Способ получения штамма актиномицета - продуцента линкомицина
Патент 1824912
Авторы
Классы МПК
Способ получения штамма актиномицета - продуцента линкомицина
Реферат
Использование: генетика микроорганизма, биосинтез биологически активных веществ. Сущность изобретения: штаммы актиномицета продуцента линкомицина получены в результате облучения культуры энергетическими электронными с регулируемыми параметрами энергии 100 250 кэВ, плотности тока 610-5-5,0 A/см2 в возбуждающем пучке при длительности импульса облучения 0,5-10-7 в паузах между облучением 1,5 6 с, причем доза облучения составляет 10-3-20 Мрад.
Изобретение относится к синтезу биологически активных веществ и может быть использовано при получении новых свойств продуцентов антибиотиков посредством индуцированного мутагенеза с помощью энергетичных частиц пучково-плазменного разряда, возбуждаемого высокоэнергетическими электронами. Изобретение может быть применено в микробиологической промышленности, например, для повышения антибиотической активности штамма актиномицета Actinomyces roseolus продуцента линкомицина и др. Цель изобретения повышение активности продуцентов антибиотиков линкомицина. Результат достигается путем по крайней мере однократного облучения культуры Аctinomyces roseolus заряженными частицами и отбора наиболее антибиотических активных клонов. Отличие состоит в том, что культуру Act.roseolus облучают энергетическими электронами с регулируемыми параметрами энергии 100-250 кэВ, плотности тока 6 10-5-5,0 А/см2, длительности импульса облучения 0,5-10-7 с, пауз между облучением 1,5-6 с, причем доза облучения питательной среды с культурой Act.roseolus составляет 10-3-20 Мрад. Способ осуществляют следующим образом. Слой водной суспензии из продуцентов линкомицина (0,2-0,4 мл) помещают в плоскую полиэтиленовую камеру размером 30х30х0,1 мм3 с толщиной стенки 20-100 мкм и облучают высокоэнергетическими электронами, вылетающими из ускорителя электронов через тонкую алюминиевую диафрагму в атмосферу и на стенку камеры. Угол падения электронного потока варьируют в пределах 0< < 180о. При энергии налетающих электронов, начиная с 100 кэВ, и плотности тока 50-80 мкА/см2 внутри камеры с эмульсией и снаружи возникает пучково-плазменный разряд, приводящий к мутагенным явлениям в генетическом аппарате микроорганизмов. Мощность дозы и характер энергетического спектра пучка электронов регулируют электрическим режимом ускорителя, углом падения пучка, длиной пролета электронов в атмосфере. Общий баланс плотности энергии электронного пучка при прямом падении на стенку камеры вычисляют из уравнения Ерм + Еум Еу (Еф + Ев + Ек), (1) где Ерм+Еум энергия электронов, приводящая к эффекту индуцированного мутагенеза под воздействием энергетических частиц пучково-плазменного разряда (Ерм) и прямых электронов ускорителя (Еум); Еу энергия электронов пучка в вакуумной трубке ускорителя; Еф + Ев +Е к потери энергии электронов пучка в выпускной фольге (Еф), атмосфере (Ев), в стенке камеры (полиэтилена) (Ек). При монотонном изменении поглощенной дозы электронного облучения в пределах 10-3 20 Мрад наступают состояния спор продуцентов, соответствующие так называемым кривым подавления микроорганизмов. Процессы гибели клеток и мутагенные явления в генетическом аппарате считают взаимосвязанными между собой и описывают исходя из определенных принятых математических моделей, которые поддаются экспериментальной проверке, так как они связывают происходящие явления с молекулярными поражениями, которые можно количественно оценить. Например, можно учесть число одиночных разрывов и двойных разрывов в спиралях ДНК либо одиночные разрывы в комплементарных ДНК, расположенных друг против друга, и созданных статистически независимо отдельными электронами. Исходя из соображений для продуцентов линкомицина можно записать В/Во= exp (Д- Д2), (2) где В фракция выживших клеток продуцентов антибиотика после облучения в дозе Д; Во фракция контрольных клеток; и параметры одиночных и двойных событий (описывают эффективность индукции и регенерации одно и двухнитиевых разрывов ДНК). При увеличении дозы облучения продуцента антибиотика выживаемость популяции, начиная с некоторого порога, для Act.roseolus после дозы 12,5 крад, начинает уменьшаться. При дозах, соответствующих предлетальным (В=0,0999%), число мутаций возрастает более чем в 500 раз, причем оказываются возможными как генные, так и хромосомные мутации и повороты участков хромосомы на 180о. После облучения производят рассев спор в чашки Петри на агаровую среду для получения моноспоровых вариантов культур, последующего определения их способности к образованию линкомицина и отбора высокоактивных вариантов культуры. П р и м е р 1. Готовят водную суспензию споркультуры Act.roseolus продуцента антибиотика линкомицина с начальной средней активностью 3500 мкг/мл. Вносят по 0,3 мл суспензии в два полиэтиленовых