Способ получения рекомбинантного активированного белка с человека

Способ получения рекомбинантного активированного белка с человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , получение рекомбинантной ДИК, кодирующей активный белок С. Сущность изобретения: способ получения рекомбинантного человеческого белка С предусматривает культивирование штаммов-реципиентов , трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК, причем данный вектор экспрессии состоит из последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает (начиная от концевой аминогруппы до концевой кзрбоксигруппы): сигнальный пептид и пропептид у-карбоксилированного белка; легкую цепь человеческого белка С; дипептид лизин-аргинин, лизин-лизин или аргининаргинин; последовательность расщепления для ассоциируемой с клеткой протеазы, активированную тяжелую цепь человеческого белка С; промотор, расположенный таким образом, что приводит к экспрессии указанной последовательности, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С .12 N 15/52, 15/84

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

Сд

О

О

00 (21) 4613088/13 (22) 02.12.88 (31) 129027 (32) 04. 12.87 (ЗЗ) US (46) 23.07;93. Бюл. М 27 (71) Эли Лилли Энд Компани (Щ

f72) Нильс Ульрик Банг (0$), Хармут Джозеф

Эрлих(08)„Брайан Вилльям Гриннел и

Стэнли Ричард Яскунас (US) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АКТИВИРОВАННОГО БЕЛКА С ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: генетическая инженерия, получение рекомбинантной ДНК, кодирующей активный белок С. Сущность изобретения: способ получения рекомбинантного человеческого белка С предусматривает культивирование штамИзобретение относится к области генетической инженерии, в частности к получению рекомбинантной ДНК, кодирующей активный человеческий белок С.

Известные ранее способы получения белка C предполагают продуцирование неактивной формы белка С (профермент) с последующей обработкой высокими концентрациями тромбина или тромбина и тромбомодулина или другими дорогостоящими ферментами активации.

Способ продуцирования активированного белка С исключает этап активации за счет того. что векторы экспрессии белка содержат ДНК кодирующую точку протеолитического расщепления в последовательности белка С, что приводит к прямой

i. 5lJ«, 1830081 А3 мов-реципиентов, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК, причем данный вектор экспрессии состоит из последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает (начиная от концевой аминогруппы до концевой карбоксигруппы): сигнальный пептид и пропептид карбоксилированного белка; легкую цепь человеческого белка С; дипептид лизин-аргинин, лизин-лизин или аргининаргинин: последовательность расщепления для ассоциируемой с клеткой протеазы, активированную тяжелую цепь человеческого белка С: промотор. расположенный таким образом, что приводит к экспрессии указанной последовательности, с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

2 табл. экспрессии активированного белка С в ре«омбинантн ых клетках реципиентах.

Белок С синтезируется как неактивная молекула, пробелок С. Пробелок С претерпевает сложные процессы, приводящие к образованию ряда различных неактивных молекул. Активация белка С происходит в крови в реэультате реакции, в которой участвует комплекс тромбомодулин-тромбин, Активированный белок С вместе с кофактор- (гд ным белком S является антикоагулянтом, играющим очень важную физиологическую роль.

Активированный белок С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и препятствовать распространению имеющихся сгустков.

1830081 l0

15 фактора Х в фактор Ха примерно на пять порядков величины. Активированный белок

С действует на гидролиз, приводя к протеолитическому: расщеплению, и необратимо 55 разрушает кофакторы свертывающей системы крови Va и ИШа, активированные формы неактивных факторов свертывающей системы крови V и Vill, В противоположность этому; факторы свертывающей системы

Тромбомодулин образует плотный сте- . хиометрический комплекс с тромбином, Тромбомодулин, образующий комплекс с тромбином, полностью изменяе1 функциональные свойства тромбина. Тромбин обычно сгущает фибриноген, активирует кровяные пластинки и превращает кофакторы свертывания крови V u Vill и их активированные формы Ча и Villa. Тромбин активирует белок С, но лишь очень медленно и неэффективно. 8 противополжность этому, тромбин, образующий комплекс с тромбомодулином, не сгущает фибриноген, не активирует кровяные пластинки и не превращает кофакторы свертывания V и ИИ в их активированные контрпары Va и Villa, а действительно становится очень эффективным активатором белка С, Константа скорости активации белка С под действием трамбомодулина-тромбина в 1000 раз больше константы скорости активации одного лишь тромбина, Система коагуляции представляет собой цепную реакцию, включающую последовательную активацию проферментов в активные протеаэы серина. Эта цепная реакция в конечном итоге приводит к образованию ферментного тромбинв, который в результате ограниченного протеолиза превращает фибриноген кровяной плазмы в нерастворимый гелевый фибрин. Основными результатами данного коагуляционного каскада являются превращение фактора свертывающей системы крови Х в фактор свертывающей системы крови Ха посредством фактора свертывающей системы крови

tXa и превращение протромбина в тромбин посредством фактора сверты вающей системы крови Ха. Обе эти реакции происходят на поверхностях клетки, главным образом на поверхности кровяной пластинки, и для обеих реакций требуются кофакторы. Основные кофакторы, факторы V и Vill, в данной системе циркулируют как относительно неактивные предшественники, но при образовании нескольких первых молекул тромбина тромбин делает обратную петлю и активирует кофакторы за счет ограниченнОго протеолиза. Эти активированные кофакторы, Va и VHla; ускоряют как конверсию протромбина в тромбин, так и конверсию

30 крови V u Vill являются очень слабыми субстратами для активированного белка С, Очень важным кофактором активированного белка С является белок S, другой зависящий от витамина К белок плазмы. Белок S значительно повышает регулируемый активированным белком С гидролиз факторов Va u Villa (в 25 раз).

