Способ определения количества микроорганизмов

Способ определения количества микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: биология, медицина, микробиология, иммунология, санитария, гигиена. Сущность изобретения микроорга1 низмы суспендируют о 40%-ном растворе глюкозы, Подсчет микроорганизмов о исследуемой суспензии осуществляют в видоизмененной счетной камере глубиной 4 мкм в фазово-контпастном микроскопе. При использовании способа процент ошибки снижается с 30-40 до 3-5 %. 1 ил,, 2 табл

COlO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 0 1/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗО6РЕТЕНИЯ! ОО

Ф ,фь

jul

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4797551/13 (22) 03.01.90 (46) 30.06.93. Бюл. N. 24 (71) Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов (72) Б.М,Мануйлов и А.Б.Цыпин (56) Авторское свидетельство СССР

N. 395439, 1973.

Методы общей бактериологии/Под ред.

Ф.Герхарда и др. М,; "Мир", 1983, т.1, с.450454.

Изобретение относится к медицине и биологии, о частности к микробиологии, иммунологии, санитарии и гигиене, Целью изобретения является повышение точности и разрешающей способности метода эа счет определения любой концентрации и различных микроорганизмов.

Для осуществления заяоленного способа необходима видоизмененная камера для счета форменных элементов кроои (камера

Горяева), в которой глубину счетной камеры уменьшили со 100 мкм до 4 мкм. Такой размер камеры обусловлен размерами микроорганизмов. Микроорганизмы практически всех видов (кокки и палочки) размещаются в счетной камере с данными размерами, причем одновременно видны о фокусе осе микроорганизмы, находящиеся в камере (чертеж).

Уменьшение глубины камеры происходит эа счет уменьшения плотностей. на которых притирают покровное стекло, на 96 мкм. Измененная таким образом камера для счета форменных элементов крови дает воз„„SU „„ 1824445 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Использование: биология, медицина, тликробиоло ия, иммунология, санитария, гигиена. Сущность изобретения: ликроорганизл1ы суспендируют о 40%-ном растворе гл окоэы, Подсчет микроорганизмов в исследуемой суспензии осуществляют о видоизменcllllîé счетной камере глубиной 4 мкм о фезова-контрастном микроскопе. При использооании способа процент ошибки снижаетсл с 30-40 до 3-5 %. 1 ил„2 табл. лтожность то гно, быстро и дешево определять любое количество микроорганизмов, причем любых видов (кокки и палочки).

Осуществляется способ следующим образотл.

Перед исследованием камеру для счета л 11кроорганизмоо и покрооное стекло тщательно моют, обезм ириоают и высушивают.

Затем покровное стекло (толщина, мкм) накладывают на плоскости и пр11тирают до появления "колец Ньютона", Подготовленную для работы камеру заполняют рабочей смесью микроорганизмов, удаляя при этом ее лишнее количество. Рабочую сл1есь микроорганизмов loToOAT следующим образом:

К 4,0 мл 40% раствора глюкозы добавляют

0.02 мл суспензии микроорганизмов и тщательно перемешивают. Использование насыщенного раствора высокомолекулярной глюкозы обусловлено тем, что она способствует фиксации микроорганизмов растворе и препятствует их беспорядочному движению, что неизбежно происходит о низкомолекулярном растворе 11 значительно

1824445

55 от 1 до 2-3 мкм за грудняет подсчет. Подсчет микроорганизмов проводят в фазово-контрастнОм микроскопе под иммерсионной системой при увеличении ОВх90, ОКх7-10 в 5 больших квадратах счетной сетки по диагонали, Учитывая, что обьем используемой камеры после уменьшения ранен 1(100000 мл

/ 1/20 х 1/20 х 1/250) расчет количества микроорганизмов проводят по следующей формуле

Ах10000х Б

В где Х вЂ” количество микроорганизмов в 1 мкл;

А — количество микроорганизмов в 5 больших квадратах;

100 000 — постоянное число для перевода обьема камеры к 1 микролитру, Б — степень разведения;

 — количество малых квадратов.

Например, А = 10, Б = 200, В - 80, тогда

10 х 100 000 х 200 5 106

80 — 5 х 10 микроорганизмов в 1 мкл, Процент ошибки при подсчете микроорганизмов в данной камере такой же,как и при подсчете клеток крови в камере Горяева, и равен примерно 3 — 5 .

После определения количества микробов в исследуемой суспензии в последнюю после соответствующих расчетов добавляют необходимое количество исходной суспенэии микроорганизмов (если микроорганизмов меньше необходимой концентрации) или физиологический раствор (если микроорганизмов больше необходимой концентрации). В полученной суспензии определяют количество микроорганизмов и если оно соответствует рабочей концентрации, то используют в соответствующих исследованиях. Если же количество микроорганизмов больше или меньше необходимой концентрации, то повторяют выше описанную процедуру довода и контроля количества микроорганизмов еще раз до необходимой концентрации.

