их солей. Их также инфицируют спустя 24 ч, эти птицы служат в качестве контрольной зараженной группы. Еще одной группе из 3-5 цыплят в возрасте 10 суток дают аналогичную пищу в виде пюре беэ антибиотиков, и птиц не подвергают заражению кокцидозом. Эта группа служит в качестве контрольной по нормальным условиям. Результаты проведенной обработки оценивают спустя 5 сут в случае заражения Е,acervulina и спустя

6 cyt для прочих видов.

Критерий, используемый для измерения противскокцидоэной активности, соответствует оценке поражения по шкале от 0 до 4 для Е tenella по способу Дж.Э,Линча, Новый способ первичной оценки противококцидозной активности, Am, J, I/et. Res. 22, 324326, 1961, по шкале от 0 до 3 для всех остальных видов в соответствии с методикой оценки, разработанной Дж.Джонсоном и У.Г.Рейдом, Методика определения снижения степени поражения при использовании противококцидозных средств при проведении экспериментов на цыплятах в клетках, Ext. Parasit., 28, 30-36, 1970.

Активность определяют посредством деления оценки поражения для каждой из групп, прошедших обработку, на аналогичную оценку поражения для инфицированной контрольной группы, В соответствии с укаэанным испытанием соединение формулы (I) и его катионные соли обладают отличной активностью по отношению к разновидностям Eimeria tenella. Eimeria

1808007

10!

ОУ ТТ г/л г/л

Хлорид натрия

Хлорид кобальта

Хлорид кальция

0,002

Хлорид кобальта

Карбонат кальция

0,002

0,10

acervullna, Elmeria maxima, Eimeria drunettl, Elmerla necatrix при заражении домашней птицы в случае. когда их вводят в пюреобразную пищу для цыплят в количестве примерно от 0,1 до примерно 25 м.д. Так, например, по отношению к чувствительной разновидности Eimeria сепеИа соединения формулы (1) проявляют 100 Д контроля поражения при столь малых дозах, как, например, 5 м,д.

Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами. Следует однако понимать, что изобретение не ограничивается конкретными деталями указанных примеров, Пример 1. Ферментация Actinomadura

sp. АТСС 53708, Выделение соединения формулы (l) в виде его соли натрия, Микроорганизм Actinomadura вначале выращивают в результате инокулирования твердой среды на срезах или в емкости Ру

Церелоза 10

Соевая мука 10

Твердая ферментационная фракции кукурузы 5

Кукурузный крахмал ° 10

100 мл среды помещают в колбу для встряхивания на 300 мл и стериализуют при

120 С и давлении 15 фунт/кв.дюйм (примерно 0,.1 кг/кв,см) в течение 30 мин. После охлаждения среду инокулируют суспензией растительных клеток, полученную из срезов указанной выше культуры Actinomadura.

Колбы встряхивают при 28 С на устройстве, имеющем амплитуду от 1,5 до 2,5 дюймов (от

37 до 64 мм) и скорость вращения 150-200 об/мин в течение 5-7 сут.

Одновременно получают в 5-литровых емкостях по 3 л одной из указанных выше сред С или IDY ТТ или указанной ниже среды:

UKl-2 г/л

Церелоза 45

Соевая мука 10

Жидкая фракция варки кукурузы 10

Хлорид кобальта 0,002

Сульфат магния 0,10

Карбонат кальция 3

Сульфат марганца 0,10

Сульфат двухвалентного железа культурой АТСС 53708 с использованием среды N 172 по нормам АТСС, получение и нормы расхода приведены ниже (в г/л).

Глюкоза 10

Растворимый крахмал 20

Дрожжевой экстракт 5

Ферментативный гидролизат казеина 1

Карбонат кальция 1

Дистиллированная вода до 1000 мл, рН доводят до 7,0 посредством КОН, добавляют агар-агар 90

Среду в колбах для встряхивания получают в соответствии с любым иэ приведен20 ных ниже составов:

К среде добавляют 1 мл средства против

ЦерелозаКукурузный крахмал

Жидкая фракция варки кукурузы 5

Ферментативный гидролизат казеина 5 образования пены (полипропиленгликоль

32000, содержащий 10 мас,,(, окиси этилена). емкости закрывают и стерилизуют при

25 120 С и давлении 15 фунт/кв. дюйм в течение 45 мин. Затем среду в емкостях инокулируют содержимым одной колбы для встряхивания (примерно 3 g, инокулума), ферментируют втечение 120-168 ч при 30 С, 30 перемешивают при скорости 1700 об/мин при количестве воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в минуту.

