Способ получения антибиотика а 82810 или его производных, и штамм астinомаdurа fiвrоsа - продуцент антибиотика а 82810

Патент 1825377

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Использование: в микробиологической промышленности для получения нового полиэфирного антибиотика А82810, применяемого в ветеринарии. Сущность изобретения: штамм Actlnomadura fibrose NRRL 18348 выращивают в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде. Экстрагируют мицелий и выделяют новый полиэфирный антибиотик А 82810. При необходимости проводят реакцию антибиотиков с изоцианатом или ацилируют, или этерифицируют, или переводят его в соль. Приведены морфологические, физиологические , биохимические характеристики нового штамма A. fibrosa NRRL 18348. 1 з. п. ф-лы, 6 ил, 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

П9) (I!) (я)5 С 12 Р 1/06//С 12 R 1:03

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ мео

0" не ме ,ме еН íå Н нное ноос

Не не (21) 4613956/13 (22) 28.04,89 (46) 30.06,93. Бюл. Ме 24 (31) 189499 (32) 02.05.88 (33) US (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Роберт Л.Хэмилл и РэймондЧе<Ьонг Aao(US) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

А 82810 ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ И

ШТАММ ACTINOMADURA FIBROSA вЂ” ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА А 82810 (57) Использование: в микробиолоГической промышленности для получения нового поИзобретение относится к новому полиэфирному антибиотику, в частности оно относится к антибиотику А82810 и его получению при помощи выращивания нового микроорганизма, Изобретение обеспечивает полиэфирный антибиотик, называемый А82810, Вестли разделил существующие антибиотики по классу и типу. Используя систему Вестли, А82810 является новым сленом класса Iв, типа (1), группы полиэфиров, так как он характеризуется одной спирокетальной системой. Другие члены этой группы включают А80190; А-28695А и В; А2041 и

11; А-32887; карриомицин, этеромицин;

GP вЂ” 47. 434, РР37454 и антибиотики Х14868.

Таким образом, в одном аспекте изобретение обеспечивает соединение А82810 формулы I лиэфирного антибиотика А82810, применяемого е ветеринарии, Сущность изобретения: штамм Actinomadura fibrose 1чйй1

18348 выращивают в условиях аэрации и перемешивания в питательной среде. Экстрагируют мицелий и выделяют новый полиэфирный антибиотик А 82810. При необходимости проводят реакцию антибиотиков с изоцианатом или ацилируют, или этерифицируют, или переводят его в соль, Приведены морфологические. физиологические, биохимические характеристики нового штамма А. fibrosa ЙЯВ1 18348, 1 3. и. ф-лы, 6 ил, 3 табл, где R вЂ” водород или вЂ” CONHR>; Rl вЂ” алкил, арил,алкил-арил,арил-алкил,галоарил, нитроарил, галоарилалкил, алкоксиарил. арилоксиарил, арилциклоалкил, ациларил и циклоалкил; или ациловый или алкиловый эфир или производное алкилового эфира или его соль.

Характеристики А82810.

Установлено, что антибиотик А82810 имеет структуру 1 (основываясь на массспектрометрии и ЯМР). АЯ2810 (в его форме свободной кислоты) имеет следующие характеристики:

1825377

Состояние: белые кристаллы; т. пл, 6971 С: рКэ. 6,6 160 % водныи дил етилсулвфоксид); (a)sap Д:-7 35 (с I, МеОН), Молекулярная масса 842 (полевая десорбционная масс-спектрометрия). Эмпирическа формула С4ьНтв014. Уф-спектр: только конечная абсорбция ИК-спектр (CHCla): абсорбция при следующих частотах, см

3020, 2977, 2935, 2880, 1726, 1458, 1379, 1206, 1164, 1146, 1115, 1104, 1094, 1073, 1050, 1025, 1006, 991, 980 и 946.

Нерастворим в воде, растворим в низших спиртах, таких как метанол, кетонах, таких как ацетон, сложных эфирах, таких как этилацетат, галогенированных углеводородах, таких как хлороформ и углеводородах, таких как диэтиловый эфир, бензол, толуол и теплый гексан.

Как следует из его структуры, А82810 имеет кислую функцию, способную образовывать соли и производные эфиров, л имеет по меньше мере одну группу, которую можно этерифицировать или которая образует производные эфира.

Соединения формулы l, где R отличается от водорода, называются производными уретана. Соединения формулы l полезны

КаК антибиотики и как агенты, которые увеличивают эффективность использования кормов.

Термин иацилн означает часть C> вЂ” С7, предпочтительно С1-С1 -алкановой кислоты, т. е. радикалы формулы

R1 -СО где Rla вЂ” С1-06-алкил или водород, например формил, ацетил, пропионил, бутурил и тому подобное.

Термин ициклоалкили означает циклические углеводородные группы, содержащие

3-7 атомов углерода, такие как циклопропил, циклобутил, циклогексил и тому подобное, причем предпочтителен циклогексил.

Циклаалкилгруппа может эамещаться арильным остатком, определенным в описании, для образования арилциклоалкильного остатка, например, 2-(фенил)циклопропил.