Активированный белок С является новым противотромбическим средством с более широким терапевтическим индексом, чем существующие антикоагулянты, такие как гепарин и вводимые орально антикоагулянты типа оксикумарина. Ни проферментный белок С, ни активированный белок С не проявляет эффективность до тех пор, пока не образуется тромбин, поскольку тромбин должен превращать факторы свертывающей системы крови V и ИИ соответственно в факторы Va и Villa; активированные формы этих двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного белка С. Тромбин также необходим для активации проферментного белка С, поскольку без комплекса тромбомодулин — тромбин профермент белка С не превращаешься в его активную контрпару.

Активированный белок С является, согласно требованию, антикоагулянтом, поскольку активированный белок С действует за счет инактивирующих кофакторов Va u

Иllа. Поскольку тромбин необходим для превращения факторов V и ИН в их активированные контрпары Va и Villa, то белок

С действует лишь как антикоагулянт после образования трамбина. Обычные антикоагулянты, в противоположность активированному белку С, сохраняют постоянное антикоагулянтное состояние в течение

scего срока, пока их дают пациенту, ввиду чего значительно повышается риск кровотечения по сравнению с белком С или активированным белком С. Таким образом, активированный белок C по требованию является антикоагулянтом.широкого клинического полезного действия, который может использоваться как замена гепарина и оксикумарина.

Г1ри некоторых заболеваниях, таких как наследственная .белковая недостаточность (дефицит белка С), профермент белка С имеет очень важное терапевтическое значение.

Хотя проферметичные формы белка С очень полезны для терапевтических целей, некоторые заболевания могут лечиться более эффективно путем приема пациентами активированной формы белка С, Так, например; при таких заболеваниях, как инфаркт миокарда или глубокий еенный тромбоз (особенно в случаях после хирургической

1830081 щихся тромбов.

Нуклеотидная последовательность зарождающегося человеческого белка представлена ниже:

10 20 30 40

ATG TGG CAG CTC АСЛ AGC СТС СТС CTG ТТС GTG GCC АСС TGG GGA АТТ

ИЕТ TRP GLN LEU THR SER LEU ЬЕ0 LEU РНЕ VAL АЬЛ THR TRP GLY ILE

5 10 15

50 60 70 80 90

ТСС GGC ЛСЛ CCA GCT ССТ СТТ GAC ТСА GTG ТТС ТСС AGC AGC GAG CGT

SFR GLY THR PRO AI.Ë. PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG

20 25 30

100 110 120 130 140

GCC СЛС CAG GTG CTG CGG АТС CGC AAA СОТ ГСС AAC ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VhL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

35 40 45

150 160 170 180 190

GAG СТС ССТ САС AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC АТА GAG GAG АТС TGT

СЬЦ IEU ARG 1ЦБ SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILK CYS

50 55 60

200 210

САС ТТС GAG GAG GCC AAG GAA АТТ ТТС

ASP PIIE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE г

6 70

Ф 250 260

GCC TTC TGG ТСС ЛАС СЛС &ТС САС CGT

hLA PIK TRP SER LYS IIIS VAL ASP GLY

290 300 310 320 330

TTG GAG CAC CCC ТСС GCC ЛОС CTG TGC TGC GGC САС GGC ACG TGC ATC

ЬЕ0 GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

100 105 110

340 350 360 370 380

GAC GGC ЛТС GGC AGC ТТС AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC

ASI GLY ILE GI.Y SER PHK SER CYS hSP CYS ARC SER GLY TRP GLU GLY

115 120 125

390 400 410. 420 . 430

CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC СТС AAT TGC TCG CTG GAC AAC

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHK LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN

130 135 140 операции нижних конечностей), пациенты имеют нормальные концентрации профермента белка С, недостаточные для активированного белка С; для предотвращения образования тромбов или удаления имею220 230 240

CAA AAT GTG GAT GAC АСА CTG

GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

75 80

270 280

GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC

ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

90 95

1830081

440 450 460 470 480

GGC GGC TGC ACG САТ TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC ТСТ

С1Л GLY CYS THR АРПБ TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

145 150 155 160

490 500 51О 520

AGC TGT GCG CCT GGC ТАС AAG CTG GGG САС GAC СТС CTG CAG TGT CAC

SER CYS ALA PB0 GLY TYR LYS LEV GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS

165 17о 175

530 540 550 560 570

CCC ССА GTG AAG ТТС ССТ TGT ССС AGG ССС TGG AAG CGG АТС GAG AAG 20 PRO ALA VAL LYS РНЕ PRO CYS GLY ABG PRO TRP LYS АВС.ИЕТ GLU LYS

1ВО 185 190

580 590 600 610 620

AAG CGC AGT САС CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC САА GAA САС САА GTA

