Способ определения антител к лептоспирам

Способ определения антител к лептоспирам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: медицинская биохимия , серологические способы диагностики инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: в качестве антигена используют комплекс стафилококка Кован 1, с гиперимунной лептоспирозной сывороткой, коньюгированный с каталазой. 1 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4874863/14 (22) 18.10.90 (46) 07.06.93. Бюл. N. 21 (71) Среднсазиатский научно-исследовательский противочумный институт и Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии. (72) H,Â.Рудь, В,А.Шамардин, 8.М.Степанов и IG.П.Солодовников (56) Лаб. дело, — 1987, N 4, с. 319-321.

Изобретение относится к медицине, в частности, к серологической диагностике инфекционных болезней.

Цель изобретения — повышение чувствительности иммуноферментного метода при определении пептоспирозных антител.

Укаэанная цель достигается тем, что гипериммунная лептоспирозная сыворотка предварительно адсорбируется на взвесь инактивированных клеток стафилококка штамма Кован 1 и весь комплекс метится .ферментом каталазой.

Заявляемый способ отличается от прототипа сочетанием новых условий: использование взвести стафилококка дпя ориентации . антител к пептоспирам и мечение комплекса стафилакокк-антитела к лептоспирам ферментом каталазой, Эти особенности позволяют улучшить условия связывания антител с антигеном на планшете. что повышает чувствительность метода, повысить содержание каталазы на комплексе, что также повышает чувствительность метода. проводить определение антител к лептоспирам в сыворотках. независимо от их видового происхождения.

„„5U„„ 1820325А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

ЛЕПТОСПИРАМ (57) Использование: медицинская биохимия, серологические способы диагностики инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: в качестве антигена используют комплекс стафилококка Кован 1, с гиперимунной лептоспирозной сывороткой, коньюгированный с катапазой. 1 табл.

При изучении патентной литературы по постановке иммуноферментного метода при определении антител к лептоспирам сходных признаков по существу заявляемого способа авторами не обнаружено. С

fl р и м е р . Приготовление коньюгата по предлагаемому способу. К 1 мл 20 млрд взвеси инактивированного прогреванием в ) кипящей водяной бане в течение 5 мин стафилококка.штамма Кован 1 добавляют 1 мп лептоспирозной сыворотки в разведении

1:20. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 60 мин при 40 С после чего триж- C) ды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида (,А) натрия путем центрифугирования при 3000 Я об/мин в течение 10 мин. Осадок нагружен- {Л ного антитепами стафилококка ресуспендируют до 1 мл и добавляют каталазу в обьеме .1

1 мл из расчета 5 мг/мл, перемешивают и вносят 0,1 мл 1%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3 ч и трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% твина-20. Осадок суспендируют в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. содержащего 0,05% твина-20.

1820325

15

30

50

Для мечения комплекса стэфилококкантитела к лептоспирам нами использована каталазэ. производства США Caibiochom активностью 8512 IU/mg.

Параллельно готовили коньюгаты пероксидэзы хрена с натиглабулиноеыми сыворотками (Горьковский НИИЭМ) по известному способу и кроме того, использовали коммерческую тест-систему (Стаеропольский НПО "Аллерген" ) для определения антител к лептоспирам, На планшеты Ленинградского завода полимеров наносили лептоспироэный радоспецифический антиген в дозе 10 мкг /мл.

Планшеты выдерживали не менее 24 ч при комнатной температуре и трижды промывали 0,9%-ным раствором хлоридэ натрия, содержащего 0,05% теина-20. Кроме того, применяли планшеты. сенсибилизированные лептоспироэным родоспецифическим антигеном, производства НПО "Аллерген", Рабочие разведения полученных коньюгатов определяли путем прямой постановки ИФА (планшет с адсорбированным антитегном + коньюгат в разведениях от

1:50 до 1:3200). Результат ИФА регистрировали визуально, При постановке основных опытов на планшеты с адсорбираеанным антигенам наслаивали гомологические и гетерологические сыворотки от больных с диагнозом лептоспироз, шигеллез, эшерихиоэ, подтеержденными бактериологически. и гипериммунные сыворотки лептоспироэные, шигеллезные и эшерихиозные. Сыворотки наслаивали в объеме 0,1 мл в разведенных от 1:25 до

1:51200. После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0.9%-ным раствором хлоридэ натрия, содержащего 0,05% теина20, Далее в планшеты вносили коныогаты е рабочем разведении: собственного приготовления — 1: 800, э коммерческие — согласно инструкции; прилагаемой к тест-системе.