пакета с размерами 30х30 мм с толщиной полиэтиленовой пленки 40 мкм так, чтобы толщина слоя культуральной эмульсии была около 200-300 мкм. Пакеты закрывают герметично горячим роликом. Первый пакет (камеру) помещают в плазменный реактор перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 2 мм. Устанавливается угол падения электронного пучка 90о. Облучают первый пакет с суспензией в режиме: энергия электронов 100 кэВ, плотность тока 60 мкА/см2; длительность импульсов 0,5 с; пауза 3 с, число импульсов 300. При этом доза будет составлять 20 Мрад на всю культуральную суспензию. Второй пакет, контрольный, не облучается. После облучения производят рассев спор в чашки Петри на агаровую среду N 6 следующего состава, г/л воды: Кукурузный экстракт 10,0 Крахмал 10,0 Натрий хлористый 3,0 Аммоний сернокислый 3,0 Мел 2,5 Агар-агар 20,0 Чашки Петри при выращивании моноколоний помещают в термостат при температуре 27 1оС на 10 сут. Выросшие моноколонии (не менее 100 шт.) пересевают в пробирке на косой агар среда N 6 и инкубируют их в термостате при той же температуре в течение 7 сут. Для проверки активности монокультур производят засев кусочком культуры с косяка посевной колбы, содержащей 50 мл посевной среды следующего состава, г/л воды: Калий сернокислый 1,5 Кукурузный экстракт 20,0 Мел 5,0 Натрий хлористый 3,0 Сахар-сырец 15,0 Соевая мука 5,0 pH 6,5-6,7 Посевную культуру выращивают 48 ч при 27 1оС на качалке (200 качаний в 1 мин). Выросшей культурой засевают (в количестве 5% по объему) 40 мл ферментационной среды (в качалочных колбах) следующего состава, г/л воды: Калий сернокислый 1,5 Кукурузный экстракт 20,0 Меласса 20,0 Мел 8,0 Сахар-сырец 81,5 Соевая мука 45,0 Цинк сернокислый 0,2 Масло подсолнечное 25,0 pH 6,6-6,7 (доводят до стерилизации 40%-ным раствором едкого натра). Биосинтез ведут при 27 1оС на качалке (200 качаний в 1 мин) 168 ч. Определяют активность биологическим методом и отбирают варианты с активностью не менее 4000 мкг/мл. Биологическая активность контроля (пакет 2) оказалась на уpовне 3500 мкг/мл. П р и м е р 2 (пассаж). Полученную в примере 1 культуру штамма со средней биологической активностью 4000 мкг/мл используют для приготовления суспензии Act. roseolus в воде. Наливают по 0,3 мл водной суспензии в два предварительно стерилизованных полиэтиленовых пакета с размерами 30х30х0,1 мм (камеры) с толщиной стенки 40 мкм. Толщина культуральной жидкости при этом составляет 100-150 мкм. Укрепляют первый пакет в юстировочное устройство пучково-плазменного реактора перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 10 мм. Закрывают реактор свинцовой заслонкой. Облучение первого пакета производят в режиме: угол падения электронного пучка 120о, энергия электронов 180 кэВ, плотность тока электронов 2 А/см2, длительность импульса 0,1 мкс, пауза 1,5 с, доза облучения 0,1 Мрад. Второй пакет, контрольный, не облучают. После облучения производят рассев спор, выделение монокультуры и определение их активности, как указано в примере 1. Отбирают высокоактивные варианты. Средняя биологическая активность возросла с 4000 до 4550 мкг/мл. П р и м е р 3 (пассаж). Полученную в примере 2 культуру со средней биологической активностью 4550 кг/мл используют для приготовления суспензии спор в воде. Наливают 0,3 мл суспензии в предварительно стерилизованную полиэтиленовую камеру с размерами 30х30х0,1 мм с толщиной полиэтиленовой стенки менее 40 мкм и заваривают горячим роликом. Устанавливают камеру в пучково-плазменный реактор перед выпускным окном электронного ускорителя так, чтобы до плоскости выпускной диафрагмы было расстояние 50 мм. Устанавливают угол падения электронного пучка 80о. Облучают камеру с суспензией в режиме: энергия электронов 250 кэВ, плотность тока электронов 5 А/см2, длительность импульсов 0,1 мкс, пауза 6 с. При этом дозу облучения устанавливают 0,5 10-3 Мрад. Переворачивают камеру вокруг горизонтальной оси на 180о и облучают ее со стороны другой стенки в том же режиме с дозой облучения 10-3 Мрад. После облучения производят рассев спор, выделение монокультур и определение их активности, как указано в примере 1. Выбирают высокоактивные варианты. Биологическая активность культуральной жидкости составляет 4600-5000 мкг/мл. Таким образом, активность продуцента повысилась в предлагаемом техническом решении на 1000-1500 мкг/мл.
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА АКТИНОМИЦЕТА ПРОДУЦЕНТА ЛИНКОМИЦИНА, предусматривающий облучение культуры Streptomyces roseolus заряженными частицами и отбор клонов, проявляющих большую антибиотическую активность, отличающийся тем, что культуру облучают энергетическими электронами с регулируемыми параметрами энергии 100 250 кэВ, плотности тока 6 10-5 -5,0 А/см2 в возбуждающем пучке при длительности импульса облучения 0,5 10-7 с и паузах между облучением 1,5 6 с, причем доза облучения составляет 10-3 -20 Мрад.