Способ выявления ингибиторов синтеза стеринов микробного происхождения

Способ выявления ингибиторов синтеза стеринов микробного происхождения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: микробиологическая и медицинская промышленность, биотехнология . Сущность изобретения: испытуемый микроорганизм-продуцент культивируют в жидкой питательной среде, культуральную жидкость фильтруют и фильтрат экстрагируют этилацетатом. Тест-культуру дрожжи Rhodotonlla glutinls ВКПМ Y-1337 засевают в жидкую среду, содержащую ловастатин или этилацетатный экстракт, и выращивают в условиях умеренной аэрации при 22 - 24°С. Выросшие дрожжи отделяют.и переносят в свежую питательную среду, содержащую 0,5 - 1,0 мкг/мл нистатина или амфотерицина. Наличие ингибиторов синтеза стеринов определяют по достоверному приросту биомассы дрожжей. Способ позволяет выявить в культуральной жидкости микроорганизма-продуцента ингибитор синтеза стеринов различной химической природы даже в присутствии других функциональных и фунгистатических веществ. 4 табл.5 ил. ел С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (39) (! t) (si>s С 12 Р ЗЗ/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 . (21) 4854364/13 (22) 24.07.90 (46) 07.05.93. Бюл. М 17 (71) МГУ им. М. В. Ломоносова (72) Н. С, Егоров, Н. С. Ландау, Н.А. Баранова, В. Г. Крейер. С. Н. Выборных и Л, И. Буяк (56) M. Kuroda and А. Endo "Inhibition of In

vItro cholestегоl synthesis by fatty acIds"„

Blochem. Biophys. Acta,36, 1977, 70 81.

W. RobIn, R. Jasper ""Transmission"

electron microscopy and ImmunocytochemfcaI

studies of yeast: analysts of HMG-CoA

reductase overproductIon by electron . microscopy", Meth. СеП. Biol., 31., San Diego, et;, 1989, 473 — 512.

ikeura R., IVlurakawa S., Endo А. "Growth

InhIbItion of yeast by compactin (ЬП=236) . analogues. The Jouãnàl of Antibiotics,41%8, 1148 — 1150, 1988. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА СТЕРИНОВ МИКРОБНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии и представляет собой способ быстрого и эффективного скрининга микробных метаболитов, обладающих ингибирующим действием на образование стеринов животными и микробными клетками.

Задача выявления продуцентов ингибиторов синтеза стеринов, в частности холестерина, имеет важное практическое значение в связи с разработкой способа получения отечественных гиполипиденимических препаратов, применяемых для лечения атеросклероза, (57) Использование: микробиологическая и медицинская промышленность, биотехнология. Сущность изобретения. испытуемый микроорганизм-продуцент культивируют в жидкой питательной среде, культуральную жидкость фильтруют и фильтрат экстрагируют этилацетатом. Тест-культуру дрожжи

RhodotonIla gIutinls ВКПМ Y-1337 засевают в жидкую среду, содержащую ловастатин или этилацетатный экстракт, и выращивают в условиях умеренной аэрации при 22—

24 С. Выросшие дрожжи отделяют.и переносят в свежую питательную среду, содержащую 0,5 — 1,0 мкг/мл нистатина или амфотерицина. Наличие ингибиторов синтеза стеринов определяют по достоверному приросту биомассы дрожжей, Способ позволяет выявить в культуральной жидкости микроорганизма-продуцента ингибитор синтеза стеринов различной химической природы даже в присутствии других функциональных и фунгистатических веществ. 4 табл. 5 ил.

Способ позволяет определить наличие в культуральной жидкости микроорганизмапродуцента ингибитор синтеза стеринов различной химической природы даже в присутствии других фунгицидных и фунгистатических веществ, так как последние не затрагивают синтез стеринов.

Теоретической предпосылкой предлагаемого решения является способность полиеновых антибиотиков, в том числе нистатина и амфотерицина В, взаимодействовать со стерйнами клеточных мембран грибов и дрожжей, что приводит к наруше3 1813785 е 4 нию их проницаемости, потере клетками К+ Выявление ингибиторов синтеза сТерАи их гибели, нов в культуральной жидкости микромицеВ связи с этим предлагаемый способ тов — предлагаемых продуцентов этих выявления ингибиторов синтеза стеринов соединений включает в себя следующие при наличии в культуральной жидкости мик- 5 процедуры. Микромицеты (Asperglllus sp., роорганизмов нескольких веществ фунги- Penlcllllumsp.uMucorsp.).предполагаемые статического и фунгицидного действия .продуценты ингибиторов синтеза стеринов, основывается на выявлении устойчивости к выращивают на скошенном сусле-агаре в полиеновымантибиотикамучувствительно- течение 10 — .14 дней, затем мицелий со

ro к ингибиторам синтеза холестерина 10. спорами переносят в качалочные колбы со штамма дрожжей Rhodotorulla rubra ВКПМ средой известного состава и выращивают в