Термир иалкоксии означает С1-С7 низшую алкилгруппу, имеющую замещенную кислородну функцию, такую как метокси, этокси, пропокси, тому подобное, Термин "арил" означает ароматический остаток, полученный удалением атома водорода иэ ароматического углеводорода, так как, например, фенил, пиридил или фурил, особенно фенил. Радикал "арили может эамещаться различными группами. Заместитель на фенильных ядрах находится предпочтительно в положении. Примерами

55 щают методами, такими как колоночная хроматография.

Изобретение дополнительно обеспечивает биологически чистую культуру нового вида NRRL 18348 Actinomadura fibrosa или его мутанта. Для удобства этот микрооргаявляются 4-алкиларил, например, 4-мвтилфенил (4-толил); 4-галофенил, например 4-хлорфенил; 4-нитрофенил;

4-ариоксиарил, например 4-фенилсифенил;

4-алкоксифенил, например 4-метоксифенил; 4-(алкил-карбонил)фенил, например

4-(метил карбонил)фенил или 4-(фенилкарбон ил)фен ил).

ТЕРМИН иаЛКИЛи ОЗНаЧаЕтИ С1-СтуГЛЕВО10 дород с прямой или разветвленной связью, предпочтительно С1 вЂ” С4 углеводород, например метил, пропил, изопропил, н-бутил и т, и. Алкильную группу можно заместить арильным остатком для образования ари"5 лалкильного остатка, например фенил-атил или 2-фенилэтил или галоарильным остатком для образования галоарилалкильного остатка, например 4 бромфенетил.

Соли А82810 и его производные полезны для разделения и очистки антибиотиков.

В частности, полезны фрмацевтически-приемлемые соли. Примерами таких солей являются соли щелочных металлов, соли щелочно-земельных металлов и соли амина

А82810 и его производных.

Репрезентативные и приемлемые соли щелочных и щелочно-земельных металлов включают соли натрия, калия, лития, цезия, рубидия, бария, кальция и магния. Приемлемые соли амина включают аммоний и первичный, вторичный и третичный

Ñ1-С4-алкиламмоний и соли окси вЂ” C>-C4алкиламмония, Иллюстративные соли амина включают те соли, которые образуются

35 реакцией А82810 с гидроксидом аммония, метиламином, фтор-бутиламином, изопропиламином, диэтиламином, диизопропиламином, этаноламином, триэтиламином, 3-амина-1-пропанолом и т, и. При лечении животного не играет большого значения, используется ли свободное основание или соль соединения. Однако, соль можно выбрать по причинам экономии, удобства или токсичности.

Другим аспектом изобретения является способ получения А82810, который включает выращивание Actinomadura flbrosa ййй1

18348 или его мутанта в условиях глубинного аэробного брожения, чтобы получить ан50 тибиотик А82810, и необязательное превращение в соль. А82810 экстрагируют из ферментационного бульона и иэ мицелия полярными органическими растворителями, А82810 отделяют и дополнительно очи1825377 низм называют А82810. 1. Культура А82810 является естественным вариантом, полученным иэ родительского штамма (культура А82810), который выделяли из образца почвы в Того (Западная Африка).

Культуру А82810 вЂ” продуцирующего организма осадили и сделали частью коллекции штаммов Северного регионального исследовательского центра, Сельскохозяйственные исследования, Северо-Центральный район, 1815 Норс университи стрит, Пеория, Иллинойс 61604, из которой ее можно получить под номером НИИИ 18348.

Таксономические исследования варианта проводят Frederlch P Mertz из Липли ресич пабораторис, Основываясь на этих исследованиях, новый организм классифицируют как новый вид рода Actlnomadura c видовым названием Actlnomadura flbrosa

sp. поч,. Эта классификация базируется на лабораторном сравнении с аналогичными видами и сравнении характеристик А82810.

1 с опубликованными описаниями характеристик аналогичных видов.

Гидролиз крахмала определяют проверкой на наличие крахмала иодом на пластинах ISP М 4 (неорганические соли-крахмальный агар), NaCI вЂ” устойчивость измеряют добавлением NaCI в агар ISP N 2 для выравнивания требуемой концентрации, Дпя присвоения названий цветов обратной стороне и воздушным гифам, соответственно, используют ICSS-YBS "Центроидные цветовые диаграммы", стандартный образец М 2106 (национальное бюро стандартов, Министерство торговли США, Вашингтон).

Морфологию изучают, используя оптический микроскОп и сканирующий электронный микроскоп (SEM).

Изомеры диаминопимелиновой кислоты (ДПК) в гидролизатах целых клеток определяют хроматографическими методами.

Устойчивость к антибиотикам измеряют набивкой дисков чувствительности к антибиотикам на поверхность посеянных чашек с агаром ISP М 2, Устойчивость оценивают как (1), если не наблюдалась зона подавления и как (-), если такая зона наблюдалась.