Обычно если расчет и разведение физиологическим раствором или добавление исходной суспензии микроорганизмов проводится точно и аккуратно, то необходимое количество микроорганизмов в рабочей суспензии получают с первого раза. Полученную таким образовал рабочую сусг1ензию микроорганизмов с заданной концентрацией используют в необходимых исследованиях, Пример 1. Определение и доведение количества микроорганизмов до необходимой концентрации и в оптимальном варианте. Однодневную культуру золотистого

50 стафилококка штамм "Лепин" смывают с питательной среды 10,0 мл физиологического раствора (микроорганизмы убивают путем нагревания в течение 2 часов при +70 С, а затем их разбавляют физиологическим раствором до приблизительно необходимой концентрации (1 х 10 в 1 мкл под контролем

6 глаза по мутности (оптической плотности) раствора. После этого суспензию разводят в 200 раэ в 407, растворе глюкозы, путем добавления 0,02 мл разбавленной суспензии микроорганизмов к 4,0 мл 40 раствора глюкозы и тщательно перемешивают. Полученной рабочей смесью микроорганизмов заполняют видоизмененную камеру для счета форменных элементов крови с высотой 4 микрона. При этом высокомолекулярный раствор глюкозы в концентрации 40-",ь препятствует беспорядочному движению микробов. Далее считают количество микроорганизмов в 5 больших квадратах по диагонали счетной сетки камеры в фазово-контрастном микроскопе под иммерсионной системой при ОБх90, ОК х 7-10, В 5 больших квадратах (или 80 малых) находилось 8 микроорганизмов. Следовательно, количество микроорганизмов равно

X 8x 100000 x 200 2 106 — 2 х 10 в1,0мкл.

То есть количество микроорганизмов в 2 раза больше необходимой концентрации.

Для приведения концентрации микробов до необходимой величины суспенэию микроорганизмов разводят физиологическим раствором в 2 раза и проводят дополнительный контрольный подсчет микроорганизмов как описано выше. Количество микроорганизмов в 5 больших квадратах равнялось 4.

Следовательно, количество микроорганизмов равно

Х 4 х 100000 х 200 — 1 106 1 0

80 — 1 х 10 в1,0мкл.

Полученная таким образом рабочая суспензия микроорганизмов с необходимой концентрацией (1 х 10 в 1,0 мкл) готова к употреблению в исследовательской работе.

Пример 2. Уменьшение высоты счетной камеры до 3 — 1 мкм.

Уменьшение высоты счетной камеры до

3-1 мкм невозможно, ибо в таком случае будет весьма затруднено, а для некоторых микробов вообще невозможно, заполнение счетной камеры суспензией микроорганизмов, размеры которых в среднем варьируют

Пример 3, Уменьшение высоты счетной камеры больше 4 микрон.

Уменьшение высоты счетной камеры больше 4 микрон нецелесообразно, ибо при этом фокус микрос r>ii дпч плсполо1824445

Таблица 1

Количество микроорганизмов (Staph. aureus штамм

"Лепин" ), определенное с помощью способа-прототипа и предлагаемого способа

2-е определение

Способ

3-е on е еление

1-е опре еление

1,5 х 10

0,99 х 10

1,4х10

1,03 х 10

0,75х 10

1,01 х 10

Прототип

П е лагаемый женных в расположенных в разных плоскостях микроорганизмов будет различным, что значительно затрудняет подсчет микроорганизмов. Таким образом, чем выше глубина камеры, тем больше разница в фокусе микроскопа для микроорганизмов, расположенных в разных плоскостях, тем сложнее и менее точно происходит подсчет микроорганизмов.

Сравнение конечных результатов (т.е. подсчитанное количество микроорганизмов в единице объема рабочей суспензии), полученных при использовании способа-прототипа и заявленного способа показано в

) табл.1. В способе-прототипе количество микроорганизмов в рабочей суспензии определялось одним исследователем с помощью соответствующего стандарта мутности на 1,0х 10 в1,0мкл, Определе11ие проводилось трижды, а контролировалось с помощью заявленного способа. Следует отметить, что определение количества микроорганизмов с помощью способа-прототипа разными исследователями неизбежно приводит к еще большему процентному ошибки эа счет субъективной оценки оптической плотности рабочей и эталонной суспенэии микроорганизмов, проводимой под контролем глаза разных исследователей. Подтверждением этого являются результаты, представленные в табл.2.

Сравнительный анализ способа-прототипа и заявленного способа показал, что в заявленном способе про1 ент ошибки при подсчете количества микроорганизмов значительно меньше. чем в способе-прототипе.и соответствует 3-5 (,; в способе-про5 тотипе процент ошибки составляе1 30-40 ; в заявленном способе возможно быстрое, точное и дешевое определение любой концентрации 1ликроорга11иэмов. в способепрототипе возможно определение только стандартного (эталонного) количества микроорганизмов: в заявленном способе возможно весьма длительное использование камеры для счета микроорганизмов; в способе-прототипе необходима 38Mella стандарта мутности по истечению срока гарантии, Использование предлагаемого способа позволяет достаточно точно (процент ошибки составляет 3-5 ), быстро и дешево опре20 делять любое существующее количество всех видов исследуемых микроорганизмов (кокки ll палочки).

Формула изобретения

Способ определения количества микроорганизмов путем их суспендирования в жидкой среде и подсчета в счетной камере, под микроскопом, о т л и ч а lo щ и и с A тем.

30 что, с целью повышения точност11способа, микроорга11иэмы суспендируют в 40=,ь-ном растворе глюкозы, а подсчет проводят в счеп1ай каплере глубиной 4 1лкм.

1824445

Таблица 2

Контрольное определение количества микроорганизмов (Staph. aureus штамм "Reпин"), проведенное в одной и той же пробе с помощью способа-прототипа и предлагаемого способа разными исследователями нопа сло рганиэмы камеры

Корректор А.Козориз

Редактор

Заказ 2216 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35. Раушскэя наб,. 4/5

Произеодственн..;-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 иомр сте

Поверхности дяя притерения покроиного стекла

Составитель Б.Мануйлов

Техред М.Моргентал