Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине

Способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочевине

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатринтетазу, устойчивую к гербициду. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантные плазмидные. ДНК, кодирующие мутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети Brassica, или картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатника , или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры, проводят культивирование каллусной ткани и получают регенеранты, устойчивые к гербициду. 14 табл. ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 15/84

ГОСУДАРСТВЕН.!ОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4356001/13 (62) 4203296/13 (23) 25.08.87 (22) 30.06.88 (46) 07,06.93. Бюл. N. 21 (31) 900609 (32) 26.08.86 (33) US .(71) Е.И.ДюпонДе Немур Энд Компанй (US) (72) Джон Роберт Бедбрук, Рой Скотт Чэлэфф,. Саверио Карл Фалько, Барбара Джин

Мазур (US) и Нарендра Синг Ядав (lN)

-(56) Chaleff R.S. u Ray ТЯ. Herbicide

Resistant Mutants from Tobacco .Cell

Cultures, Science v.223, 1984, рр. 1148-1151.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтазу, устойчивую к гербициду.

: . Сульфометуронметил и хлорсульфурон ингибируют рост некоторых .бактерий, дрожжей и вьйзйих растений путем ингибироввния,ацетолактатсинтазы (АЛС). первый общий фермент в биосинтезе аминокислот (валин, лейцин и изолейцин) с разветвленной цепью, Три основйых изофермента АЛС, : обозначеннце 1, И и И1, идентифицированы в кишечных бактериях. Изрферменты i и И!, но нв И, являются чувствительными к ингибированию конечного продукта валином.

Каждый из трех бактериальных изоэнзимов содержит большую и малую субъединицы белка. Энзимы АЛС из дрожжей Saccharomyces cerevislae и из некоторых высших рас„„ЯЦ„„1820914 А3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУДОЛЬНЬ!Х

РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К СУЛЬФОНИЛМОЧЕВИНЕ (57) Использование: генетическая инженерия, в частности получение фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих ацетолактатсинтетазу, устойчивую к гербициду. Сущ-. ность изобретения: конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие цутантную ацетолактатсинтетазу табака, трансформируют полученными ДНК клети

Brass!ca, или.картофеля, или табака, или сахарной свеклы, или дыни, или хлопчатни.ка, или люцерны, отбирают трансформированные клетки, получают суспензионные каллусные культуры. проводят культивирование каллусной ткани и получают регенеранты, устойчивые к гербициду. 14 табл. г тении частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибирования ко- а нечного продукта..Неизвестно, состоят ли Qp энэимы АЛС.дроссей и растений из одного или более различных полипептидов. Данные дают. основание предполагать, что местоположение энзимов АЛС дрожжей и О растений находится соответственно в митохондриях и хлоропластах. ф

Известно выделение генов, кодирующих анаимм АЛС иа кишечимх бактерий ба!топера typhimurlum u Eschurlchis coll, а также дрожжей S.ñåãåvisiàå. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих две субъединицы иэоэнзимов i. И и li! АЛС

E.ñîli, показывают, что они организованы как опероны ifvBN. ilvGM u ilvlH соответственно. Сравнение. выведенных аминокислотных .последовательностей больших

1820914 субьединиц иэоэнзимов АЛС Е.coll показывают три участка, содержащих приблизительно 50ф, консервативных аминокислот, на приблизительно 2/3 состоящих из бел,ков и разделенных участками с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокиспотные последовательности встречаются также и среди малых субъединиц бактериальных изоферментов. В дрожжах S,cerevislae был идентифицирован единственный ген ILV2, 10 кодирующий активность АЛС. Анализ нуклеотидной последовательности гена ILV2 выявил, что полипептид, кодируемый им, гомологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Аминокислотная последовательность АЛС дрожжей. характе. ризуется такой же структурной организацией и степенью гомолагии, которая наблюдается между большими субъединицами бактериальных изоферментов, за исключением того, что около 20 девяноста аминокислот в аминоконце дрожжевого белка обеспечивают перенос белка в митохондрию, Ранее не было никакой информации относительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последователь- 25 ности энзимов АЛС растений, Изофермет! кишечных бактерий представляет собой единственную известную

АЛС в природе, которая является нечувствительной к ингибированию сульфометурон- 30 метилом и хлорсульфуроном. Поэтому кишечные бактерии чувствительны к этим . гербицидам только в присутствии валина, который ингибирует изофермент I. Идентифицированы сульфонилмочевинные герби- 35 цидустойчивые мутантные формы кишечных бактерий Salmonella typhimurlum и Е.соН (отобранные в присутствии валина), дрожжей S.cerevisiae и высших растений