25 1ЛБ ABG SER HIS LEU LYS ARG ASP ТНВ GLU ASP GLH GLU ASP GLN VAL

195 200 205

6Зо 640 650 660 670

GAT CCG CGG СТС ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC ССС

ASP PRO ARG LEU ILF. ASP GLY LYS ИЕТ ТНВ ARG АВС GLY АБР SER PRO

210 215 220

68О 69о 7оо 710 720

TGG CAG GTG GTC СТС CTG GAC ТСА AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG ССА

TRP GLN VAL VAL LEU i.EU ASP SEP. QYS LYS LYS LFU ALA CYS .GLY ALA

225 гзо 235 240

730 740 750 760

GTG CTC АТС CAC CCC ТСС TGG GTG СТС ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT

VAL LEU ILE 1ПБ PRO SEP. TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS ИЕТ ASP

245 250 255

770 780 790 800 810

45 GAG TCC AAG AAG СТС СТТ СТС AGG СТТ GGA GAG ТАТ GAC CTG CGG CGC

GLU SER LYS LYS 1.Е11 LEU VAJ ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG

260 265 270

820 830 840 850 860

TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC ТТС GTC САС

5 TRP GLU LYS TRP С1Л LFU ASP.LEU ASP ILE 1.УБ GLU VAL PRE VAL ffIS

275 280 285

1830081.

870 880 890 900 910

ССС АЛС ТАС ACC AAG AGC АСС ACC GAC ААТ GAC АТС GCA CTG CTG САС

10 PR0 ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILK ALA LEU LEU HIS

290 295 300

920 930 940 950 960

CTG GCC CAG ССС GCC ACC CTC TCG CAG АСС АТА GTG ССС АТС TGC СТС

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLM THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU

305 310 315 320

970 980 990 1000

CCG ChC AGC GCC СТТ GCA GAG CGC GAG СТС ААТ CAG GCC GGC CAG GAG

20. PR0 ASP SER GL> LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

325 330 335

1010 1020 1030 1040 1050

ACC СТС GTG ACG GGC TGG GGC ТАС .САС AGC AGC CGA GAG AAG GAG GCC

ТЖ LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG СЫ 2УБ GLU ALA

340 345 350

1060 1070 1080 1090 1100

AAG AGA AAC CGC ACC ТТС CTC СТС ААС ТТС ЛТС AAG АТТ ССС GTG GTC

3O LYS ARG ASN ARG THR РНЕ VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAI VAL

355 360 365

1160 1170 1180 1190 1200

ЛТС CTG TGT GCG GGC ЛТС СТС GGG GAC ССО CAG GAT GCC TGC GAG GCC

KT LKU CYS ALA СЬУ ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY

385 390 395 400

1210 1220 1230 1240

GAC AGT GGG GGG ССС ATG GTC GCC ТСС ТТС CAC GGC АСС TGG ТТС CTG

ASP SER GLY GLY PR0 ИЕТ VAL ALA SKR PHK HIS GLY THR TRP PHE LEU

405 410 415

1250 1260 1270 1280 1290

GTC GCC CTG GTG AGC TGG GGT CAG GGC TCT GGC CTC СТТ;САС AAC ТАС

VAL GLY LEU VAL БЕК TRP GLY GLU СЫ CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

420 425 430

1300 1310 1320 1330 1340

GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC ТАС СТС GAC TGG АТС CAT GGG САС

GLY ЧАЕ TYR ТНВ LYS ЧЛ2. SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS

435 440 445

1350 1360 1370 1380

АТС AGA GAC AAG GAA ССС ССС CAG AAG AGC TGG GCA ССТ TAG

ILE ARG ЛБР LYS GLU ALÀ PRO GLN IYS SER TRP ALA PRO ?2?

450 455 460

15 1 120 1120 1 130 1140 1150

CCG САС ААТ GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG ТСТ GAG AAC

35 РВО Н1$ АБМ СЫ СУБ БЕК ОЬУ-ЧАЕ ИЕТ БЕК АБН ИЕТ VAL SER GLU ASN

370 375 380

1830081 т.е, соответственно 3 и 5 концы кодирующей нити данного белка, Плазмиду рН 7 выделяют иэ штамма E. coI(K12 йй1/рНС7, который хранится в Северной региональной 35 научно-исслвдоеательской лэборатории (NRRI), Пеория. Иллинойс, под номером

NRRI 8-15926..

Зарождающийся белок С также может быть представлен схематически кэк показа- 40 но ниже:

42 43 197 198 199 200 2 t1.212 А61 рге-pro .С KR АР АНС с — ъ пре-про-аминокислотные группы 1-42 за- 45 рождающегося белка С кодируют сиг11щьнцй 1вптия 11 npppoA711$ чюдявечбящО

6jisirs 5, ачй11ь, важный для 11фправэй нщй сварен Ц 1кар@щсилюрйвэния фул1 э (.;.