Y-1337 после выращивания их в среде с ин- течение двух дней. гибиторами синтеза стеринов, возникаю- Полученный мицелий используют в Кащей в результате предварительного честве посевного -материала и проводят выращивания дрожжей с ингибиторами "5 культивирование микромицетов в качалочсинтеза стеринов микробного происхожде- ных колбах при 28 С в ферментационной, йия...: среде определенного состава в течение сеПри проведении модельных экспери- .. ми дней. ментов способ включает выращивание чув- Мицелий отделяют фильтрованием и ствительных к ингибиторам дрожжей Rh. 20 гидрофобные вещества из подкисленной до гцЬга ВКПМ Y-1337 на йзвестной среде, со- " рН 3- 4 культуральной жидкости извлекают держащей глюкозу 0,5%, "Yeist nitrogen, этилацетатом, упаривают и остаток испольbise" фирмы Дифко 0,67% с добавлением зуютдля определения.наличия ийгибиторов ийгибитора синтеза стеринов — ловастатина . синтеза стеринов, испдльзуют для этого в в концентрациях 0,5 — 1,0 мкг/мл (в контра- 25 качестве тест-организма Rh. rubra.ВКПМ Yле ловастатина нет), при рН 5,3 в условиях 1337, в два этапа. умеренной аэрации на качалке йри 22 - .На первом этапе посевной материал

24ОС, Затем на втором этапе выросшие дрожжейвыращиваютнаскошеннойсреде, клетки культивируютв свежей средетого>ке содержащей .0,67% "Nitrogeq amino acid состава с добавлейием нистатина или амфо- 30 base" фирмы "Dlfco", 0,5% глюкозы и 1,5% терицина В в концентрации 0,5- 1,0 мкг/мл. агар-агар, рН 5.3 при комнатной температуКультивирование осуществляют в тех же ус- ре(23-25 С) в течение 48 ч, Клетки отмываловиях, что и на первом этапе. Рост клеток: ютстерильным физиологическим раствором, дрожжей в присутствии полиеновых анти- -: и вносят вопытныесреды из расчета %10"; биотиков оценивают по приросту оптиче- 35 кл/мл. Выращивание проводят глубинным ской плотности нафотоэлектрокалориметре способом, на качалке при 25ОС. В опытные при 530 нм, -:, .: -:,,.: . варианты вносят по 100,200 и 300 мкл этиКак видно из результатов, приведейных - лацетатного экстракта из культуральной в табл, 1, дрожжи, вйращеннйе в присутст- ":.жидкости микромицета. Ингибирование ровии ингибитора синтеза.стеринов (ловаста- 40 ста дрожжей оценивают по оптической тина), приобретают устойчивость к, плотности при 530 нм посравнениюс контполиеновым антибиотикам (нистатину и ам- ролем (рост дрожжей без испытуемого вефотерицину В, т. е. в их присутствии наблю- щества), дается достаточно интенсивный рост На втором этапе определяют степень дрожжей в отличие от контроля и прототипа, 45 устойчивости дрожжей, выращенных в срегдеростпрактическиотсутствует. де с испытуемым веществом, к нистатину

Предлагаемый способ позволяет выя- так, как описано в примере 1. вить наличие ингибиторов синтеза стеринов .: Результаты табл,3 показывают, что возв культуральной жидкости продуцента даже можны три. варианта. 1. Когда микромицет в случае образования им нескольких соеди- 50 выделяет в среду ингибиторы синтеза стенений фунгистатического и фунгицидного ринов,определяемые поподавлениюроста действия. тест-организма на первом этапе и усилению его роста на втором этапе (в присутствии

Так, клетки, выросшие в присутствии по- нистатина). 2. Когда микромицет не образувастатина и нистатина одновременно, по- 55 ет ингибиторы синтеза стеринов, что видно сле выращивания их на втором этапе, в по отсутствию подавления роста тест-оргабреде с одним нистатином приобретают ус- низма на первом этапе и отсутствию роста тойчивость к последнему. Как показывают на втором этапе.. данные табл. 2, рост наблюдается только у 3. Когда микромицет образует вещестопытных клеток. ва, ингибирующие рост тест-организма нв

1813785 первом этапе, но не являющиеся ингибиторами синтеза стеринов, что видно из отсутствия роста тест-организма на втором этапе в присутствии нистатина. (табл. 3).

П риме р1 Дрожжи Rh. rubra ВКПМ 5

Y-1337, выращенные на сусло-агаре, высевают в жидкую среду. содержащую глюкозу

0.5, "Yeast nitrogen base" фирмы Дифко

0,67, с добавлением ловастатина 0,5 мкг/мл(в контроле ловастатина нет), рН 5,3. 10

Культивирование проводят в пробирках объемом 20 мл с 3 мл среды на качалке (100 — 120 об/мин) при 23 С в течение 48 ч.