После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05% теина-20.

Для проявления каталазы в планшеты вносили по 0,025 мл 0,3% раствора перманганата. а перед этим за 30 мин — 0,0015%ный раствор перекиси водорода. В случае присутствия каталазы происходит разложение перекиси водорода и перманганат калия не теряет своей фиолеговой окраски. В присутствии перекиси водорода перманганат калия эа несколько секунд меняет цвет на ярко желтый. Проявление пероксидазы проводили хромогенной смесью. состоящей из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. В случае присутствия пероксидазы цвет в лунках — коричневый или коричнево-розовый. При отсутствии— цвет слабо розовый или бесцветный. Проявление фермента в тест-системе проводили согласно инструкции.

Сравнительная чувствительность определения антител и специфичность предлагаемого метода приведены в таблице, Сравнительная чувствительность методов показала преимущества предлагаемого способа в 2-4 раза по сравнению с известным методом определения антител к лептоспирам. Результаты реакции после внесения перманганата калия четкие, появляются через несколько секунд и сохраняются е течение нескольких дней.

Специфичность предлагаемого метода проверена при внесении в планшеты с адсорбированным лептоспироэным антигеном гомологичных и гетерологичных антисывороток(таблица). Как показано, специфичность всех изучаемых методов оказалось достаточно высокой и аналогичной, Таким образом, нами разработано новое техническое решение постановки иммуноферментного метода на основе каталээы, имунной лептоспироэной сыворотки и взвеси стафилококка штамма Кован 1, с более высокой чувствительностью определения антител к лептоспирам.

Формула изобретения

Способ определения антител к nemocпирам, включающий адсорбцию антигена на твердофазном носителе, инкубацию с иммунной сывороткой и визуалиэирующим агентом. отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, е качестве антигена используют комплекс гипериммунной лептоспирозной сыворотки, адсарбироеэннай на инактивированные клетки стафилакокка штамма Кован и коньюгированный с каталаэай".

1820325

Чувствительность и специфичность методов на примере нескольких cvwopOTow гезультат реакции ю окраске в лунках при разек,енин лептослмрозной сыворотки11/Т) Ие тол

Контроль>« . лунки

«4ю

400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 l 2 3 4 к к кр б б б б б б б

Известный к

ПредлагаеВ%М w

w w w w w Р P х р х

Тест-система б б б 6 с с с с

При разведении шнгеллезной сыворотки - 1/т

25 50 100 200 400 800 1600 3200 1 2 3 4 б б б б б б G

Известный б б б б

Предлагаеi%IN P

P P P с с с

Р с с

Р w Р с С

Тест-система с

1 при разведении эшермхиоэной сыворотки I/ò

1 2 3 4

Известмьй б б б 6 б б 6 б б б 6

П редлаг аеi%IN

P Р P Р Р P P P

То хе на планшете Ставропольского 160 ндллерген"

Р w Р прн разведении лептоспнроэной сыворотки

400 800 1600 3200 6400 1с800 25600 51200 1 2 б б 6 6 б б

Известный к к к

tcp

Предлагае >й w w M

P R P w Р ж .м

Тест-систеN8 б б 6 б с с прн разведении шигеллеэной сыворотки 1/Т:

25 50 100 200 400 800 1600 3200

l 2 3 б б б б б. б б 6

Известный

Предлагаемый

Р P P P Р P P P

Тест-систес с с с с с с с с при разведенми эшерихиоэной сыворотки 1/Т б 6 6 6 6 б 6 б

Известньй

Предлагаемьй

Р Р Р D P . P P Р w Р ее в «ее»

П р и и е ч а н м е. к - коричневый цвет, кр - коричнево-розовый, 6 - бесцветный, р - розовый, w - хелтьй, с - сини3.

Контрольные лунки l - без антигена, 2 - без сыворотки, 3 " "Gåç конывгата, 4 - беэ перекиси водорода

Составитель В.Шамардин

Техред M.Mîðãåíòýë Корректор С.Юско

Редактор

Производственно-издательский комбинат Патент . r. Ужгород, у . р

У л.Гага ина, 101

Заказ 2028 Тираж ям и и ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при

113035, Москва. Ж-ЗЬ, Раушская наб.. 4/6