Nicotiana tabacum. (табак), Arabldopsis 40

thaliana M Zea mays (кукуруза) .Эти мутантные фенотипы совместно расщепляются к гербицидустойчивым формам АЛС посредством генетических кроссов. ВЗ typhimurium гербицидустойчивые мутации связаны 45 с геном, кодирующим АЛС, а в E.coll u

5.cerevisiae эти мутации заключены в структурных генах для АЛС. В высших растениях мутации, ответственные за устойчивость, наследуются как единственные доминант- 50 ные или полудоминантные ядерные призна. ки. В табаке эти мутации картируются по одному из двух несцепленных генетических локусов. Хотя многие гены; вовлеченные в структуру и функцию дифференцированных 55 растительных тканей и органов, не экспрессируются в недифференцированных тка- нях, те, которые учасгвуют в основных клеточных функциях, экспрессируются и могут быть отобраны в дезорганизированном каллюсе или культуре. клеточной суспензии.

Это демонстрировалось во многих случаях путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растения, экспрессирующие такой же фенотип, Известен способ получения двудольных растений, устойчивых к сульфонилмочввине, предусматривающий получение суспензионных каллусных культур, отбор клеток, культивирование. каллуса и получение регенерантов, устойчивых к гербициду.

Поскольку ацетолактатсинтетаза представляет собой энзим, вовлеченный в аминокислотный биосинтез, было продемонстрировано, что гены, кодируЮщие этот фермент, экспрессируются в каллюсовой ткани так же, как и в целом растении. Мутанты табака $4, С3 и Нга. устойчивые к сульфонилмочевине и описанные в этом патенте, вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы в целые растения, в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом.

Каллюсные ткани, происходящие от регене- рированных растений или их потомства, продолжают расти при концентрациях гербицида, которые ингибируют рост каллюса дикого типа, Таким образом, устойчивость к гербициду на основе счльфонилмочевины на клеточном. уровне растений указывает на устойчивость на уровне целого растения, Существуют ограничения для получения гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений посредством тканевой культуры или обработки семян мутагеном: 1) метод культуры тканей ограничен теми культурами растений, которые могут подвергаться манипулированию в тканевой культуре и регенерации из тканевой культуры, 2) растения, происходящие от обработанных мутагеном семян и может быть из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют отщепления многочисленных генетических обратных скрещиваний и

3) перенос устойчивого гена путем размножения был бы ограничен культурными сортами одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществления. многократных генетических обратных скрещиваний, Поэтому выделение фрагмента. нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость, и его последующее введение в сельскохозяйственные культурьг посредством генетической трансформации позволяет осу. ществить быстрый межвидовой перенос гербицидной устойчивости и устранить многие из укаэанных ограничений, Многие гены. выделенные иэ одного растения, были введены и экспрессированы в других растениях, нерастительные гены

1820914

3D

40

50 были экспрессированы в растениях только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерасгительных генов были сплавлены с растительными регуляторнымй последовательностями, необходимыми для экспрессии генов. Однако было бы трудно ввести гербицидную устойчивость в растения путем введения химерных генов, состоящих иэ бактериальных или дрожжевых генов, кодирующим гербицидустойчивую форму АЛС, поскольку а) эти микробные АЛС-энзимы, как полагают, не содержат специфической сигнальной (транзитной) пептйдной последовательности, необходимой для ввода в растительные хлоропласты, представляющие собой клеточное местоположение растительной АЛС, б) бактериальные изоферменты состоят из двух различных полипептидных субъединиц и в) микробные АЛС-ферменты не могут функционировать оптимально в чужеродной клеточной среде высших растений. Следовательно, существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛС и которые придают гебицидную устойчивость, когда они введены в гербицидчувствительные растения.

Предлагается использование фрагмента нуклеиновых кислот, кодирующего ацетолактатсинтетазу растений, встроенного s конструкцию нуклеиновых кислот, используемую для трансформации растений, содержащих ацетолактатсинтетазу дикого типа, которые являются чувствительными к гербицидному соединению сульфонилмочевины,.причем указанный фрагмент нуклеиновых кислот имеет по крайней мере одну точковую мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислотдикого типа, кодирующего ацетолактатсинтетазу растений таким образом, что при трансформации указанной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение приобретает устойчивость к внесению гербицидного соединения сульфонилмочевины.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Получение фрагментов ДНК, кодируюtwx. гербицидустойчивую АЛ С.