После завершения ферментации (по данным антибиотического теста против

35 В.Subtilis АТСС 6633) ферментационные устройства останавливают и фильтруют их содержимое через диатомитовую землю при имеющемся рН. Осадок на фильтре переводят во взвесь в метаноле. концентрируют в

40 вакууме, разбавляют 2-3 объемами воды и экстрагируют дважды порциями от 1/3 до

1/2 объемами либо метилизобутилкетона, либо н-бутанола. Слой растворителя отделяют от водной фазы посредством отсасыва45 ния или центрифугирования, взбалтывают и концентрируют в вакууме, получая антибио1808007 тик формулы(I) в неочищенной форме в виде вязкого масла.

Биологическую активность питательного бульона и последующих выделенных фракций можно исследовать с использованием чувствительных штаммов Bacillus

subtllls АТСС 6633 или Staphylococcus

aureus АТСС 6538. Компоненты питательного бульона и выделенных фракций могут быть визуализированы с использованием пластинок с силикагелем CF "Анальтек" и этилацетата в качестве элюента. Проявленные пластины опрыскивают ванилиновым реагентом (3 r ванилина в 75 мл этанола и

25 мл 85%-ной фосфорной кислоты) и нагревают до 80 С. Обладающий свойствами антибиотика продукт формулы (l) проявляется в виде пурпурного пятна. Проявленные пластины для тонкослойной хроматографии могут быть также покрыты агар-агаром, в который помещены культуры Bacillus

subtilis или Staphylococcus aureus, к которым доба вля ют 2,3,5-трифенил-2 Н-тетразолилхлорида (моногидрат), и инкубируют при

370С в течение 16 ч для визуализации антибиотика (белые пятна на розоватом фоне).

Крупномасштабный эксперимент в больших емкостях для ферментации осуществляют посредством получения продукта в колбах для встряхивания, содержащих 0,7 л среды С или.l0Y ТТ. Инокулум из указанных колб ферментируют в течение 5-7 сут при 28 С и используют полученный инокулум для инокулирования емкостей для ферментации объемом 200 или 6000 л, содержащих 100 или 4000 л среды UKI-2 соответственно. Примерно 1 л инокулума используют для инокуляции каждой емкости. После ферментации в течение 7-10 сут получают готовый продукт.

Весь питательный бульон в меньших по размеру ферментаторах экстрагируют 50 л метилизобутилкетона при имеющемся рН, Органический экстракт концентрируют в вакууме в циклон-аппарате и вакуумном испэрителе с получением масла. lyiacno затем дважды хроматографируют на колонке с силикагелем (гексан). В первой колонке элюирование осуществляют этилацетатом, а во второй — смесью 1;1 хлороформ — ацетон.

Фракции, содержащие продукт, идентифицируют тонкослойной хроматографией с использованием описанного выше способа.

Активные фракции после второй колонки с силикагелем вновь хроматографируют на флорисиле, используя для элюирования смесь хлороформа и метанола 19;1, Фракции, содержащие продукт, объединяют, встряхивают с разбавленной фосфорной кислотой, затем с двухосновным фосфатным буфером для получения соли натрия, сушат над сульфатом натрия, разгоняют и кристаллизуют остаток иэ эфира, получая в

5 результате соль натрия соединения формулы (1) в количестве 915 кг, температура плавления 245-249 С, (альфа)р =-19,0 (с=1, метанол).

Результаты анализа из расчета нэ

10 C4sHvvO< Na.

Рассчитано, $: С 62,47; Н 8,97, Найдено, : С 62,89; Н 9,22.

Спектр ЯМР-С-13 (хим. сдвиги в м.д, в .дейтерохлороформе с указанием числа

15 атомов водорода данного типа); 182,8-0Н, 110,0 -ОН, 106,0-0Н; 99,1-1Н; 87,2-1Н; 86,9ОН; 86,2-1Н; 86,2-0Н; 84,8-1Н; 83,4- .ОН;

82,6-1Н; 80,2-1Н; 78,5-1Н; 75,2-1Н; 74,8-1Н;

74,6-1Н; 66,4-1Н; 60,3 3Н; 57,9-3Н; 56,9-3Н;

20 44,5-1Н; 39,0-1Н; 36,9-1Н; 36,8-2Н; 25,9-2Н;

35,4-2Н; 35,2-2Н; 35,1-1Н; 35,0-1Н; 31,3-2Н;

30,9-2Н; 30,5-1Н; 28,2-3Н; 27,1-2Н; 26,1-2Н;

25,0-3Н; 21,0-3Н; 18,3-3Н; 16,7-3Н; 15,3-3Н;

13,4-3Н; 13,1-3Н; 11,2-2Н; 10,7-3Н; 10,6-3Н.

