Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны

Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: в области сельскохозяйственной микробиологии, для получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны с повышенной конкурентоспособностью. Сущность изобретения состоит во введении в геном бактерий дополнительной плазмиды pPON, промаркированной транспозоном Tn5-mob, с помощью триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны штамма Agrobacterlum rhizogenes Д 32 15834, и штамма бактерий Escherichla coll С600, несущего плазмиду RP4-4, и последующего отбора клонов с высокой азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью. 3 табл.1 ил.

СОЮЗ COI3F T C K VIX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБЛИК (н)1 С 12 N 15/07

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ФЕКЛ "вЧОИ О1 f-. ч е

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4925248/13 (22) 31.01.91 (46) 23.06.93. Бюл. М 23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) Н,И,Новикова, Е.А.Павлова, В.И.Сафронова и А,П.Кожемяков (56) Генетические методы селекции клубеньковых бактерий (методические рекомендации). Л., ВНИИ с/х микробиологии, 1984, с.

30-35, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению штаммов клубеньковых бактерий с улучшенными свойствами.

Цель изобретения — предложить генетический способ получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны, сохранивших высокую аэотфиксирующую активность и симбиотическую эффективность исходных штаммов и повысивших их эа счет увеличения количества клубеньков, образуемых полученными штаммами, повысивших своа конкурентоспособность. что закреплено наследственно. В качестве такого способа предлагается проводить триродительское скрещивание штаммов клубеньковых бактерий люцерны, Agrobacterium rhizogenes Д

32 15834, содержащего плазмиду pPON, и бактерий Escherichia coli с600, несущего плаэмиду RP4-4, и отбирать клоны, Плазмида pPON получена на основе собственной корне индуцирующей плаэмиды штамма

„„. Ж „„1822883 А1 (57) Использование; в области сельскохозяйственной микробиологии, для получения штаммов клубеньковых бактерий люцерны с повышенной конкурентоспособностью. Сущность изобретения состоит во введении в геном бактерий дополнительной плаэмиды

pPON, промаркированной транспоэоном

Тп5-mob, с помощью триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны штамма Agrobacterlum rhizogenes Д 32

15834, и штамма бактерий Escherichla coll

С600, несущего плазмиду RP4-4, и последующего отбора клонов с высокой аэотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью. 3 табл.1 ил.

Agrobacterium rhizogenes 15834 путем маркирования ее транспоэоном Тп5-mob. Донором плаз миды pPON служит штамм

Agrobacterium rhizogenes Д 32 (штамм

15384, промаркированный указанным транспозоном), устойчивый к рифампицину и канамицину в концентрации, соответственно, 40 и 200 мкгlмл. Плаэмида pPON Л имеет молекулярную массу в 258 М и пред- CO

Ю ставляет собой коинтеграт двух плазмид меньшей массы (107 и 154 М). поэтому в клетках Rhizoblum melllotl она может быть представлена в виде трех плазмид с молекулярной массой 107, 154 и 258 М. Эта плазмида несет гены, контролирующие индукцию "бородатых" корней у штаммов

Agrobacterium rhlzogenes (White F.F., Nester

ЕМ. Kairy root; plasmld encodes virulence

traits in Agrobacterium rhlzogenes - J.

Вас». ol., 1980, 141.3, 1134 — 1141). Донором плаэмиды RP4-4, несущей гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину (концен1822883 трация антибиотиков в среде, соответственно. 20 и 100 мкг/мл), служит штамм

Escherlchla coll С600 (Simon R. High

frequency mobilization of gram-negative

bacterial repllcons by the in vitro constructed

Тп5-mob transposon. — "Molec. ben. benet"1984, 196.3, 413-420.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами его реализации.

Пример 1. Трехродительские скрещивания проводят на питательной среде следующего состава: К2НР04 - 0,5 r; MgSO< х х7Н20 - 0,2 г; NaCI 0,1 г; СаСОз — следы; маннит — 10,0 г; дрожжевой экстракт — 0,5 г; вода дистиллированная — 1 л, рН 7,0 — 7,2.