LC -. эминркиалотныв группы 43-197 зарождающегося белка С ловле посттрансляционной модификации создают легкую цель

М)

KR — аминокислотные группы 198-199 э»рождающегося белка C удаляются, йо всей вероятности. в ходе д11ухэтапйого nðoцвсс», включающего первое расщвплвНюв (либо мв)кду остаточными груйпами 197198. либо между остаточ11ы И группами

199-200) с последующим воздействием карРЮЮ ЮЮ белок С

Указанная выше последовательность

ДНК получена из клонов с ДНК, полученных от мРНК (информационной PHK), которая кодирует человеческий белок С. При построении клонов сДНК концы кодирующей беhок С сДНК застраива ртся 5 поли С последовательностью. 3 поли С последовательностью. э также последовательностью, узнаваемой эндонуклеээой 5 и 3 Pet 1. Оба эти сДНК клона служат для построения молекулы ДНК, включающей как кодирук щую последовательность зарождающегося человеческого белка С. так и части ДНК, кодирующие нетранслированную мРНК в 5 и 3 концах данной кодирующей зоны, Зтрт фрагмент ДНК клонируют в сайт Pat 1 плазмиды pBR322, в результате чего получается плазмида рНС7. Таким образом, пламиээ рНС7 включает указанную кодирующур последовательность и дополнительные последовательности:

5 — С ТОС АСС GGG GGG GGG GGG GQG

GGG СТО TCA TGG CGG CA@ @AC GGC САА

СТТ GCA ОТА ТСТ ССА CGA ССС GCC ССТ

АСА GGT 6СС AGT GCC ТС А9А — 3 и .5 — CGA ССС ТСС CTG CAG GGC TQG

GCT ТТТ GCA TGG CAA TGG ATG GGA CAT тАА А66 мС ATG тАА CA/ GCA САС Ссс

ССС ССС ССС ССС ССС СС ССС ССТОСА6- 7, 12 боксипвптидаэы или аминопептидээы с образованием белка С.

AP — эминокислотные группы 200-211 зарождающегося белка С составляют экти5 вэционный пептид. который удаляется иэ проферментных форм белка С с образованием активировэнного белка С.

АНС вЂ” эминокислотные группы 212-461 зарождающегося белка С, которые после

10 лосттрансляционной модификации состав-. ляют активированнук1 тяжелую цепь (АНС) активного белка С;

HC — тяжелая, цепь. двухцепной формы проферемент» белка С, которая после по15 сттрансляционной модификации образует эминокислотные группы 260-461. AP и АНС.

Ограниченнйй протволиз включает расщепление и удаление пре-пропептида, со. стоящего из.вминокислотных групп 1-42, в

20 ходе внутриклеточного процесса и секреции зарождающегося полипептида иэ клетки и удаления эмииокислотных групп 198 и 199 с образованием двух цаплей. Активация проферментэ в активную протеазу серина

25 включает протволитическов расщепление пептидной связи ARQ- Е и (группы 211 и

212). Это последнее расщепление высворождает додекапептид(группы 200-21f), ко, торый .составляет концевую аминогруппу

30 большей (тяжелой) цепи двухцепной молекулы профермента, белок С в значительной мере гликолиэирован, этот созреэаий фермент содержит около 23ф углеводов; белок С также содер. жит ряд нвобычйых аминокислот; включая

} карбоксиглутаминовую кислоту и реасеасларэгиновую:кислоту:(эритро-):ф -оксиаспэрагэт), ) "КэрбокСигЩ(У»минов»я мислотэ (два) получается в результате карбоксилировению у глутэминэ иэ группы глутаминовой кислоты с помощью пвченвчной микросомной карбоксилаэы, для кбюрой в качестве кофактора требуется «итамин K.

Активация человеческого белка С также может. быть лредстэвлена схематически, как показано ниже.

" йрв-.прр-.gC-Ù P-АНС прст-.тран-.

50 сляциенная модификация,.т.е, ) кэрбоксилйрованив слвцифичвских rpynn глутаминощй кислоты, Р.гидрв-.

55 щ11щЮррв»НОВ Гру11Пь1 ррпарагиновр кислоты н гликозилиреванив

Секрет; удаление групп 1-42, которые моГут

1830081

Одно цепочечный профермент

10

Двухцепочечный профермент

S-S

АНС-АР ! LC

Активация тромбином-тромбомодулином

Активированный белок С

50 включать более чем одно протеолитическое расщепление

L С-KR-AP-АНС удаление групп

198-199, примерно

90 проферментного белка С, обнаруженного в человеческой крови, является двухцепной формой (S-З=дисул ьфидная связь) Я-S

AHI

Способ получения рекомбинатного человеческого белка С предусматривает культивирование штаммов — реципиентов трансформированием рекомбинантной плазмидой ДНК, причем данная ДНК состоит из Я последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает, начиная от концевой аминогруппы до концевой карбоксигруппы: (а) сигнальный пептид и про-пептид карбоксилированного белка; (Ь) легкую цепь человеческого белка С; (с) дипептид лизин-аргинин, лизин — лизин или аргинин-аргинин; (d) последовательность, расщепляющуюся ассоциированную с клеткой протеазой; (е) активированную тяжелую цепь человеческого белка С; (П) промотор, расположенный таким образом; что приводит к экспрессии указанной последовательности ДНК, ДН К включает кодирую щую последовательность дипептида L YS — ARG (KR), расположенную в трансляционной рамке считывания в непосредственном соседстве ниже кодирующей последовательности легкой цепи. Двухосновный дипептид, такой как L YS — ARG, располагается в зарождающемся белке между карбоксильной концевой группой данной легкой цепи и концевой аминогруп пой последовательности расщепления ассоциированной клеткой протеазы, Двухосновные дипептиды, такие как L YS-1

YS или ARG-ARG, эквивалентны дипептиду

L YS ARG согласно данному изобретению.