Каллюснеые культуры чувствительного к гербициду.табака (Nicotiana tabacum, разновидность ХощЫ) подвергают воздействию сульфомвтуронметила при 2 ч. на млрд;

Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные СЗ и S4. Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что каждая из линий СЗ и S4 несет единственную полудоминантную ядерную генную мутацию, отвечающую за признак устойчивости к гербициду, а также то, что мутации СЗ и S4 не связаны генетически, т.е. находятся в. различных генах, обозначенных

SURA u SURB соответственно. Как показывает анализ, линии СЗ и S4 продуцируют активность энэима -АЛС, в 100 раэ более устойчивого к сульфонилмочевинным гербицидам-хлорсульфурону и сульфометуронметилу, чем АЛ С дикого типа. Устойчивость АЛС

10 к гербициду в генетических кроссах выделяется вместе с устойчивостью к ингибированию роста гербицидами. Наблюдение двух различных генов, которые мутировали с образованием гербициду- стойчивой АЛС, не было неожиданным, поскольку йлаЬасит, как полагают, представляет собой аллотетраплоид; . образованный иэ йлоаеп1оэИога(з и N.sylvestris, по сущестау содержащих два полных генома. Так, каждая клеточная линия СЗ и S4 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Клеточную линию $4 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ч. на млрд., избирательная концентрация которого пол25 ностью ингибирует. рост S4. Идентифициру-. ют клеточные линии, устойчивые к 200 ч. на млрд., одну такую линию обозначают Нга.

Испытания показывают, что Hra выдерживает концентрации сульфомету- ронметила, которые в 1000 раз выше, чем те, которые требуются для полного ингибирования роста калл юса дикого типа. Как показывает анализ, линия Hra кросс устойчива к хлорсульфурону. Растения регенерируют из каллюсных культур Hra. Генетический анализ растений показывает, что мутации Hra u

S4 связаны, что говорит о том, что линия Hra содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительной линии S4. Определяют активность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растениях табака гомозиготного мутанта Hra. Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Hra приблизительно в

1000 раз более устойчива к хлорсульфурону, чем активность растений дикого типа

Для. того, чтобы клонировать устойчивый к гербициду ген АЛС, ДНК табака выделяют из гомозиготной мутантной линии $4

Й1со !апа tabacum. Порции по 50 г каллюсной ткани замораживают в жидком Nz и затем лиофилиэуют, Полученную высушеннун ткань потом измельчают при температуре около 23 С в мешалке с использованием 15секундных. импульсов до превращения в по55 рошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора {О;3 М сахарозы; 50 мМ трис-НО рН 5; 5 мМ MgClg} прибавляют к смеси и полученную суспензию инкубируют при 0 С

s течение 5.мин. Суспензию фильтруют черве марлю и цеитрифугируют лри 350 х g u

1820914 течение 10 мин. Ядерный осадок в виде гранул ресуспендируют в лизисном: буферном растворе (20.мМ ЭДТК, 50 мМ трис-HCI pH

8, 1 Sarkosyl), прибавляют CsCI с получением 0,95 r на мл буферного раствора и полученную смесь центрифугируют при

17000 х g в течение 20 мин при 4 С. Зтидий бромид прибавляют к полученному супернатанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломления регулируют до

1,39 и полученный раствор центрифугируют йри 90000 х g в роторе типа Beckman Tl 70 при 20 С в течение 3 суток. Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепляют от градиента и обрабатывают изопропанолом для экстрагирования этидий бромида, В заключение ДНК диализуют против буфера ТЕ и осаждают путем прибавления этанола, Из этой ДНК получают геномную библиотеку й!со0апа следующим образом, используя лямбда-вектор фага EMBL4. Фаг

EMBL4 получают из биомассы с агарозных чашек. Получают фаговую ДНК путем концентрирования. фага полиэтиленгликолем, удаления полиэтиленгликоля хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина. Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этанола. Для получения плеч фага

ЕМВ(4 фаговую ДНК псоледовательно гидролизуют эндонуклеазами Sat! и Bam Hl.

Плечи отжигают и затем отделяют от центрального фрагмента ía 10-40%-ном сахарозном градиенте. Плечи. полностью денатурируют и повторно.отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную описанным образом, частично обрабатывают эндонуклеазой SAU3A и осаждают посредством градиента 10-40%ной сахарозы. Фракции от сахарозного градиента затем анализируют электрофорезом на 0,5 -ых агарозных гелях. Фракции, содержащие фрагменты в диапазоне размеров. 20 — 40 кб, диализуют, осаждаЮт и лигируют к плечам ДНК лямбда-фага, ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на мл вектора и 45 мкг на мл вставки ДНК, Полученные лигированные контактамеры затем упаковывают с использованием экстрактов .упаковки лямбда-ДНК..Выхо фага составляет приблизительно 4,5 х 10 фагов на мкг вставки ДНК. Конструируют библиотеку из приблизительно 400000фагов, представляющую примерно.99%-ную полную библиотеку для табака, которая имеет приблизительно геномное содержанием 1,65 пикограммов или 1,52 х 10 пар оснований;