Выращивание при 28 С в течение 24 ч. Густые суспензии родительских штаммов наносят каплями на агаризованную среду указанного состава (20,0 г агара на 1 л среды). Через 16-18 ч клетки собирают в пробирки с 1 мл стерильной воды и высевают на чашки Петри с указанной агаризованной средой с добавлением антибиотиков — канамицина и стрептомицина (1000 мкг/мл) или канамицина и новобиоцина (120 мкг/MR).

Одновременно на эти среды высевают контрольные варианты, из которых делают разведения с высевом на указанную питательную среду для определения частоты появления рекомбинантов, Реципиентный штамм клубеньковых бактерий люцерны должен быть маркирован устойчивостью к стрептомицину или новобиоцину.

Клоны рекомбинантов появляются на 4 сутки при выращивании при 28 С. В наших опытах было выявлено 3 независимых скрещивания, частоты появления канамицин-устойчивых клонов у штамма CXMI-105

Rhizobium melilotl составляли 10 — 10 . Из каждого скрещивания отбирали по 3 рекомбинанта и проверяли их симбиотические свойства в условиях стерильного микровегетационного опыта на растениях люцерны сорта Зайкевича. В большие пробирки объемом 60 мл вносили по 5 г вермикулита, промытого и прокаленного при 800 С в течение 2 ч. В каждую пробирку добавляли по

10 мл среды Красильникова-Кореняко следующего состава: KzHPO4 — 1 г; MgS04 — 1 г;

Саз(Р04Ь вЂ” 0,2 г; FeS04 — следы: вода дистиллированная — 1 л. Пробирки со средой стерилизовали в автоклаве. Семена люцерны стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 5 минут, промывали стерильной водой и проращивали до появления корешка размером 3-6 мм (1-2 суток) при 28 С. Проростки раскладывали по 2 в каждую пробирку. Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на агаризованной среде указанного выше со5

55 става (без антибиотиков) при 28 С в течение

2 суток и суспендировали в растворе микроэлементов: НзВОз — 0,05 г; (NH4)zMo04—

0,05г; KCI — 0,005 г; NaBr — 0,005 r; ZnSO< х х7Н20 — 0,03 г; А!2(ЯОа)з х 18HzO — 0.003 г;

MnSO< — 0,002 г; вода дистиллированная — 1 л. Через сутки после посева семян в каждую пробирку вносили по 1 мл инокулюма (10

10 ) кл/мл. Опыты ставились в 12-кратной повторности. Растения выращивали в теплице при 25 С в течение 30 дн. По истечении

30 дней пробирки герметично закрывали и вводили в них шприцем ацетилен до концентрации 10 по обьему. Количество этилена, образовавшегося в результате восстановления ацетилена нитрогеназой клубеньковых бактерий, определяли через

24 часа на газовом хроматографе. Величину ацетиленредуктазной активности клубеньков, являющуюся показателем интенсивности работы нитрогеназы, определяли по формуле M(CzHz) = р. Vñò. x V 10-6 М х

1ст. Нпр, х 22.4 где M(CzHz — ацетиленредуктазная активность клубеньков (ммоль/coc 24 ч);

Inр — длина пика этилена, полученного при введении исследуемой пробы;

Icr. — длина пика, полученного при введении стандартной пробы 0,1 (, этилена;

V<>. — объем стандартной пробы;

Vnp. — обьем исследуемой пробы;

V — объем пробирки с растениями.