Непосредственно ниже кодонов дипептидов L YS — ARG находится последовательность, кодирующая последовательность протеолитического расщепления. У концевой карбоксильной группы дипептида L YSARG человеческого белка С располагается

12 аминокислотный пептид, активационный пептид, который удаляется путем протеолитического расщепления. В соединениях, которые используются в способе, последовательность активационного пептида заменена последовательностью, кодирующей последовательность протеолитического расщепления для протеазы, которая ассоциирована с клеткой (табл.1).

Таким образом. зарождающийся белок расщепляется у карбоксильной концевой группы легкой цепи (KR дипептид) и, кроме того, расщепляется у концевой.аминогруппы активированной тяжелой цепи. Следовательно, группы, находящиеся между дипептидом KR и точкой протеалитического расщепления (расположенной у концевой аминогруппы активированной тяжелой цепи) будут удаляться при обработке полипептида. Ввиду того. что эти две реакции протеолитического расщепления будут удалять все группы, находящиеся между концевой карбоксильной группой легкой цепи и концевой аминогруппой тяжелой цепи, последовательность протеолитического расщепления может содержать допонительные группы, не оказывая при этом нежелательного влияния на тип конечного продукта, активировэнного белка С, Таким образом, в данном способе могут использоваться последовательности расщепления более длинные, чем те, которые приведены в табл.1.

Хотя все приведенные выше последовательности расщепления содержат восемь групп, все эти восемь групп необязательны и. следовательно, могут использоваться более короткие последовательности, В трансляционной рамке считывания непосредственно ниже последовательности, кодирующей последовательность протеолитического расщепления, находится

1830081 l N-ИЕТ TRP GLN LEU THR SEB LEU LEU LEU PIK VAL ALA THR TRP GLY ILE

SER GLY THR PRO ALA РГО LEU ASP SER VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

ALA Н."S GLN VAL LEU АВН ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

GLU LEU ЛВС HIS SER SER LEU GLU ABG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU 1LE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THB LEU

Л1.А PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS РВО CYS ALA SER LEU СYS CYS GLY HIS GLY TlIB CYS ILE

ASP GLX 1LE GLY SER PlK SER CYS hSP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

АВС P1K CYS GLN ARG GLU VAL SEB РНЕ LEU ЛБН CYS SER LEU ASP ASN

GLY GLY СУБ THR НIБ TYB CYS I.FU GLU GLU VAI. GLY TBP ARG ABG CYS

SER CYS hLh PBO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LFU LEU GLN CYÁ НIБ

РВО ALA ЧАI, LYS РНЕ PRO CYS GLY ABG PRO TRP LYS ARG tKT GLU LYS

LYS ЛВГ SEB HIS LEU LYS ARG PRO ABG PRO SER ABG LYS ARG ARG LEU

1LE ASP GLY ЕYS tKT TtIB ABG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL

I,EU ASl SFP, LYS LYS LYS LEU hLA CYS G1..Y ALA VhL ЕЕН ILE HIS

PRO SER TRP Vh1. FU ТНВ ALA ALA HIS CYS ИЕТ ASP GLU SER LYS LYS

LEU I.FU YAL ABG 1.ЕУ GLY GLU TYR ASP LEU АВС ARG TRP GLU LYS TRP

GLU LEU hSP 1,EU ASP ILE LYS GLU VAI. РНЕ VAL HIS PRO ASN TYR SER

1тБ БЕВ THB THB ЛБР ASN ЛБР ILE ALA LEU LEU НТБ LEU ALA GLN PRO

ALA THR 1.ЕУ БЕВ И,11 ТНВ 1ЕЕ ЧА!, PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY

IEU ALA GLU hPG GLU ЕЕН ASN GLN ALA GLY GLN GLU ТНВ LEU VAL THR

GLY TRP GLY TYR НIБ SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ABG ASN ARG

THR PHE VhL LFU hSN РНЕ ILF, LYS ILE PRO VAL VAL PBO HIS ASN GLU

CYS SFR GLU ЧАЕ tKT SER ASN ИЕТ VAL SER GIU ASN ИЕТ LEU CYS ALA

35 кодирующая последовательность активированной тяжелой цепи человеческого белка С, При этом активированная тяжелая цепь чело-. веческого белка состоит из групп с 212 по 461 зарождающегося человеческого белка С, Ниже представлена последовательность аминокислотных групп зарождающегося полипептида, транслированного от транскрипта мРНК, Данный полипептид начинается с препропептида человеческого белка С, за котарым следует легкая цепь человеческого белка С, эа которой следует дипептид И вЂ” АРС, за которым идет последовательность расщепления рецептора инсулина, с последую5 щей активированной тяжелой цепью человеческого белка С, Данный полипептид схематически изображен ниже:

20 prepro LC Кй IRS АНС

1п

0 Последовательность аминогрупп данного полипептида представлена ниже:

1830081

GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY

PRO НЕТ VAI. ЛЕА SER РНЕ HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL

SER TRP GlY GLU GLY CYS гЬт LEU LEU HIS ASM TYR GLY VAL TYR ТНН

LYS VAL SEP, ARG TYR LEU ASP TRP ILE ЩЯ GLY HIS ILE ARG ASP LYS

GLU ALA PRO GLH LYS SER TRP ALA PRO-СООН

Активированный человеческий белок получают при использовании кодирующей последовательности зарождающегося человеческого белка С, из которого была удалена эона.AP путем точечно-специфического мутагенеза. Эта последовательность, представленная схематически, имеет следующую структуру: пре-про 1 С KR АНС