Полученную фаговую библиотеку ДНК

Nlcotlana выращивают и высевают на чашки на штамме (Е392 „Е.coll (АТСС 33572). Фаги высевают на чашки с получением 2000 — 5000

5 пятен на 90 мм чашках Петри или 50000 пятен на 150 мм чашках Петри. Вслед за переносом фаговой ДНК к нитроцеллюлозным фильтрам последние предварительно гибридизируют путем инкубирования в те10 чение приблизительно 4 ч при 56 С в 6 х

SSPE, содержащем 0,5% SDS, 100 мкг на мл денатурированной ДНК телячьего тимуса и

10 х раствора Denhardt. На этой стадии прибавляют свежую аликвоту гибридизирован15 ного раствора вместе с приблизительно 10 отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию проводят в течение 24 — 48 ч при 56ОC. В этот момент фильтры вначале промывают в тече20 ние приблизительно 4ч вбxSSPEпри56 С, затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2 х SSPE при температуре около 23"С. Затем фильтры сушат и подвергают воздействию ретгеновской пленки

25 Kodak XAR или ЯР и усиливают его экрана

Du Pont Crone&Lightning Plus при -70 С в течение 2 дней. Открытые места на пленке указывают положение пятен, потенциально содержащих гены АЛС Nlcotlana.

Полученные авторадиограммы затем ориентируют над первоначальными, бактериофагсодержащими чашками Петри. С использованием широкого конца стерильной пастеровской пипетки вырезают пятна, соответствующие наиболее темным местам на авторадиограммах. Собранные пятна затем элюируют в буфер SM и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Каждая чашка получает около 100-200 фагов. Затем повторяют полный процесс определения местоположения фагов, используя вновь приготовленный зонд. Таким образом повторяют стадии определения местоположения и выделения фагов до тех пор, пока большинство пятен не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способную гибридизироваться к зонду гена АЛС дрожжей, Выделяют мини-препараты ДНК из очищенного от пятен фага, обозначенного Nt

А13. Продукты переваривания мини-препаратов ДНК с помощью рестрикционной эндонуклеазы ЕсоЮ подвергают электрофорезу через 0,7% агарозные гели и блоттингу на нитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена. Фрагменты, способные гибридизироваться е зондом, затем выделяют и субклонируют в векторы рВВ322, 1820914

10.

М13гпр9 или M13mp18. Эти фрагменты далее Hind III u BamH у нуклеотидов 1540 и 2518, секвенируют с использованием олигонуклео- соответственно; тидных праймеров методом дидезокси-тер- r) последовательность BamH 1-Cia I минирования цепи. Используют комплект длиной 702 пн, содержащая 3 -участок гена

I приборов, поставляемый New England 5 нопалинсинтазы(нуклеотиды 848 — 1550).

Biolabs.Использованиесинтетическихолиго- Нуклеотидная последовательность у нуклеотидныхпраймеровпозволяетосущест- слияния NOSP и кодирующей последовавить растяжение ДНК-последовательности тельности NPT II выглядит следующим вдоль клонированного фрагмента s перекры- . образом: последовательность NOS вающихся сегментах. С помощью Э ВМ-ана- 10 последователь. ность N P T I I лиза последовательности ДНК идентифи- AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGA цируют открытую рамку считывания 667 ко- TCGTTCG С ATG,..... дов. Выведенная аминокислотная последа- Pst I Hind III вательность этой открытой рамки считывания Вектор pKNK расщепляют рестрикцион. в основном гомологична последовательно-. 15 ным энзимом Sal I (BRL), полученный линейстям, ранее определенным иэ гена !1Н2 ный вектор после экстракции фенолом

Saccharomyces cerevIsIae и гена !Ь6 Е.coli, соединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 с что указывает на то, чтофрагментДНК, вос- очищенным фрагментом Sal I (2,1 кб), несустановленный из геномной библиотеки щим бэктериальный ген неомицинфосфотNlcotiana, содержит ген АЛС табака. Для 20 рансферазы I (НРТ !) в качестве селектирутого, чтобы определить, кодируетли этот ген - емого маркера для бактериальной устойчиАЛС гербицидчувствительный энзим дикого вости к канамицину. Лигазную смесь испольтипа или мутантный гербицидустойчивый вуют. для трансформации компетентных энзим из линии S4, ген вводят в гербицид- клеток НВ101 Е.со!1, и трансформанты сечувствительный табак дикого типа путем 25 лектируют на чашках, содержащих 100 мг/л ..