Миколовые кислоты и фосфолипиды определяют известными методами. Жирные кислоты анализируют по системе идентификации микробов HP 5898 А, Метиповые эфиры жирной кислоты получают иэ лиофилизированных целых клеток, выращенных при идентичных условиях, Дендограмма основывается на звклидовом расстоянии и была создана при помощи ЭВМ, Анализ основных компонентов является двухмерным и был также получен при помощи ЭВМ.

Культуральные характеристики.

5 Культура А82810. 1 хорошо растет нв сложных и определенных средах. Однако воздушный мицелий получают редко, кроме среды Z ISP, агара Баннета и агара томатная паста/овсяная мука (ТРО). При продуциро10 вании масса воздушных спор по цвету белорозовая. Обратная сторона была красно-коричневая до четко выраженного красно-оранжевого цвета. Не наблюдают растворимые пигменты. Культуральные ха15 рактеристики А82810, 1 на различных агаровых средах приведены в табл. 1, Морфологические характеристики.

Культура А82810. 1 создает обильный субстратный мицелий. Воздушные гифы не20 обычны, При наблюдении под оптическим микроскопом и СЭМ сегментацию в спорах не наблюдают. Гиф, по-видимому, должен быть полностью аспороганным, Легко различимы многочисленные пучки гифав, обра25 зующих толстые волокна. Некоторые из этих гифов образуют короткие шишки или выступы, которые напоминают споры. Исследование при помощи СЭМ показывает, что эти структуры не настоящие споры. Иногда на- .

30 блюдаются другие волокнистые структуры.

Эти структуры в дополнение к волокнистому виду воздушного гифа, являются основой для имени штамма flbrosa.

Физиологические характеристики.

35 Культура А82810, 1 продуцирует кислоту из следующих углеводородов: адонитол, Lарабиноза, целлобиоза, фруктоза, галактоза, глюкоза, глицерин, глюкоген, лактоэа, мальтова, манноза. рамноза, рибоза, саха40 роза, трехалоэа и ксилоэа. А82820. 1 не продуцирует кислоту иэ: Д-арабинозы, целлюлозы. декстрина, дулцитола, этанола, эрилритола, инозитолв, инулина, маннитола меллизитоэы, мелибиоэы, альфа-метил-Д45 глюкозида, раффинозы, салицина, сорбита, сорбозы и ксилитола;

Культура А82810. 1 использует следующие органические кислоты (как соли натрия): ацетат, бутират, пропионат и пируват.

50 Она не использует бензоат, цитрат, формат, лактат, малат, мукат, оксалат, сукцинат и тартрат.

А82810. 1 разлагает казеин, эластин, эскулин, гипоксантин, крахмал, тестостерон, 55 тирозин и мочевину. но не разлагает аденин,аллантоин,малат кальция,гуанин,хиппурат и ксантин.

А82810. 1 продуцирует каталазу, фосфатазу и уретвзу; сжиженный желатин; гидролизный латекс и способна выжить при 50"С

°1825377

8 ч. Она не продуцирует меланоидные пигменты или HzS, восстановленные нитраты или пентонизированный снятый латекс.

А82810. I устойчива к цефалотину (30 мг), линкомицину (2мкг) пенициллину G (10 единиц), рифампицину (5 мкг) и лизозиму (50 мкг/мл). Она чувствительна к бацитрацину (10 единиц), гентамицину (10 мкг), неомицину (30мкг), олеадомицину (15 мкг), стрептомицину (10 мкг). тетрациклину (30 мкг), тобрамицину(10 мкг) и ваномицину (30 мкг).

Культура A82810. I растет в интервале температур 20 вЂ” 45 С. Оптимальная температура роста 37 С. Культура устойчива к

NaCI при уровнях до 5 включительно, Анализ клеточных оболочек, Гидролизированные целые клетки содс-.пжат мезодиаминопимелиновую кислоту. .В экстрактах целых клеток обнаружены следующие сахара: галактоза, глюкоза, манноза, мадуроза и рибоза. Таким образом, А82810. 1 имеет тип III оболочки клетки и набор сахаров типа В, Обнаружены миколовые кислоты. Фосфолипидные оценки на целой клетке показывают наличие фосфатидилинизитола, дифосфатидилглицерина и GbeNu (неизвестная структура, содержащая глюкозамин).

Не обнаружены фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин. Следовательно, А82810.

1 имеет набор фосфолипидов типа IY. Менахинонами, обнаруженными в А02810, 1, были гексагидрогенированные менахиноны с

9 изопропеновыми единицами, МК-9 (Нб) и небольшое количество октагидрогенированных менаинонов, МК-9 (Н8).

Идентификация штамма А82810. 1, Хемотаксономические свойства и культуральные и морфологические характеристики А82810. 1 подтверждают отнесение данного изолята к роду Actlnomadura.

23 штамма Actlnomadura выращивают вместе с культурой А82810. 1 на 21 различных агаровых средах. Сравнивают культуральные и морфологические характеристики. Культура А 82810, 1 имеет подобие со следующими штаммами: А.

coerulea, Л. madurae, А. pulveractus, А.

roseorufa, А. rubua, А.salmonea и А.

verrucosospora.

Биохимические характеристики этих семи штаммов собирают из литературы и сравнивают с А82810. 1, создавая таблицу коэффициентов общности.