Клетки стерильно отделяют от среды центрифугированием (3 тыс, об/мин) в течение 15

10 мин отмывают стерильным физиологическим.раствором и переносят в свежую среду того же состава с добавлением нистатина

0,5 мкг/мл и через 30 ч культивирования оценивают рост клеток дрожжей при опти- 20 ческой плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм. Клетки. выращенные на среде с ловастатином, оказываются более устойчивыми к нистатину в концентрации

0,5 мкг/мл (фиг. 1)., 25

Пример 2. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением в среду на первом этапе 160 мкг/мл ловаста, тина (в контроле ловастатина нет), а на втором этапе — 1,0 мкг/мл нистатина. По- 30 сле 30, 50 и 58 ч культивирования дрожжей на втором этапе оценивают рост клеток по оптической плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм. Клетки, выращенные на среде с 1,0 мкг/мл ловастатина, из-эа 35 сниженного под его воздействием содержания эргостерина в мембранах клеток оказываются устойчивыми к 1,0 мкг/мл нистатина (фиг. 2).

ll р и м е р 3. Дрожжи выращивают, как 40 описано в примере 1, но с добавлением на втором этапе вместо нистатина амфотери цина 0 5 мкг/мл, после чего рост клеток через 60 ч культивирования оценивают по оптической плотности на фотоэлектроко- 45 лориметре при 530 нм. Клетки, выращенные с 1,0 мкг/мл ловастатина, устойчивы к амфотерицину в испытанной концентрации (фиг. 3).

Пример 4. Дрожжи выращивают, как 50 описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе 1,0 мкгlмл ловастатина(в контроле ловастатина нет), а на .втором этапе

1,0 мкг/мл амфотерицина, после чего оценивают рост через 72 ч культивирования по 55 оптической плотности на фотозлектроколориметре при 530 нм, Клетки, выращенные на среде с добавлением 1,0 мкг/мл ловастатина, устойчивы к 1,0 мкг/мл амфотерицина (фиг, 4).

Пример 5. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе одновременно с ловастатином (0,5 мкг/мл) нистатина (0,1 мкг/мл), а на втором этапе с добавлением 2,0 мкг/мл нистатина, после чего оценивают рост клеток через 74 — 82 ч культивирования по оптической плотности на фотоэлектроколориметре при 530 нм. Дрожжи, выросшие на среде с ингибитором синтеза стеринов к антибиотикам, приобретают устойчивость к полиеновым антибиотикам, в данном случае, к нистатину (фиг. 5).

Пример 6. Дрожжи выращивают, как описано в примере 1, но с добавлением на первом этапе вмесro ловастатина по 200 и

300 мкл этилацетатного экстракта из культуральной жидкости Asperglilus sp.

Ингибирование роста дрожжей оценивают по изменению оптической плотности при 530 нм на фотоэлектроколориметре по сравнению с контролеь1 (рост дрожжей без добавления в среду испытуемого вещества).

На втором этапе определяют степень устойчивости дрожжей, выращенных в среде с испытуемым веществом, к нистатину, как описано в примере 1. Результаты табл.

4 показывают, что этилацетатный экстракт из культуральной жидкости Aspergillus sp. ингибирует рост дрожжей в количестве 200 и 300 мкл и при этом дрожжи приобретают;

1. устойчивость к нистатину, что указывает на наличие в этилацетатном экстракте гриба ингибитора биосинтеза стеринов (табл. 4) Формула- и э о брет". н и я

Способ выявления ингибиторов синтезастеринов микробного происхождения, включающий выращивание тест-культуры дрожжей в жидкой питательной среде в присутствии ингибитора синтеза стеринов с последующим определением количества биомассы дрожжей, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности способа, предварительно культивируют микроорганизм-продуцент ингибиторов синтеза стеринов, полученную культуральную жидкость фильтруют и фильтрат экстрагируют атил ацетатом, в качестве тест-культуры дрожжей используют штамм

Rhodotorulla rubra BKllM Y-1337, выращивание осуществляют в условиях умеренной аэрации при 22 — 24 С, при этом в качестве ингибитора синтеза стеринов в питательную среду вводят этилацетатный экстракт, выросшие дрожжи отделяют, переносят в свежую питательную среду с добавлением нистатина или амфотерицина в концентрации 0,5 — 1,0 мкг/мл, проводят культивирование в тех же условиях и выявляют наличие

1813785

Таблица 1

Устойчивость к полиеновым антибиотикам дрожжей Rh. rubra 8КПМ Y-1337, выращенных в среде с ловастатином.

Таблица 2 а

Устойчивость к полиеновым антибиотикам дрожжей Rh. rubra 8КПМ Y-1337, выращенных в среде с ловастатином и нистатином. ингибиторов синтеза стеринов в продуктах метаболизма микроорганизма-продуцента. по достоверному приросту биомассы дрожжей.

1813785

Таблица 3

Таблица 4

Рост дрожжей Rh. rubra ВКП(4 Y-1337 в среде с этилацетатнцм экстрактом Asperglllus зр. и изменение чувствительности дрожжей к нистатину.

Рост дрожжей Rh. rubra ВКПМ Y-1337 в среде с этилацетатными экстрактами микромицетов и чувствительность дрожжей к нистатину.

1813785

> ОЮ

4 Р?

В . 6lf ф

ХЮч Z

Яга f ах

ОЯ

b0e.

Риг.5

К

РиаХ

Составитель H. егоpos

Редактор С. Кулакова Техред М,Моргентал: Корректор С. Юско

Заказ 1812 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рэушская наб., 4/5 дФ

Ц

М

4" 03

И g7 > 0f

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101