1ранаформации, опосредственной Agrobac- канамицина. Полученную рекомбинантную

ferIum tumefaciens. плазмиду, обозначенную pKNKS, подвергаТребуется генетический маркер для от- ют очистке. бора трансформированных растительных Ппазмиду pKNKS расщепляют рестрйкклеток. Используют устойчивость к антиби- 30 ционным.энзимом Есо Rl (BRL) и ее концы отику 6-418, получаемую в результате того, затупляют фрагментом Кленова (ВВЦ, Поп. чтобактериальный ген ИРТ11, кодирующий ученную линейную ДНК соединяют в принеомицинфосфотрансферазу, экспрессиру- сутствии ДНК-лигазы Т4 (New England ется в растениях. Дпя осуществления экс- . Bioiabs) с фосфорилированными линкерами прессии NPT 11 регуляторные последова- 35 Bgl П. Вслед за экстенсивным переваривательности растений синтезируют с участком нием рестрикционным энзимом Bgl П (ВК1 ) кодированияйРТ1.1 ввекторерКМК.Вектор для удаления избыточных линкеров ДНК рКНК происходит от часто используемой. пропускэютчерезколонкугель-фильтрации плазмидыpBR322 в результате отщепления Сефадекс G-150 (очищенный) с тем, чтобы сайтов Hind !П и Bam Н1 и вставки в сайт С!а 40 отделить ее от линкеров. Фрагмент ДНК вы- .

I фра1 мента Оа (приблизительно, 2,3 кб), деляют и обьем регулируют с получением который состоит из следующих компонен- концентрации ДНК около 78 мкгlмл. 1 мкп тов: ДНК сэмолигируют в присутствии ДНК-лиа) последовательность Оа I-Bgl П дли- - газы Т4 в общем объеме 5 мкл и используют ной 320 пн, содержащая промоторный уча- 45 для трансформации компетентных клеток сток гена неомицинфосфотрансферазы HB101 E.col!, Ампициплинустойчивые кпет(йЯТ П) транспозона Тп 5, происходящего в ки содержат плазмиду pKNKSG, которая результате преобразования сайта Hind:П! в идентична плаэмиде pKNKS за исключенисайт Cia f; ем того. что рестрикционный.сайт EcoRI зэб) последовательность SaU ЗА-Pst 50 мещен сайтом Bgl II, длиной 296 пн, содержащая промотор нопа- Фрагмент Sma I фага NtA13 содержит линсинтазы (NOSP). происходящий от гена участок, который гибридизируется к дрожнопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды -263 до жевому гену АЛС. Фаг МА13 частично пере+33), относительно сайта начала транскрип- варивэют рестрикционным знзимом Sma I u ции, путем создания сайтэ Pst I кодона ини- 55 вслед зэ экстракцией фенолом присоединяциации; ют к фосфорилированным лин кер м BamH I в) последоватеьность Hind Ill-Bam Ht в присутствии ДНК-лигэзы Т4. После гидродлиной 998 пн, содержащая кодирующую лиза BamH I иудаления избыточныхлинкепоследовательностьдля гена NRT 11, проис- ров путем эпектрофореза на эгэрозном геле ходящего от Тп 5, путем создания сайтов рестрикционный фрагмент BamH (16 кб), 1820914

10

25

40

55 содержащий АЛС-ген табака от фага NtA13, выделяют из геля эпектроэлюированием и используют для дальнейшего клонирования.

Вектор pKNKSG линеаризуют рестрикционным знзимом Bgl II (BRL) и вслед за дефосфорилированием кишечной .фосфатазой теленка его присоединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 к рестрикционному фрагменту (16 кб) BamH I, происходящему из фага NtA13. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток

НВ101 Е.соИ и отбирают ампициплинустойчивые трансформанты, которые. содержат рекомбинантную плазмиду, обозначенную

plV13. Ориентация фрагмента-вставки в

plV13 такова, что рамки считывания гена

NOS;NPTII в векторе и гена АЛС во вставке находятся в противоположных направлениях. После очистки тремя штриховыми разводками одной колонии НВ101 (plV13) используют для трехродительского скрещивания. 3 мл ночных. культур НВ101 Е,coll (p1V13) и НВ101 Е.coll (pRK2013) (номер