Табл. 2 суммирует эти данные.

Анализ жирных кислот проводят на целых клетках этих культур.

Коэффициенты общности и анализ жирных кислот показывают, что иэ семи извест5

40 ных сравниваемых видов А82810. 1 имеет наибольшее число аналогичных характеристик с А, pulveraceus и А.verrucoaospora.

Однако эти общности недостаточны, чтобы заключить, что А82810, 1 является штаммом каждого вида. Табл. 3 показывает различия между А82810. 1 этими двумя видами.

Это исследование подтверждает вывод, что, следовательно, культура А82810. 1 является новым видом Actlnomadura, В этой связи культура А82810, 1 названа Actlnomadura

flbrosa sp. nov, латинское определение

fibrosa относится к волокнистому виду воздушного гифа, Культуральной средой, используемой для выращивания культуры Actlnomadura

fibrosa, может быть любая одна из ряда сред. Однако для экономии в продуцировании, для оптимального выхода и легкости выделения продукта, предпочтительными являются культуральные среды. Например, предпочтительными источниками углеводорода в крупномасштабном брожении являются глюкоза и картофельный декстрин, хотя можно также использовать рибозу, ксилозу, фруктозу, галатозу, маннозу, маннит и т. и.

Предпочтительными источниками азота являются фермент-гидролизованные казеин и дрожжи, хотя можно также использовать печеночную муку, мясные пептоны, рыбную муку и т. и. Среди питательных неорганических солей, которые можно вводить в культуральную среду, находятся бытовые растворимые соли, способные обеспечить выход цинка, натрия, магния, кальция, хлорида, карбоната, сульфата, нитрата и т. п.

Важные микроэлементы, необходимые для роста и развития организма, следует также ввести в культуральную среду. Такие микроэлементы обычно встречаются. как примеси в прочих заместителях среды в количествах, достаточных для удовлетворения требований к выращиванию организма. Пенообраэование обычно не вызывает проблем, но небольшие количества (т. е, 0,2 мл/л) антипенного агента, такого как полипропиленгликоль, можно добавить в среду крупномасштабного брожения, если это необходимо.

Для получения значительных количеств антибиотика А82810 предпочтительным является глубинное аэробное брожение в резервуарах. Небольшие количества А82810 можно получить при помощи культуры, выращенной во встряхиваемой колбе. Из-за временных задержек, в производстве антибиотиков обычно связанных с засевом больших оезервуаров споровой формой

1825377

10 организма, предпочтительно использовать вегетативный инокулят. Вегетативный инокулят получают засевом небольшого объема культуральной среды спорами или фрагментами мицелия организма для получения свежей, активно растущей культуры организма, Вегетативный инокулят затем переносят в большой резервуар. Среда вегетативного инокулята может быть такой же. которая используется для массовых ферментаций, но также пригодны и другие среды.

А82810 получают при помощи А82810продуцирующего организма, который выращивается при 25 вЂ” 40 С. Оптимальной температурой для производства А82810 является температура 34-36 С.

Как принято в процессах глубинного азробного брожения, стерильный воздух снизу вводят в резервуар, в то время как среда перемешивается обычными турбинными импеллерами. Максимальное поглощение кислорода при брожении при условиях, используемых до сих пор. не превышало 0,35 мМ/л/мин. В полностью закрытом 165-литровом ферментере, содержащем примерно 115 л бульона, скорость брожения 0,125 объем/объем/мин при скорости перемешивания 300 оборотов в 1 мин достаточна для сохранения уровня растворенного кислорода при или выше 45 воздушного насыщения при давлении 0,34 атм.

3а продуцированием антибиотика

А82810 во время брожения можно следить путем тестирования проб бульона на антибиотическую активность против организмов, которые, как известно, чувствительны к этому антибиотику, Одним пробным организмом, полезным при тестировании

А82810, является Bacillus subtills АТСС

6633. Биологическую пробу обычно выполняют при помощи реакции подавления вегетативных колоний в агаровом геле.

После его продуцирования при условиях глубинного аэробного брожения, AS2810 можно извлечь из среды брожения методами, используемыми в технике брожения. Антибиологическая активность, продуцированная во время брожения

А82810-продуцирующего организма. проявляется в отфильтрованном бульоне и мицелиевой массе. Однако максимальное извлечение сопровождается начальной фильтрацией среды для отделения бульона от массы мицелия. Отфильтрованный бульон и массу мицелия затем можно очистить отдельно и получить соответствующую часть А82810, При этой очистке можно использовать множество способов. Предпочтительный метод для очистки отфильтрованного бульона включает регулирование до рН около 9 и экстрагирование приемлемым растворителем, таким как, например, этилацета1. Затем экстрагирующий

5 растворитель можно испарить под вакуумом и получить бульонную часть А82810.