Данную кодирующую последовательность встраивают в вектор экспрессии, полученный в результате вектор р1 АРС трансформируют в эукариотические клетки реципиенты. Полученные трансформанты дают стандартные количества двухцепочечного белка С. Плазмида pL АРС служит также в качестве исходного материала для построения других векторов. Принцип и порядок построения плазмиды pi APC из исходной плазмиды рНС7 описывается в примере 1. Плазмида рНС7 взята из коллекции культур Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL), Пеория, И 61604, Е . соП К12 RR1/ðÍÑ7 под номером регистрации NRRL 8 — 15926, Осуществляют экспрессию активированного белка С путем создания кодирующей последовательности, в которой . последовательность протеолитического расщепления встроена в кодирующую по-. следовательность белка С между кодирующей последовательностью АР и кодирующей последовательностью АНС, Точка протеолитического расщепления встроена с последовательностью протеолитического расщепления, образованной от рецептора инсулина. Таким образом, эта схематически представленная кодирующая последовательность имеет следующую структуру: пре про LC KR AP IRS АНС

Эта кодирующая последовательность встраивается в вектор pL АРС, в результате чего получают плазмиды pL PC-IRS. Однако эукариотические клетки-реципиенты, содержащие плазмиду pL РС-IRS, не обеспечивают получение активного белка С.

Способ прямого получения активированного белка С осуществляют после замены кодирующей последовательности AP кодирующей последовательностью IRS.

5 Полученная в результате кодирующая последовательность, показанная схематически, имеет следующую структуру: пре-про 1 С KR IRS АНС

Часть кодирующей последовательности

10 белка С, включающей кодирующую активационный пептид ДНК, выделяют из пламиды рНС7, вставляют в фаг М13 mp18 и затем видиоизменяют путем сайт-специфического мутагенеза. Затем эту кодирующую после15 довательность клонируют в эукариотический вектор, в результате чего получают плазмиду, обозначенную как pL APC-IRS, идентичную пламизде р АРС, за исключением вставки кодирующей последователь20 ности IRS между кодирующими последовательностями KR и АНС, Плазмида

pL АРС вЂ” IRS отличается от плазмиды pL PC—

IRS лишь делецией кодирующей последовательности AP. Принцип и последовательность

25 построения плазмиды pL APC — IRS подробно описываются в примере 3.

Плазмида pLAPC — IRS включает ген-усилитель BK. предназначенный для стимулирования транскрипции основным поздним

30 промотором аденовируса кодирующей последовательности белка С, Полученным вектором экспрессии трансформируют эукориотические клетки (табл,2).

Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Построение плаэмиды р

АРС, 40 Пламиза рНС7 содержит полную кодирующую последовательность зарождающегося человеческого белка С. 1 л питательного бульона L (10 г пептона, 10 г

ЙаС!и5 r дрожжевого экстракта), содержа45 щего 15 мкг/мл тетрациклина, инокулируют с культурой Е.соН К12 RR1/рНС7 (NRRL В—

15926) и инкубируют в инкубаторе с воздуш20

1830081

40 путем центрифугирования со скоростью

25000 об/мин в течение 40 мин в роторе. В раствор вводят примерно 30,44 r CsCI и около 1 мл раствора 5 мг/мл этилбромида и затем объем этого раствора доводят до 40 45 мл. Этот раствор декантируют в пробирке ультрацентрифуги. Пробирку герметически закрывают и затем осуществляют центрифугирование в роторе при скорости вращения

42000 об/мин в течение около 16ч. Получен- 50 ную плазмиду, визуально наблюдаемую в. ультрафиолетовом свете, выделяют, затем помещают в пробирку и в ротор и осущест- вляют центрифугирование со скоростью

19

1 ным вибратором при 37 С до тех пор, пока не достигнуто значение оптической плотности (О.D.), при 590 нм равное примерно 1 ед., и в этот момент вводят в данную культуру 1 50 мг хромамфеникола. И нкубацию продолжают в течение примерно 16 ч; вывод кромамфеникола ингибировал синтез белка и таким образом ингибировал дальнейшее деление клеток, но он не предотвращал дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют в роторе при скорости 6000 об/мин в течение

5 мин при 4 С.

Образующийся поверхностный слой удаляют, и клеточные гранулы промывают в

40 мл буферного раствора TE (10 м Мол TpucHCl, рН = 7,5, 10 мМол NaCI, и 1 мМол ЕДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и снова гранулируют. Поверхностный слой снова удаляют и клеточные гранулы замораживают в ванне с сухим льдом — этанолом, и затем они оттаивают, Оттаянные клеточные гранулы снова суспендируют в 10 мл раствора 25 / сахарозы/50 мМол ЕДТА,. В данный раствор вводят примерно 1 мл раствора 5 мг/мл лизозима; 3 мл 0,25 Мол ЕДТА, pH = 8,0,. и. 100 мкл 10 мг/мп рибонуклеазы А, и затем этот раствор инкубируют во льду в течение 15 мин, В обработанные лизоцимом клетки вводят в 3 мл лизирующего раствора (попученного путем смешивания 3 мл 10 Д-ного Тритона-Х 100, 75 мл 0,25 Мол ЕДТА, рН = 8,0, 15 мл 1 Моп

Трис-Н Cl, рН = 8,0 и 7 мл воды), осуществляют перемешивание и образующийся раствор инкубируют во льду в течение еще 15 мин, Лизированные клетки замораживают в ванне с сухим льдом — этанолом и затем их оттаивают.