АТСС 37159) в среде LB, содержащй 25 мг/л кэнамицина, выращивают при 37ОС, а

GV3850 Agrobacterium tumefaciens — в среде

LB при 28-29 С. Клетки собирают при ком-. натной температуре в клинической центрифуге, промывают один раз в среде LB, не содержащей лекарства. собирают и ресуспендируют в 3 мл LB. 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь переносят на миллипоровый фильтр (2,5 см HAWP, 0,45 мкм), помещенный на поверхности трех фильтров из ватманской бумаги N. 1 в чашке Петри. После того, кэк вся жидкая среда абсорбирована ватманским фильтром (около 30 мин), миллипоровый фильтр с бактериями на его верхней поверхности кладут (сторона с бактериями показывает наверх) на чашку со средой LB беэ лекарства. После инкубирования в течение ночи при 28-29 С миллипоро.вый фильтр переносят к 5 мл 10 мМ раствора

MgS0p и завихряют с тем, чтобы ресуспендировать бактерии в.растворе. 0,1 мл алик воты высевают на чашки с .селективной средой (чашки с минимальной средой М9, содержащей 20 сахарозу, 1 мМ MgS04. 1

MM CaCIz и 1 мг/мл канамицина (Sigma)).

Через примерно 4 дня инкубирования при

28-29ОС проявляются несколько больших колоний. Очищают несколько трансконъюгантов тремя последовательными штриховым разводками (одноколониевыми) на тех же селективных чашках. Ожидают pocT TollbKo Agrobacterium, содержащих плазмиду

plV13, вновь объединенную с эндогенной плазмидой рбЧ3850 за счет их общих последовэтельностей pBR322. Это подтвердилось анализом "Southern" перед использованием изготовленной Agrobacterium, 6ЧКМТ13 для трансформаций растений, Для трансформации растительных клеток следуют стандартным асептическим методикам для манипуляции стерильными средами и аксенными растительно-бактериальными культурами, включая использование колпака с ламинарными потоками для всех переносов. Составы сред представлены в примере 6, Консервированные растения табака для заражения листовых пластин выращивают в растильне: 12 ч при дневной температуре 24 С и 12 ч при ночной температуре 20 С, относительной влажности около 80, смешанном свете флуоресцентного и накаленного свечения. Осуществляют заражение листовых пластин табака.

Молодые листья, не полностью распустившиеся и имеющие приблизительно 4 — 6 дюймов (101,6 — 1523 вам) в длину, собирают скальпелем с растений табака (Nicotlana

tabacum, разновидность Xanthl) приблизительно 4 — 6-недельного возраста. Листья поверхностно стерилиэуют в течение 30 мин погружением их в около 500 мл 10 -ro

Chlorox, 0;1 -ro раствора додецилсульфэта натрия и затем промывают 3 раза стерильной деионизированной водой, Листовые пластины диаметром 6 мм получают иэ целых листьев с помощью стерильного бумажного пуансона.

Листовые пластины инокулируют погружением их в течение нескольких минут в 20 мл ночной культуры (разбавление 1:10)

Agrobacterlum, несущей ппаэмиду GCKNT13.

Выращивание культуры Agrobacterium начинают инокулированием 10.мл бульона YEB единственной бактериальной колонией, удаленной из чашки со средой R-агара. Культуру выращивают приблизительно 17 — 20 ч в

18 мл стеклянных пробирках с культурой в качалке с платформой New Вгопзи!сК поддерживэя температуру 28" С.

После инокулировэния листовые пластины помещают на чашки Петри, содержащие среду агара CN. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют при смешанных флуоресцентном и "Сго and Sho" освещениях для растений в течение 2 — 3 дней в камере для выращивания культур, где поддерживается температура около 25 С.

Чтобы избавиться от листовых пластин

Agrobacterium и отобрать для выращивания трансформированных клеток табака, листовые пластины переносят на свежую CN-среду, содержащую 500 мгlп цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Цефотаксим сохраняют в виде замороженного 100 мг/мл основно13

1820914 го раствора и прибавляют асептически (стерилизуют через 0,45-микрометровый фильтр) к средам после автоклавирования. . Свежий раствор канамицина (50 мг/мл) приготавливают для каждого использования и стерилизуют через фильтр, пропуская его в аатоклавированные среды.

Листовые пластины инкубируют в описанных условиях в.течение 3 недель и затем переносят на свежие среды такого же состава.

Приблизительно через 1 — 2 недели всхо10 ды, развивающиеся на среде, содержащей канамицин, подрезают стерильным скальпелем и высеаают в среде А, содержащей либо 100 ч. на млрд. хлорсульфурона, либо

100 мг/л канамицина. До истечения 3 недель регистрируют корнеобразоаание на для определения уровней устойчивости к хлорсульфурону и канамицину в проводимом испытании на каллюсовую индукцию на

25 селективных средах. Для индуцирования образования каллюса отрезают маленькие листья, которые разрезают, на несколько .участков с помощью скальпеля и засевают в

В-среду, содержащую либо 10 ч, на млрд, хлорсульфурона; либо 50 мгlп канамицина.