Предпочтительным методом очистки мицелия является экстрагирование выделенного отфильтрованного осадка мицелия

10 пригодным растворителем, таким как, например, ацетон. После этого экстрагирующий растворитель испаряют под вакуумом и получают концентрированный водный раствор. Датем этот водный раствор регулиру15 ют до рН 9 и экстрагируют приемлемым растворителем, таким как этилацетат. Экстрагирующий растворитель после концентрируют под вакуумом и получают мицелиевую часть А82810, 20 Бульонную и мицелиевую части А82810 дополнительно счищают аналогичными процедурами. Предпочтительная процедура включает хроматографию на силикагеле.

С другой стороны, культуральныс твер25 дые вещества, включающие составляющие среды и мицелий, можно использовать без экстрагирования или выделения, но пред-, почтительно после удаления воды, как источник А82810. Например, после

30 продуцирования А82810, весь ферментационный бульон обезводить лиофилизацией, сушкой в барабане или азеотропной дистил. ляцией и сушкой. Сухой бульон затем непосредственно подмешивают к кормовым

35 добавкам.

Катионные соли щелочных и щелочноземельных металлов соединений формулы 1 получают в соответствии с процедурами, которые рбычно используются дл получения

40 катионных солей. Например, свободную кислоту А82810 растворяют в приемлемом растворителе, таком как ацетон, добавляют

1/3 объема воды и этот раствор регулируют до рН 9 вЂ” 10 при помощи основания необхо45 димой катионной соли (например, NaOH, КОН), Таким образом полученную соль можно выделить обычными способами, такими как фильтрация или испарение растворителя.

Предпочтительным способом формирования солей является растворение А82810 (кислотная форма) в несмешивающемся с водой растворителе, таком как этилацетат, добазлении равного объема воды и коррекTvlpoDKo смеси до рН 10 соответствующим катионным основанием (например, NaOH, КОН и т. и,). Выделенную органическую фазу промывают водой и концентрируют до сухого состояния. Остаток лиофилизиру от из ди1825377

12 оксана, Соль можно кристаллизировать из соответствующего растворителя, такого как гексан.

Соли, образуемые органическими аминами, можно получить аналогично, например, газообразный или жидкий амин можно добавить в раствор А82810 в приемлемом растворителе, таком как ацетон, растворитель и избыточный амин можно удалить испарением, Производные ацилового эфира формулы I получают, например, обработкой

А82810 соответствующими ангидридом карбоновой кислоты или хлоридом кислоты, Этерификация имеет место с одной из гидроксильных групп А82810. Такие сложные эфиры обычно получают реакцией А82810, например с соответствующим ангидридом карбоновой кислоты при комнатной температуре.

Производные алкилового эфира формулы I получают этерификацией карбоксильной группы, используя стандартные процедуры, Производные алкилового эфира формулы I обычно менее активны при испытании in vitro, Однако при введении животным такие сложные эфиры могут действовать как предшественники лекарств, которые преобразуются в активную форму In vlvo.

Производными алкилового эфира формулы 1 являются такие соединения, где одна или несколько гидроксильных групп заменены УВ2 группой, где Y вЂ” 0 или S; RzвЂ”

С1-Св-а л к ил, С1-С4-ал кокси-Ñz-С -ал кил, С вЂ” С4-алкокси-карбонил-Cz вЂ” С -алкил, амина-Cz-С -алкил, меркапто-Cz-С -алкил, о ксиал к ил, гал оал к ил, или (R>) -фенил(СН2)п-, где RI -Cf â€” C -алкил, С1-С4-алкокси или гидрокси; m 0 вЂ” 2 и п 0-3.

Термины алкил и алкокси имеют определенные значения, но ограничены числом определенных атомов углерода.

Термин "оксиалкил" относится к частице моноокси-Cz-C -алкила или если Y равен

О, то к частице 2, З-диоксипроп-1-ила, Термин "галоалкил" относится к части

С -Св-алкила, имеющей от одного до трех заместителей, выбранных из группы, состоящей из брома, хлора и фтора. Если алкиловая часть дигало- или тригало-замещенная, галозаместителями должны быть такие же галогенные части.

Предпочтительными производными эфира формулы являются те соединения, где Y вЂ” О, R вЂ” С1вЂ” - Cg-алкил. Производные простого эфира получают реакцией соответствующего А82810 соединения или его соли

55 с требуемым первичным спиртом или тиолом.

При использовании некоторых исходных спиртов или тиолов может возникнуть необходимость добавить кислотный катализатор в реакцию, Приемлемые катализаторы включают соляную кислоту. серную кислоту, метансульфокислоту, бензолсульфокислоту, толуолсульфокислоту, диоксид селена и трифтористый бор.

Для облегчения реакции можно добавить растворитель, такой как, например, Bo" да. ацетон, бензол, простой эфир, тетрагидрофуран. или диоксан. Реакция обычно происходит при комнатной температуре, хотя испольэовать и более высокие температуры.

Хотя обычно процедуры подработки реакции иногда достаточные, может потребоваться дополнительная очистка для получения соединений изобретения. Такую очистку можно выполнить хорошо известными методами, такими как колоночная хроматография, тонкослойная хроматография, фракционированная кристаллизация и т. и.