Клеточные остатки удаляют из раствора

55000 об/мин в течение 16 ч, Регулирование до любого необходимого объема осуществляют с использованием TES, содержащего

0,761 гlмл CsG, Данную плазмиду снова выделяют, зтидийбромид экстрагируют на.сыщенным солью иэопропанолом и окончвтельно разбавляют буферным раствором

TES со степенью 1:3. Затем в данный раствор вводят два объема этанола и полученную смесь инкубируют в течение ночи при температуре - 20 С. Плазмиду ДНК гранулируют путем центрифугирования раствора в роторе.ss34 в течение 15 мин при скорости вращения 10000 об/мин. Примерно 1 мг

ДНК ппазмиды рНС7, полученной в ходе этой процедуры, суспендируют в 1 мл буферного раствора TE (10 мМол Трис-HCI, рН

= 7,6, и 10 мМоп ЕДТА) и выдерживают ее при температуре - 20 С.

Примерно 7 мкг (7 мкл) ДНК плазмиды рНС7 вводят в 25 мкл буферного раствора

ТМ 10Х Core (буферный раствор Core ТМ, BRL состоит из 50 мМол Трис-HCl, рН = 8,0, 500 мМол NaCl и 100 мМол М9С!2), 198 мкМол НрО и 12 мкл ограничительного фермента и 7 мкл (80 ед) ограничительного фермента Sstt, Эту реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч, затем обработанную Sstl-ЯаИ плазмиду рНС7

ДНК экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом, извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования, и, наконец, суспендируют в 15 мкп буферного раствора ТЕ/10 (10 мМол Трис-основание, pH = 7,6, и 0,1 мМол ЕДТА).

Затем данную реакционную смесь подвергают электрофорезу на агарозном геле (0,6 j).с низкой температурой гелеобразования втечение 2-3 ч при 130 В и 65мА в

Трис-ацетатном буферном растворе. Этот гель окрашивают в разбавленном растворе этилбромида и фрагмент ДНК 0,7 кб $з0$аИ, который визуально обнаруживают в ультрафиолетовом свете большой длины волны, отсекают от геля в виде небольшого сегмента. Обьем этого сегмента определяется его весом и плотностью, и в пробирку, содержащую этот сегмент, вводят четыре объема ТЕ, содержащего 0,25 Мол йаО. Затем данный сегмент расплавляют путем инкубирования при 72 С. Получают примерно

0,5 мкг фрагмента - 0,7 ко Sstt-Salt плазмиды рНС7 в объеме примерно 400 мкл.

Дальнейшую очистку ДН К осуществляют путем пропускания раствора ДНК через колонку (8RL) в соответствии с рекомендациями изготовителя, очищенный фрагмент снова суспендируют в 15 мкл деионизированной воды, Примерно 1 мкг ДНК фага М13 ер18

5 (репликационной формы, RF) обрабатывают с ферментами Sstl и ЯаИ. Реакцию прекращают путем экстрагирования реакционной смеси фенолом и затем хлороформом, Затем ДНК осаждают, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют

1830081

30

40

55 примерно в 15 мкл буферного раствора ТЕ.

Два фрагмента, полученные в результате обработки, разделяют на 0,6; агароэном

rene с низкой температурой гелеобразования, больший фрагмент отсекают от данного геля и очищают.

Примерно 0,1 мкг(в 7 мкл HzG) фрагмент

0,7 кЬ Ssti-Sall плазмиды рНС7 вводят в 5 мкл ДНК RF M13 mp18, обработанного Sstl—

Sall, вместе с 2 мкл буферного раствора лигаэы 10Х (0,5 Мол Трис-HCI, рН = 7,8, 60 мМол Mg Cb и 0,2 Моп дитиотреитола (ДТТ), 2 мкл раствора 1 мг/мп BSA, 1 мкл 25 мМол

АТР, 1 мкл (400 ед) лигазы Т4 ДН К (NE8) и

2 мкл воды). Эту реакционную смесь сшивки инкубируют при 25 С в течение ночи; сшитая ДНК представляет собой ДНК желаемого фага М13 mp18 НЕ1 в виде двухниточной молекулы.

Примерно 300 мкл выращенной за ночь культуры Е.coii К12 JM101 (New England

Biolabs) используют для инокулирования 30 мл питательного бульона 2Х ТУ (питательный бульон ТУ состоит из 10 г/л триптона, 10 г/л NaCI и 5 г/л дрожжевого экстракта), и полученную культуру инкубируют при

37 С с одновременной аэрацией до тех пор, пока оптическая плотность (0.0.1600 не достигала значения 0,5. Затем данную культуру эамораживают в течение 10 мин в ванне со льдом-водой, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 15 мл холодной 10 мМол NaCI. Клетки снова собирают путем центрифугирования и затем снова суспендируют в 15 мп холодного 30 м Мол

СаС!г.

Эти клетки помещают в лед на 20 мин и извлекают их путем центрифугирования.