Способность к индуцированию "бородатых" корней исследовали на раневых поверхностях листьев табака в асептической культуре по методике, описанной в работе

Bercetohe J. Chrigni О., Adam S., David С., Morphogenetic and cellular reori ептабопз

induced by Ag robacterium rhizogenes (strain s

1855, 2659 and 8196) on carrot, реа and

tobacco - "Plant $сГ, 1987, 52, 3, 195-210, Семена табака стерилизовали раствором 30 перекиси водорода и 96 этиловым спиртом, взятым в соотношении 1;1, в течение 10 минут. Затем их помещали на среду Мурасиге и Скуга без гормонов (мг/л)

: и Н4ИОз - 1650; КМОз - 1900; CaClz x 2Н20

- 440; MgSO x 7Н20 — 370; KHzP04 — 170;

НзВОз — 6.2; MnSO4 х 4Н20 — 22,3; СоС12 х

x6HzO — 0.025; CuSOq х 5НгΠ— 0,025; ZnS04 х 7H?O - 8,6; NazMo04 х 2Н О вЂ” 0,25; KJ

0,83; FeS04 х 7НгΠ— 27,8; Ма ЭДТА х 2Н О вЂ” 37,3; тиамин-Н С! — 0,1; пиридоксин — H CI — 0,5; никотиновая кислота — 0,5; мезо-инозит — 100; глицин — 2,0: индоксилуксусная кислота — 2,0; кинетин — 0,2: сахароза—

30000. рН 5,6 — 5,8. Выращивали в течение

2-3 недель. Срезанные листья проростков

1822883

10

55 надсекали перпендикулярно главной жилке и помещали в суспенэию клубеньковых бактерий, выращенных в течение суток на качалке в жидкой среде с маннитом и дрожжевым экстрактом приведенного в примере 1 состава. В бактериальной культуре листья табака выдерживали 1-2 часа и переносили на среду Торри без гормонов (мг/л); MgS04 х 7Н20 — 42; Са(МОз)г х 4HzO — 242; КМОз-85; KCI — 61: КНгРО4-20; FeClg — 1,5; MnS04 х Н20 — 4.5: ZnSO4 х 7HzO — 1,5;

НзВОз- 0,25; NazMo04 х 2HzO — 0,25; CuSO4 х 5Н20 — 0,04; никотиновая кислота — 5,0; тиамин-HCI — 1,0; сахароза — 60000. рН 6,0.

Выдерживали 12 ч и перекладывали на среду Мурасиге и Скуга укаэанного состава с добавлением 0,25 мг/л бензиламинопурина и 0,05 мг/л а-нафтилуксусной кислоты. Учет патогенности проводили на 14 день после инокуляции. Характерный фенотип "бородатых" корней: корни, индуцированные патогенными рекомбинантами, отличаются от нормальных корней тем, что они быстрее растут, сильнее разветвлены, имеют вертикальное и горизонтальное направление, а не только вниз. Растения, регенерированные из трансформированных корней, сильно ветвятся, имеют сморщенные листья.

Результаты микровегетационного опыта и определение способности к индуцированию "бородатых" корней представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, ацетиленредуктазная активность не отличалась достоверно от контрольного варианта (эа исключением штамма под N 9), что указывает на сохранение азотфиксирующей активности штаммареципиента. (Масса растений также не различалась, поэтому данные о ней не приводятся), Восемь из полученных штаммов обладали усиленной вирулентностью и образовывали большее количество клубеньков на растениях люцерны, чем штамм-реципиент. Все полученные штаммы, в отличие от штамма-донора, не обладали несвойственной и ненужной для

Rhlzobium способностью индуцировать "бородатые" корни.

Пример 2. В микровегетационном опыте по той же методике была исследована динамика нодуляции корней люцерны после инокуляции 4 иэ полученных рекомбинантов. Каждым рекомбинантом, а также— в качестве контроля — штаммом-реципиентом инокулировали по 30 проростков. Отмечалось среднее количество клубеньков на 1 растение на 9-й, 10-й, 15-й, 22-й и 30-й дни.

Результаты представлены на фиг,1.