Обеспечивается также способ получения производных уретана формулы 1, который включает реакцию А82810 или его соли с изоцианатом формулы 11

R> вЂ” NCO, где R1 имеет определенные значения, для образования производного уретана А82810;

Предпочтительно, используется соль

А82810, в частности соль натрия, Изоцианат следует добавлять с незначительным избытком, например, избыток около 10, для образования монопроизводного в оптимальном количестве. Реакцию предпочтительно проводят в инертном растворителе, таком как хлорированный углеводород, например четыреххлористый углерод, хлористый метилен или хлороформ, простой эфир, этилацетат, или в ароматическом углеводородном растворителе, таком как бензол или толуол. Температура реакции не критическая величина, но может лежать в диапазоне от 0 до точки кипения реакционной смеси, но предпочтительно это комнатная температура.

Соединенная формула I (соединения

А82810) имеют антибактериальную и антикокцидиоэную активность. Соединения

А82810 особенно активны против анаэробных бактерий.

Антикокцидиодная активность является важным свойством соединений А82810, например, в испытании "ткань-культура" против Elmeria tenelta A82810 активен при <

0,0025 мкг/мл, пропионил-А82810 активен

1825377 при 0,05 мкг/мл и ацетил-А82810 активен при 0,01 мкг/мл.

Для лечения кокцидиозов у домашней птицы нетоксично антикокцидиозное количество соединения А82810 вводится зараженной или падозрительнбй птице, предпочтительно орально, на основе суточного приема. Соединение А82810 мажет поставляться многими путями, но наиболее часто оно поставляетсл с фармацевтически 10 приемлемым носителем, предпочтительно кормом, заглатываемым птицам. Хотя при определении пригодной концентрации соединения А82810 необходимо учитывать множество факторов, нормы введения обычно находятся в диапазоне 0,5 вЂ” 100 ° 10 в

-6 корме и предпочтительно в диапазоне 1 вЂ” 25х

xi 0 6 кормового рациона.

На фиг. 1-6 приведены графики, поясняющие предлагаемый способ. 20

Пример 1. Получение А82810.

А. Брожение во встряхиеаемой колбе

А82 810.

Используют культуру Actlnomadura

flbrosa sp. поч NRR2 18348 либо в форме 25 лиофилизираванной гранулы, либо как суспензию, поддерживаемую в жидком азоте, для засева питательной среды, имеющей следующий состав;

Питательная среда 30

Ингредиент Количество,мас. ф

Глюкоза 1,0

Растворимый крахмал 2,0

Экстракт дрожжей 0,5 35

Ферментный гидролизат каэеина 0,5

СаСОз 0,1

Деионизированная вода Дополнение до л 40

Некорректированное рИ - 6,6 добавить

NaOH для увеличения рН до 7,2 до стерилизации, рН после стерилизации = 6,8.

Приготавливают скошенные питательные среды или чашки, добавляя 2 (, агара к 45 питательной среде, Выращивают засеянную скошенную питательную среду при

30 С 10-414 суток. Отделяют созревшую культуру стерильным инструментом для разрыхления спор и удаляют и маскируют 50 слой мицелия. Используют примерно 1/4 разрыхленных спор и культуры для засева

50 мл питательной среды первой стадии.

Выращивают засеянную среду первой стадии в 250 мл колбе Эрленмейера при 55

30 С 120 ч на вибраторе, который вращается по 2-люймавай окружности (5,08) со скоростью 250 оборотов в 1 мин.

Используют эту выращиваемую среду первой стадии (0,4 Mn) для засева 50 мл

20 мл рабочей среды, имеющей следующий состав;

Ингредиент Количество. г

Глюкоза 5

Ферментный гидролизат казеина (NZ-амин А)

Дрожжевой экстракт сырая меласса

Mg SO4 (безводный)

СаСОз

Картофельный декстрин

Метилолеат

Холодная водопроводная вода До1л

Корректировать рН при стерилизации до рН 7 при помощи 5 í NaOH.

Выращивают засеянную рабочую среду в 250 мл колбе Эрлейнмейера с широким горлом при 30 вЂ” 32 С 8 вЂ” 10 сут на вибраторе, который вращается по 2-дюймовой окружности со скоростью 250 оборотов в 1 мин.

B. Брожение в резервуаре А82810.

Для обеспечения большого количества инакулята используют 10 мл засеянной среды первой стадии, полу,енной как описано в разделе А, для засева 400 мл питательной среды второй стадии, имеющей тот же состав. что и среда первой стадии. Выращивают эту вегетативную среду второй стадии в

2 колбе Эрленмейера с широким горлом 72 ч при 30 С на вибраторе, который вращается по 2-дюймовой окружности со скоростью

250 оборотов в 1 мин.

Используют эту вь1ращенную вегетативную среду второй стадии (800 мл) для засева

115 л стерильной среды (полученной как описано в разделе А, за исключением добавления антивспенивателей). Позволяют этой засеянной рабочей среде сбраживаться в

165 л перемешиваемом бродильном резервуаре 8 вЂ” 10 сут при 34 С. Поддерживают уровень растворенного кислорода выше 40 насыщенным воздухом при низком воздушном потоке (0,12-0,25 объем/объем/мин) и низкой скорости вращения (150 вЂ” 200) оборотов в 1 мин перемешиваемого резервуара.

