Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом

Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: ветеринария, иммунологическая диагностика. Сущность изобретения: для диагностирования внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом. Одновременно с определением антител в сыворотке крови проводят определение антигенов в первородном кале, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 А 61 К 39/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4862905/13 (22) 06.09.90 (46) 07.05.93, Бюл.М 17 (71) Целиноградский сельскохозяйственный институт и Ставропольский сельскохозяйственный институт (72) А.К.Булашев, А.Ф.Дмитриев, К.Т,Шенжанов, С.H.6oðîeèêîB и С.З.Ескендирова (56) Авторское свидетельство СССР

M. 1289462, кл. А 61 В 10/00, 1984, . Авторское свидетельство СССР

М 1316679, кл. А 61 К 39/02. 1985.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для иммунологической диагностики внутриутробного инфицирования, Целью изобретения является повышение точности способа диагностики внутриутробного инфицирования.

Способ осуществляется следующим образом.

У новорожденного сразу после рождения до кормления молозивом берут кровь из яремной вены и пробу первородного кала (меконий) иэ прямой кишки. Определяют наличие специфических антител к возбудителю в преколостральной сыворотке крови новорожденного и антигенов патогена в . суспензии мекония, При обнаружении в . крови новорожденного до кормления молозивом специфических антител и антигенов в пробе мекония диагностируют внутриутробное инфицирование.

Предлагаемый способ апробирован на новорожденных ягнятах из неблагополуч„„5Ц„„1813450 А1 (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИУТРОБНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ ЯГНЯТ БРУЦЕЛЛЕЗОМ (57) Использование: ветеринария, иммунологическая диагностика, Сущность изобретения: для диагностирования внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом.

Одновременно с определением антител в сыворотке крови проводят определение антигенов в первородном кале, 2 табл. ных по бруцеллезу отар и поясняется следующими примерами, Пример 1, Для определения наличия специфических антител в преколостральной сыворотке крови ягнят с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на полистироловую 96-луночную панель для р микротитрования сорбируют единый бруцеллезный антиген в разведении 1:100 в 100 микролитрах (мкл) забуференного физиологического раствора(ЗФР) рН 7,2-7,4 при 4ОC Ф в течение ночи. Затем панель отмывают 3 (Л раза ЗФР с 0,05g, твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 (.„) раза ЗФР, готовят в лунках панели двукратные разведения преколостральной сыворотки крови (1;2 и выше) в объеме 100 мкл

ЗФР-Тв. После инкубации в течение 1,5 ч при 37 С панель отмывают описанным способом и в лунки вносят антитела кролика против иммуноглобулинов овцы, меченные пероксидазой, в рабочем разведении в

ЗФР-Тв. Через 1 ч после инкубации при

37 С повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции, 1813450 а количество связавшегося фермента, а значит, и антител против бруцеллеэного антигена определяют количественно по распаду субстрата — Н О в присутствии хромогенаортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается на фотометре при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности в 2 раза и более в лунках с испытуемыми сыворотками над контролем оценивается как положительная реакция.

Пример 2. По примеру 1 были исследованы преколостральные сыворотки крови

123 ягнят, полученных от овцематок неблагополучной отары по бруцеллезу. Из общего числа обследованных ягнят у 45,5 животных в крови обнаружены антитела к бруцеллам. Результаты ИФП сывороток крови

30 новорожденных, представлены в табл,1.

Как видно из табл.1, титры, противобруцеллезных антител в крови новорожденных были различными, Так например, если у ягнят под инвентарными номерами 3041, 3001, 3082 и 3067 титры антител были одинаковыми 1:2, тогда как с особей под номерами 3081, 3005, 3014 и 3051 значения названного показателя составили соответственно 1:8, 1:256, 1:2048 и 1:8192. Полученные данные указывают на нарушения функции плацентарного барьера, имевшие место в период суягности и возможность инфицирования плодов гематогенным путем.

Пример 3. Для исследования пробы мекония в ИФА на наличие бруцеллезного антигена ее заливают 0,85;,-ным раствором

NaCl в соотношении 1:10, гомогенезируют, прогревают 15 мин при 100 С в водяной бане, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого образца.

На полоску нитроцеллюлозной бумаги (45х5мм) в 8-ми точках наносят раствор моноклональных антител (МонАт), против антигенов бруцелл, в двукратно убывающей концентрации начиная с 160 мкг/мл в количестве 1 мкл. (В работе были использованы полученные нами МонАт, продуцируемые

"Штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus MusculvsL — продуцент моноклональных антител к бактериям рода

Brucella" Авт,св.1604848, опублик, Бюл,41, 1990ã.). Свободные участки носителя блокируют 1 бычьим сывороточным альбумином в ЗФР при 37 С 1 ч. Затем полоску отмывают по 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР и инкубируют при 37 С в течение 1 ч в исследуемом образце, Повторяют процедуру отмывки и носитель переносят в раствор

МонАт, меченных пероксилаэой, и инкубируют при 37 С 1 ч. После тщательной отмывки полоску переносят в раствор субстрата—

HgOz в присутствии 4-хлор-1-нафтола им выдерживают в течение 3-5 мин. Затем отмывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе, Положительная реакция, которая отмечается в случае присутствия в образцах бруцеллезного антигена, 10 характеризуется появлением на местах нанесения МонАт серо-фиолетовых точек.