Работа C использованием больших ферментизационных емкостей проводится с экстрагированивм всего питательного бульона (примерно 4000 л) 1800 л метилизобу30 тилкетона, отделением растворителя в экстракторе Подбельняка и концентрированием в вакууме с удалением растворителя и получением сиропообразной массы. Концентрат дважды растирают с равным объе35 мом неразбавленного метанола, отделяют нерастворимое в метаноле масло, а метанольную фракцию концентрируют в вакууме с получением сиропообразной массы. Указанную массу дважды экстрагируют гекса40 ном, а объединенные экстракты в гексане — . эцетонитрилом. Ацетонитрильную фракцию сохраняют для дальнейшего извлечения продукта. Гексан концентрируют в вакууме и хроматографируют на колонке с силикаге45 лем по частям, Продукт десорбируют из силикагеля на воронку с фильтром вначале гексаном, затем хлористым метиленом, этилацетатом, и наконец ацетоном, Активные фракции, которые содержатся. в элюатах в

50 хлористом ь-етилене и этилацетате, растворяют в гексане и промывают подкисленной водой, после чего экстрагируют 17;-ным раствором М-метил-0-глюкамина в воде.

Водную фазу подсаливают хлоридом натрия

55 и экстрагируют 2 равными по объему порциями этилацетата. Органические слои объединяют, обрабатывают активированным углем, фильтруют, промывают фосфатным буфером с рН 9,0, сушат над сульфатом на1808007

НООС

Ие Ие трия, концентрируют в вакууме и кристаллизуют из эфира, получая 50,8 г соли натрия, идентичной с продуктом, полученным в результате менее масштабной ферментации.

Пример 2, Соединение формулы (1) в 5 форме свободной кислоты.

Соединение формулы (1), Обладающее свойствами антибиотика в форме свободной кислоты, получают в результате интенсивного встряхивания в делительной 10 коронке раствора соли натрия в хлороформе с равными объемами соляной кислоты при рН 2. Фазы разделяют, промывают фазу хлороформа водой и разгоняют в вакууме, получая свободную кислоту, имеющую тем- 15 пературу плавления 87-90 С (альфа)р

6,9 С (с=1, метанол).

Результаты анализа из расчета на .С45Н78014 0;5 Н20.

Рассчитано, %: С 63,48; Н 9,34. 20

Найдено, %: С 63,35; Н 9,53, Пример 3, Соединение формулы (1) (соль натрия), Свободную кислоту, полученную в предшествующем примере (45 мг), растворяют 25 в 100 мл хлороформа, К раствору добавляют раствор карбоната натрия (0,5 r) в воде (100 мл) и помещают полученную смесь в делительную воронку, после чего интенсивно встряхивают в течение нескольких минут. 30

Слой в хлороформе разделяют, а водный слой промывают свежим хлороформом.

Объединенные экстракты в хлороформе сушат надсульфатом натрия, фильтруют и разгоняют в вакууме, получая 41 мг соли 35 натрия, температура плавления 230-235ОС.

Результаты анализа из расчета на

C45H7701

Рассчитано, %: С 62,47, Н 8,97.

Найдено, %: С 62,20; Н 9,14.,5 40 - е

Ие О = заключающийся в том, что осуществляют глубинное культивирование штамма

Аст1погпабига sp, АТСС 53708 в условиях аэрации и перемешивания в питательной 45 среде, содержащей источкики углерода, азота и минеральные соли, с последующей

Пример 4. Соединение формулы (1) (соль рубидия).

° . Для получения соли рубидия соединения формулы (1) 30 мг свободной кислоты растворяют в 50 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавляют раствор 35 мг карбоната рубидия в 25Мл воды и перемешивают полученную смесь в течение 2 ч.

Органическую фазу отделяют и экстрагируют водный слой равным объемом хлороформа. Объединенные экстракты в хлороформе разгоняют, получая твердый белый остаток.

Соль рубидия перекристаллизовывают в результате медленного испарения из эфира и определяют структуру полученных кристаллов методом рентгеноструктурного зализа (д-р Дж. Бординер).

Пример 5; Соединение формулы (1) (соль калия).

Для получения соли калия соединения формулы (1) 130 мг свободной кислоты растворяют в 100 мл хлороформа. К раствору в хлороформе добавляют раствор 100 мг карбоната калия в 100 мл воды и перемешивают полученную смесь в течение нескольких минут, после чего помещают ее в делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение нескольких минут. Органическую фазу отделяют и разгоняют в вакууме, получая соединение формулы (1) в виде белого порошка, температура 255-260 С, (альфа)о 5=-19,6 (с=1, хлороформ).

Результаты анализа из расчета на

С45Н77Р14К, Рассчитано, %: С 61,34, Н 8,81, Найдено, %: С 60,91, Н 8,83.

Формула и зоб рете н и я

Способ получения антибиотика формулы экстракцией органическим растворителем всей культуральной жидкости или отфильтрованного мицелия и выделением целевого продукта, который при необходимости переводят в фармацевтически приемлемую щелочно-металлическую соль.

1808007

Исследования in vitro антибактериальной активности соединения формулы 0) Техред М.Моргентал Корректор П,Гереши

Редактор Л.Волкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 1394 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5