Пример 2. А82810 получают, используя метод примера 1. Вегетативная среда второй стадии имеет следующий состав:

Ингредиент Количество, г/л

Дрожжевой экстракт 5

Глюкоза 5

Картофельный декстрин 10

MgSO4 7Н20 2

Глицерол 1

Деиониэированная вода Да 1 л

1825377

До1л

Некорректированное рН = 6,5; корректировки рН нет, рН после стерилизации =

6,4

Рабочая среда имеет следующий состав:

Ингредиент Количество, г/л

Глюкоза 10

Мука из свиной печени 15

Сырая меласса 5

MgS04 7Н20 0

Картофельный декстрин 25

Водопроводная вода До 1 л

Некорректированное рН = 6,1; корректировать до рН = 7 при помощи 170 мл 5 н

NaOH; рН после стерилизации =- 6,4. Добавленный антивспениватель Sag 471 (0-2 г/л) и P-2000 (0,1 мл/л)

Пример 3, А82810 получают. используя процедуры примера 1, Питательная среда имеет следующий состав:

Ингредиент Количество, г/л

Три птикаэный соевый бульон 30

Дрожжевой экстракт 3

Глюкоза 5

Мал ьтоза 4

MgSO4 7HzO 2

Деионизи рован ная вода рН = 7 (без коррекции), Засеянная среда первой стадии выращивается при 36 С 48 ч.

Засеянная среда второй стадии выращивается при 36 С 24 ч, Объем рабочей среды равен 10л, температура выращивания 36 С и состав:

Ингредиент Количество, г/л

Картофельный декстрин 30

Глюкоза 10

Ферментный гидролизат казеина (NZ-амин А) 3

Дрожжи 5

Сырая меласса 15

MgSOq (безводный) 1

СаСОз 2

Водопроводная вода До1л

Некорректированное рН = 6,3: корректируют до рН 7,5 н NaOH: постерилизационное рН = 6 4. Добавленный антивспениватель: Sag 471 (0,2 г/л) и P-2000 (0,5 мл/л).

Пример 4. Выделение А82810. Все сбраживаемые бульоны иэ двух 100-л резервуаров, полученные способом, аналогичным

45 описываемому в примерах 1 и 2, объединяют (215 л) и профильтровывают через фильтр-пресс, используя ускоритель фильтрования для получения 180 л фильтрата.

Фильтровальную лепешку мицелия экстрагируют дважды ацетоном (каждый раз

60 л). Ацетоновые экстракты объединяют и концентрируют в вакууме до объема 18 л.

Концентрат объединяют с фильтратом бульона. Эту смесь корректируют до рН 9 5 н, едким натром и результирующий раствор экстрагируют 2/3 объема этилацетата, перемешивают 1 ч и охлаждают всю ночь. Экстракт этилацетата (115 л) разделяют, смешивают с небольшим количеством ускорителя фильтрации и профильтровывают, Осветленный экстракт концентрируют в вакууме до остатка.

Этот остаток растворяют в толуоле (200 мл) и раствор вносят в колонку, содержащую

2 л силикагеля (Grace Grade, 20-300 меш), наполненной в толуоле. Колонку промывают толуолом (10 л) проявляют смесью толуол: этанол (последовательно 10 л каждый раз (98; 2), (96: 4) и (90: 10), собирая 1-л фракции.

Элюирование А82810 контролируют биологической пробой, используя Baclelus

SubtIlis и лизис в чашках с эритроцитным агаром. Фракции, содержащие большую часть А82810 (М 13-20), объединяют и концентрируют до масла. Это масло растворяют в диоксане (200 мл), высушивают вымораживанием и получают сырой А82810, а также как масло, Сырой А82810 растворяют в хлороформе (200 мл) и вносят колонку, содержащую

2 л силикагеля (Grace Grade 62, 20-300 меш), упакованную в хлороформ, Колонку промывают хлороформом (10 мл) и элюируют смесью хлороформ: ацетон (последователь° но 10 л каждый раз (9: 1), (4: 1), (7; 3) и (1;

;1) и затем ацетоном (10 л) и собирают 1-л фракции.

Фракции контролируют биологической пробой и сгруппировывают в соответствии с результатами биологической пробы следующим образом: N 6-9 (группа А), М 10-18 (группа В) и N- 19-28 (группа С). Каждую группу концентрируют до остатка, который растворяют в диоксане и высушивают вымораживанием. Группы А и С-масла, которые требуют дополнительной очистки, в то время как группа В-9,9 г А82810 в виде белого порошка, Группу А растворяют в ацетоне (900 мл) и добавляют в воду (1 л) рН раствора корректируют до 9 при помощи 5 í NaQH u раствор концентрируют в вакууме до объема 1 л. Концентрат экстрагируют дважды толуолом, обьединенные экстракты экстра17

1825377

18 гируют, высушивают замораживанием из диоксана и получают дополнительно 2,8 г

А82810 в виде белого порошка.