Как показано на чертеже, отобранные штаммы превосходят исходный родительский штамм по скорости образования клубеньков на люцерне, Известно, чтоу мутантов Rhizoblummellloti с задержкой нодуляции отмечается снижение конкурентоспособности, соответственно ускоренная нодуляция будет коррелировать с усиленной конкурентоспособностью. Для анализа конкурентоспособности исследуемых штаммов был поставлен микровегетационный опыт, в котором использовали метод относительной оценки конкурентоспособности по массе растений по методике. изложенной в статье

Л.А.Шарыповой и Б,В,Симарова "Метод сравнения конкурентоспособности эффективных штаммов Rhizobium meliloti — Труды ВНИИ с/х микробиологии, т.55, 1985, с, 85 — 90. Совместно с исследуемым штаммом была проведена инокуляция неактивным штаммом СХМ1-48, обладающим высокой конкурентоспособностью, в концентрации, в 1000 раз превышающей концентрацию исследуемых рекомбинантов. Конкурентоспособность учитывали как отношение прибавки массы растений, полученной при совместной инокуляции, к прибавке массы растений, полученной в варианте моноинокуляции активным штаммом. Использование больших пробирок позволило выращивать растения в течение 2 мес. Результаты опыта приведены в табл.2.

Как показывает табл.2, по своей симбиотической эффективности исследуемые штаммы на 20-40 превзошли исходный штамм СХМ1-105. Конкурентность рекомбинантов в 2-3 раза превосходила конкурентоспособность штамма CXMI-105. Для окончательной оценки конкурентоспособности полученных рекомбинантов был поставлен вегетационный опыт на нестерильном песке в 3-килограммовых сосудах в пятикратной повторности. В качестве инфекционной нагрузки был также использован штамм СХМ1-48 а соотношении 1000;1, Результаты опыта приведены в табл.3.

Как показывает табл.3, отобранные рекомбинанты обладают не только высокой симбиотической эффективностью и азотфиксирующей активностью, но также способны успешно конкурировать с местной популяцией клубеньковых бактерий за сайты взаимодействия на корнях люцерны.

Кроме того, в той же таблице 3 показаны результаты анализа абсолютной конкурентоспособности этих штаммов по маркеру устойчивости к канамицину. Для этого из клубеньков, образованных на корнях люцерны, выделяли штаммы бактерий и высевали их на селективную среду с канамицином. Было проверено Ilo 100 клу1822883

Таблица1

Свойства рекомбинантов СХМ1-105 (pPON) беньков. Результаты показывают, что метка сохраняется, и отобранные штаммы действительно высококонкурентоспособны. Стабильность сохранения плазмид в клетках R.òålÏDÎ проверяли в течение 1,5 лет методом электрофореза в агаровом геле. Отобранные рекомбинанты были стабильны.

Таким образом, можно заключить, что предлагаемым нами способом можно на основе селекционных штаммов быстро получать штаммы с высокой азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью эа счет повышения их конкурентоспособности, повышения количества клубеньков, образованных этими штаммами.

Формула изобретения

Способ получения штамма клубеньковых бактерий люцерны, включающий введение в их геном дополнительных плазмид, о т л и ч а5 ю шийся тем, что, с целью повышения азотфиксирующей активности и симбиотической эффективности штаммов за счет повышения количества образованных клубеньков, введение в геном дополнительных плазмид

10 проводят путем триродительского скрещивания штамма клубеньковых бактерий люцерны, штамма бактерий Agrobacterlum

rhlzogenes Д32 15834, содержащего плазмиду

pPON, штамма бактерий Escherichia coll

15 С600, несущего плазмиду RP4-4, и отбирают клоны, обладающие повышенной азотфиксирующей активностью и симбиотической эффективностью.

Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях микровегетационного опыта

Симбиотические свойства рекомбинантов в условиях вегетационного опыта

1822883

Таблица2

Таблицами

1822883

0и

О»

Редактор Т.Шагова

Заказ 2174 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государс венногп комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб„4/5

Производствс.l но и..щательскии комбинат "Патент, г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

4)

11

З:

44 3

Е

Составитель Н.Новикова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Ы.Куль