До истечения 3 недель регистрируют калпюсовой рост на селективной или неселективной средах.

Приведенные в табл.1 результаты указывают на то, что трансформация табака

35 была достигнута с помощью штамма

CVKNT13 на основе получения канамицинустойчивого каллюса, Канамицинустойчивый калпюс остается чувствительйым к сульфонилмочевинному герб ициду хлорсул ьфурон, что означает, что ген АЛС, выделенный из мутанта S4 табака в фаге Nta 13, кодирует

40 гербицидчувствительный энзим дикого типа. Этот ген АЛС растений использовался в качестве зонда гибридизации ДНК для выделения других растительных АЛС генов, включая гены, которые кодируют гербицидустойчивую АЛС.

Геномную библиотеку ДНК из мутанта

50

Нга табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, . которые гибридизируются к гену АЛС табака дикого типа из мутанта S4. Выделяют несколько фаговых клонов. Физическое картирование ДНК-вставок табака с использо- 55 ванием рестрикционных эндонуклеаз выявляет присутствие двух различных классов фрагментов ДНК, представляющих два гена АЛС: SURA u SURB. Сравнение физических карт генов SURA u SURB и tabacum селективной и неселективной средах.

В течение 2 недель посева удаляют ма- 20 ленькие листья с подрезанных проростков с картами от прародительских видов показывает. что ген SURA происходит от

N.sylvectrIs, а ген SURB происходит от

Н tomentosiformis. Ген АЛС дикого типа, выделенный ранее из мутанта S4. обозначают

SURA. Генетическое сцепление гербицидустойчивой мутации высокого уровня в Нга с мутацией $4 показывает. что мутация Hra наблюдается в том же гене АЛС, что и мутация $4, а именно в SURB, Следовательно, ожидается, что ген SURB, выделенный из мутанта Hra, должен быть мутантным геном, обозначенным SURB-HRa и кодирующим гербицидустойчивую АЛС. Выбирают один фаговый клон, содержащий ген SURB — Нга. для дальнейшего анализа. Этот фаговый клон, обозначенный 3, депонирован в Американской коллекции типовых культур, Рокаилл, Мэрилэнд, под каталожным номером

АТСС 40237. Фаговый клон переваривают рестрикционной эндонуклеаэой Spe I с получением ДНК-фрагмента (8,3 кб), который вставляют в сайт ХЬа I плазмиды рМис19, и полученную рекомбинантную плазмиду

pAGS148 депонируют а Американской коллекции типовых культур, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС

67124, Плазмиды рА6$148 и рА6$135 лигируют одну с другой, как описано ниже, и полученную рекомбинантную плазмиду

pAGS152 вставляют а LBA, . 4404

Agrobacterium tumefaciens. Полученную

LBA 4404 (pAGS152) Agrobacterium

tumefaciens депонируют в Американской коллекции типовых культур под каталожным номером АТСС 6712б.

Геномную библиотеку ДНК из.мутанта

СЗ табака конструируют в бактериофаге лямбда и подвергают скринингу на клоны, которые гибридизируются с ранее выделенными генами АЛС из табака. несколько фаговых -клонов выделяют, после чего

ДНК-вставки табака физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Идентифицируют два различных типа фрагментов ДНК, соответствующих гену SURA-СЗ и гену SURB. Для дальнейшего анализа отбирают два фаговых клона, обозначенных 35 и

38 и- несущих ген SURA — СЗ.

Фаговый клон 35 переваривают рестрикционными эндонуклеазами Spe (и Sai .

I с получением фрагмета ДНК (6,3 кб). Этот фрагмент ДНК вставляют в плазмидный вектор р0С119, переваренный рестрикционными зндонуклеазами XbA I u Sal I, и полученную рекомбинантную плазмиду pALS25 депанируют в АТСС, Роквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером АТСС 67424.