Группу С обрабатывают аналогично, но после сушки замораживанием она все еще масло. Это масло растворяют в ацетонитриле (50 мл), в результате немедленно образуются кристаллы. Кристаллы отфильтровывают, обезвоживают в вакууме и получают еще 1244 мг чистого А82810 как соль натрия (т, и. 173 вЂ” 175 С).

Пример 5. Кристаллизация соли натрия А82810..

Аморфную соль натрия А82810 (400 мг) суспендируют в гексане (50 мл) обработкой ультразвуком в испытательной трубе и затем выдерживают при комнатной температуре. Кристаллы, образовавшиеся на боковой стенке трубки, удаляют, обезвоживают в вакууме и получают 50 мг чистой соли натрия А82810 (т. и. 255 вЂ” 257 С).

ИК-спектр (в СНС!з) показывает максимум поглощения при следующих частотах, см : 3020, 2970, 2952, 2936, 2679, 1570, 1458, 1339, 1380, 1363, 1359, 1163, 1115, 1093, 1075, 1067, 1054, 1027, 1010, 1001,990, 979 и 940. Масс-спектр полевой десорбции (FD), Пример 6, Получение А82810 (свободная кислота), А82810 (соль натрия, 200 мг) получают как пример 4 и растворяют вдиоксане(75 мл). В этот раствор добавляют воду (25 мл), рН результирующего раствора корректируют до 3 добавлением 1 н, HCI. Подкисленный раствор перемешивают 1 ч и затем дважды экстрагируют хлороформом (каждый раэ 100 мл). Экстракты хлороформа обьединяют и концентрируют в вакууме и получают свободную кислоту А82810, П р и м.е р 7. Получение ацетил-А82810.

А82810(натриевая соль, 200 г) растворяют в пиридине (4 мл), добавляют уксусный ангидрид (4 мл) и смесь выдерживают при комнатной температуре 40 ч, Добавляют воду (10 мл) и водный раствор эктрагируют хлороформом (50 мл). Хлороформовые экстракты последовательно промывают каждый раз 50 мл 0,1 н. HCI, водой, содержащей 1 йаНСОз, и водой. Затем хлороформовый экстракт концентрируют в вакууме до остатка и остаток растворяют в ацетоне. Раствор ацетона концентрируют в вакууме для удаления остаточного пиридина и уксусной кислоты. Эту стадию повторяют три раза и результирующий остаток растворяют в бензоле, высушивают замораживанием и получают 204 мг ацетил А82810 (соль натрия).

Молекугярная масса - 906 по массспектрометрии бомбардировки атомам (FAB MS).

ИК-спектр (в СНСЦ показывает максимум абсорбции на следующих частотах, см: 3021, 2976, 2935, 2880. 2831, 1728, 1458, 1379, 1357, 1321, 1314, 1247, 1226, 1223, 1201, 1185, 1101, 1076, 1956, 1024, 990, 981, 947, 929, 896, и 875.

Пример 8. Получение пропионилА82810. А82810 (соль натрия, 200 мг) растворяют в пиридине (4 мл), добавляют пропионовый ангидрид(4 мл) и смесь выдерживают при комнатной температуре 44 ч

15 Добавляют воду (10 мл) и раствор экстраги- „ руют хлороформом (50 мл). Экстракт хлороформа промывают последовательно каждый раз 50 мл 0,1 н. НО, воды, содержащей 1 йаНСОз. и воды. Экстракт хлороформа кон2р центрируют в вакууме до остатка и этот остаток растворяют в ацетоне (100 мл).

Раствор ацетона концентрируют в вакууме для удаления остаточных пиридина и пропионовой кислоты. Эту стадию повторяют три раза. Остаток растворяют в бензоле, высушивают замораживанием и получают пропионил А82810 (соль натрия) как масло.

Это масло растворяют в ацетолнитриле

3р (5 мл) и вносят в колонку, содержащую 20 мл силикагеля (WoeIm, 100 вЂ” 200 мкм), погруженную в ацетонитрил, Колонку промывают ацетонитрилом (100 мл), элюируют смесью ацетонитрил: ацетон (последовательно каж35 дый раз 100 мл (9: 1), (4: 1), (7: 3) и (1: 1) и наконец, ацетоном (100 мл), собирают 25-мл фракции.

Элюирование контролируют ТСХ на силикагеле, проявляя смесью ацетонитрил:

4р ацетон.(1: 1) и детектируя при помощи аэрозоля ваниллин-Нз$04. Фракции, содержащие большую часть пропионил А82810(соль натрия, hL 13-23), обьединяют, концентрируют в вакууме и получают остаток. Этот

45 остаток растворяют В диаоксане, высушивают, замораживают и получают 47 мл требуемого эфира.

Молекулярная масса 920 по FDMS.

Анализ ЙК-спектр(в CHCb) показывает50 ся максимумы поглощения при следующих частотах, см : 2975, 2971, 2935, 2879, 2831, 1571, 1457, 1398, 1380, 1364, 1359. 1321, 1237, 1225, 1216, 1213, 1119, 1163, 111