Пример 4. По примеру 3 были анализированы 123 пробы мекания ягнят из числа исследуемых по примеру 2 и установлено наличие бруцеллезного антигена в первородном кале у 65,8 новорожденных, Результаты ИФА первородного кала 30 животных в сравнении с анализом сывороток крови, полученным по примеру 2, пред20 ставлены в табл.2, Как видно из табл.2, у 17 новорожденных выявлены как антигены бруцелл в пробах первородного кала, так и специфические антитела. Полученные данные свидетельствуют о том, что отсутствие специфических антител преколостральной сыворотке крови новорожденного не служит доказательством не инфицированности плода. Так, например, у 2 голов при рождении в крови

30 отсутствовали противобруцеллезные антитела, однако в пробах мекония выявлены антигены бруцелл. Данный пример указывает на заражение плода при нормальном функционировании плацентарного барьера

35 путем проглатывания инфицированной амниотической жидкости. У 9 голов не выявлены антигены возбудителя, однако в сыворотке крови имелись специфические антитела к бруцеллам, что является доказа40 тельством повышенной проницаемости плаценты и инфицирования плода гематогенным путем.

Способы диагностики инфекционных болезней, основанные на обнаружении ан45 тител, известны и широко используются в медицинской и ветеринарной практике. Однако обнаружение антител у новорожденных сельскохозяйственных животных еще не свидетельствуют об инфицированности

50 организма, поскольку зти антитела могут быть материнского происхождения, Если взятие крови у новорожденного будет осуществляться после скармливания молозива, то в сыворотке крови могут обнаруживаться

55 антитела материнского происхождения.

Предлагаемый способ отличается тем, что пробы крови у новорожденного берутся до первого кормления молозивом, Это очень важно, поскольку у сельскохозяйственных животных с десмохориальным и

1813450

Таблица 1 зпителиохориальным типом плацентации антитела через плэценту в организм плода не проникают, Обнаружение антител в крови у новорожденного до первого кормления молозивом свидетельствует о нарушении 5 плацентарного барьера, трансплацентарном проникновении пассивных антител или возбудителя и синтез специфических антител организмом плода.

Важным отличительным признаком 10 предлагаемого способа является и то, что по этому способу проводятся также исследования первородного кала на наличие антигенов возбудителя. Обнаружение антигена является непосредственным доказательст- 15 вом инфицирования плода.

Комплексное определение в преколострэльной сыворотке крови антител и в первородном кале антигенов возбудителя также . является важным отличительным призна- 20 ком, поскольку позволяет более достоверно выявлять животных, инфицированных в фетальный период развития.

Существенным признаком предлагаемого способа является и то, что для обнару- 25 жения антигенов возбудителя использовались не поликлональные сыворотки, э моноклональные антитела высокой специфичности, что позволяет исключить ошибки, обусловленные реагированием ан- 30 тител с родственными энтигенами различных возбудителей.

Отличительные признаки, характерные 35 предлагаемому способу, являются весьма существенными, а их совокупность позволяет значительно повысить точность диагностики. Доказательством существенности 40 признаков является непосредственное обнаружение антигенов возбудителя в организме новорожденного.

Основанием для суждения о внутриутробном инфицировании по известному спо- 45 собу является 4-кратное превышение титров антител у новорожденного по сравнению с материнским организмом. Действительно, антитела образуются в организме в ответ на действие антигенэ. Однако синтез антител и накопление их в крови зависит от многих факторов: дозы энтигенэ и кратности его поступления, состояния иммунной системы, условия кормления, содержания и многих других, Поэтому они являются косвенным показателем инфицирования.

Предлагаемый способ основан нэ обнаружении антигенов возбудителя в организме новорожденного, т,е. прямого показателя инфицирования, Эффективность диагностики обусловлены комплексным определением в организме как специфических антител, так и антигенов возбудителя. Результаты исследований (см.табл.2) свидетельствуют о том, что встречаются животные (3044, 3078) в сыворотке которых антитела отсутствуют при наличии антигена в организме. Также имели место случаи, когда антиген отсутствовал, а антителэ обнаруживались в диагностических титрах (3005, 3081, 3029, 3006, 3049, 3069, 3041, 3001). Комплексное обнаружение в организме антител и антигенов возбудителя позволяет избежать диагностических ошибок и своевременно принять меры по профилактике болезни у новорожденных, Эффективность диагностики повышена также за счет использования моноклональных антител, Последние обеспечили повышение чувствительности реакции по обнаружению антигенов до 1 нг/мл, Формула изобретения

Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом путем определения антител в сыворотке крови, о тл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения точности способа, одновременно с определением антител в сыворотке крови проводят определение антигенов в первородном кале.

1813450

Продолжение таблицы 1

Примечание. За значение оптической плотности (ОП) контроля взят средний показатель

ОП 10 проб преколостральных сывороток новорожденных ягнят благополучной по инфекционным и незаразным болезням опары по аналогичной схеме постановки ИФА.

0 — специфические антитела не обнаружены, Таблица 2

11

12

13

14

16

17

18

19

21

22

23

24

26

27

28.

29

3007

3027

3001

3034

3024

301,5

3008

3003

3081

3082

3033

3078

3029

3006

3053

3049

3067

3036

3026

3004

3069

Конт оль

0,528

0,609

0,339

0,161

0,479

0,560

0,492

1,005

0,360

0,365

0,632

0,144

0;359

0,348

0,631

0,533

0,438

0,518

0,103

0,981

0,408

0,332

0,153

1:128

1:1024

1:2

1:256, 1:512

1:16

1:4096

1:8

1;2

1:256

1:16

1:4

1;2048

1:128

1:2

1:256

1:4096

1:16

1:8

1О

1813450

Продолжение таблицы 2

Составитель И.Крушина

Техред М.Моргентал Корректор А.Обручар

Редактор

Заказ 1795 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Примечание. В качестве контрольного образца использовались пробы меконий новорожденных ягнят благополучной по инфекционным и незаразным болезням отары, . Чувствительность использованного ИФА по отношению к бруцеллезному антигену соста вила 1 нг/мл.