Кроме четырех генов АЛС табака, а именно SURA и SURB, кодирующих герби1820914 цидчувствительные АЛС дикого типа, и

SURA-СЗ и SURB — Hra, кодирующих мутантную гербицидустойчивую АЛС, гены АЛС выделяют из Arabidopsls thaliana; Beta

vutgaris (свекла сахарная) и часть гена АЛС выделяют из Zea mays (кукуруза). Последние гены NlC из гербицидчувствительных.растений получают из геномных библиотек

ДНК, сконструированных в бактериофаге лямбда скринингом на ДНК, гибридизирующуюся с ранее выделенным геном АЛС из . дрожжей или табака. Ген АЛС дикого типа из сахарной свеклы выделяют в фаге, обозначенном Ф21, и физически картируют рестрикционными эндонуклеазами. Плазмида

pBALS216 депонирована в АТСС, Раквилл, Мэрилэнд, под каталожным номером 67425.

Гены, кодирующие гербицидустойчивые энзимы АЛС, выделены из спонтанных мутантов дрожжей, устойчивых к сульфонилмочевине. Секвенирование этих генов показывает, что молекулярную основу устойчивости составляют изменения в основных парах, приводящие к аминокислотным замещениям в 10 различных положениях в белке (табл.2), имено остатки 121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591, 595.

В шести из этих положений, а именно

122, 197, 205, 256, 384 и 591 (табл.2), получают более чем одно замещение, придающее гердицидную устойчивость. В положении

122 остаток аланина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа за исключением изоэнзйма I Е.coll, в котором остаток 122 замещен на аспарагиновую кислоту, пролин, треонин или валин, что приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 197. octaток пролина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа за исключением изоэнзимов П и III Е.соИ, замещение серина или аргинина приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 205, где остаток аланинэ-присутству. ет во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка в положении 205 на аспарагиновую.кислоту или треонин прйводит к получению АЛС, устойчивой к сульфо. нилмочевине. В положении 256, где остаток лизина присутствует во всех известных энзимах АЛС дикого типа, замена остатка 255 на глутэминовую кислоту, аспарагин или треонин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине, В положении

384, где аспарагиновая кислота присутствует во всех известных энэимах АЛС дикого типа, замена остатка 384 на глутаминовую кислоту, аспарагин или валин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 591, где триптофан

15 к сульфонилмочевине. В положении 359, где

30

40

45 приводящие к замещениям лизина — остатка

55

10 присутствует во всех известных энзимах

АЛС дикого типа, за исключением изоэнзима. I Е.coll, в котором замена 591 остатка на аланин, цистеин, глицин,. лейцин, аргинин или серин приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине.

Были получены мутанты, устойчивые к гербицидам на основе сульфонилмочевины, в результате отдельных аминокислотных замещений в других четырех положениях, а именно 121, 359, 588 и 595. В положении

121, где глицин присутствует во всех известных.энзимах АЛС. замещение его серином приводит к получению АЛС, устойчивой метионин присутствует во всех известных энзимах АЛС, замещение его валином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 588, где валин присутствует во всех известных энзимах:АЛС, замещение его эланином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине. В положении 595, где фенилаланин поисутствует во всех известных энзимахАЛС, за исключением изоэнзима III E,coll, замещение его лейцином приводит к получению АЛС, устойчивой к сульфонилмочевине.

Олигонуклеотиднаправленные сайтспецифические мутации, приводацие к аминокислотным замещениям в положениях 122, 205, 256, 359, 384 и 591, выполнены в дрожжевом гене, кодирующем АЛС (табл.3).

В положении 122 производят мутации, приводящие к замещениям аланина 18 аминокислотами, присутствующими в АЛС дикого типа. Каждое замещение за исключением глицина приводит к получению AJIC, устойчивой к сульфонилмочевине. В положение

205 мутации, приводящие .к замещениям аланина — остатка дикого типа на цистеин, глутаминовую кислоту, аргинин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 256 мутации, дикого типа на аспарагиновую кислоту, глицин, лейцин, пролин или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине.

В положении 384 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям аспэрагиновой кислоты — остатка дикого типа нэ цистеин, глицин, пролин, лизин, серии или триптофан, образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине. В положении 591 мутации, приводящие к аминокислотным замещениям триптофанэ — остатка дикого типа на аспарагиновую кислоту. глутаминовую кислоту, фенилаланин, гистидин, изолейцин, лизин, эргинин, валин, метионин, аспарагин, глутамин, треонин или тирозин, 17

1820914

18 образуют АЛС, устойчивую к сульфонилмочевине, Все мутации, описанные в табл.2 и 3, Е,coll приводят к получению энзимов, которые активны и менее ингибируются гербицидами на основе сульфонилмочевины, чем энзимы дикого типа. Вместе взятые эти результаты показывают, что большинство замещений в этих 10 положениях приводит к получению, ферментативно активной гербицидустойчивой АЛ С;

Аминокислотные остатки в положениях

121, 122, 197, 205, 256, 359, 384, 588, 591 и

595 во всех. растительных энзимах такие