Клетки снова суспендируют в 1,5 мп холодного 30 мМол CaClz, аликвоту з их клеток объемом 200 мкл удаляют, вводят в 9 мкп сшитой ДНК, полученной, как описано выше, и инкубируют на льду в течение примерно 30 мин, Смесь клетки — ДНК затем инкубируют при 42 С в течение 2 мин и затем вводят в 3 мл верхнего агара (питательный бульон ТУ с 0,57 агаром, расплавленным при 45 С), который содержит также

50 мкл 20 Х вЂ” Gal (Х вЂ” 6а1 представляет собой 5-бром-4-хлор-3-индолил P-D-галактопиранозид), 50 мкл 100 мМол IPTG (IPTG— это иэопропил Р -О-тио-гапактопиранозид) и 100 мкл Е. coli К12 М101 в фазе логарифмического роста. Эту смесь клетки — верхний агар затем высевают на чашках с

ТУ-агаром и чашки инкубируют при 37 С в течение ночи.

На следующее утро четыре прозрачные колонии .по отдельности используют для инокулирования 2 мл питательного бульона

2Х ТУ, и полученные культуры инкубируют при 37 С с одновременной аэрацией в течение 6 ч, Затем данные культуры центрифугируют и 500 мкл образующегося верхнего слоя (данные клеточные гранулы используют для получения ДНК фага для анализа ограничительного фермента) вводят в 500 мкл культуры (О.D.550=0,5) Е, соН К1" М",01 и 50 мл питательного бульона 2Х ТУ. Эти ку,;ьтуры инкубируют в течение ночи при

37 С. Фаговую RF ДНК выделяют из клеточных гранул с использованием варианта процедуры, с той разницей, что в данной среде культивации не использовалось никакого антибиотика, и этапы ультрацентрифугирования заменяют экстракциями фенолом и хлороформом. Трансформанты, содержащие фаговую М13 гпр18 — HE1 ДНК, идентифицируют путем анализа ограничительного фермента или их A rn n& Лнк

Разведенные за ночь культуры центрифугируют и примерно 1 мл раствора, состоя щего из 20% полиэтилен гли кол я (P EG) 600 и 2,5 мМол NaCI, вводят в 5 мл поверхностного слоя, который затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, Смесь центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 10000 об/мин, и о6разованные гранулы, содержащие однониточную фаговую М13 mp18 — НЕ1 ДНК, снова суспендируют в 500 мп буферного раствора

TES (20 мМоп Трис-HCI, рН = 7.5, 0,1 мМол

ЕДТА, и 10 м Мол NaCI). Раствор ДН К экстрагируют сначала хлороформом, затем двукратно насыщенным TE фенолом и затем снова хлороформом, Затем однониточную молекулу ДНК осаждают с использованием

NaOAc (ацетата натрия) и зтанопа, центрифугируют и после промыки гранул 70% этанолом и сушки полученные гранулы растворяют в 80 мкл Н20. Этот фаговый препарат используют в следующем этапе, в сайт-специфическом мутагенезе, с целью удаления ДНК, кодирующей активационный пептид.

Фрагмент однониточной ДНК, используемый в операции мутагенеза для удаления кодирующей активационный пептид ДНК, синтезируют в автоматизированном устройстве синтеза ДНК (представлен ниже):

5 — G С6 СА6ТСА ССТОАААС6АСТСАП

6АТ666ААОАТОА — 3

Примерно 30 пмоль (1 мкл) указанного выше фрагмента однониточной ДН К ("мутагенный олинонуклеотид") и I,5 мкл (7,5 пмоль) универсальной ДНК-затравки М13 обрабатывают по отдельности 5 ед, полинукпеотид киназы Т4 в 10 мкл буферного

23 1830081 24 раствора киназы IX (100 мМол Трис-HCI, рН 8,3, 100 мМол ДДТ, и 100 мМол MgCIg) с содержанием 1 мкл 1 мМол ATP в течение

30 мин при 37 С, с последующей инкубацией в течение 10 мин при 65 С и замораживанием. Обработанные киназой ДНК используют в сайт-специфическом мутагенвэе.

В сайт-специфическом мутагенезе мутагенный олигонуклеотид и универсальную 1О

ДНК-затравку М13 ренатурируют до однониточного ДНК фага. Реакцию ренатурации осуществляют путем ввода 300 nr (0,5 мкл) однониточного фаге М13 mp18-НЕ1 в 1 пмоль (1,2 мкл) универсальной ДНК-эатрав- 15 ки. 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олигонуклеотида, 2 мкл ренатурирующего буферного раствора IOX (100 мМол Трис-HCI, рН ™ 7,5, 1 мМол ЕДТА и500 мМол NaCI) и 16 мкл Н О, инкубации смеси при 800С в течение 2 мин, 20 а затем при 500С в течение 5 мин и, наконец, охлаждения смеси до комнатной температуры.

После ренатурации олигонуклеотидов фаговая ДНК становилась деухниточной за 25 счет надстраивания затравки с ДН К полимераэой. Реакцию полимерации проводят путем ввода 3 мкл буферного раствора 10Х (500 мМол Трис-HCI, рН - 8, 1 мМол ЕДТА и

120 мМол MgCIg), 3 мкл буферного раствора 30 лигаэы 10Х, 1„5 мкл 0,2 мМол ДТТ, 3 мкл смеси б NTP (0,5 мМол Ь каждой б МТР), 1,2 мкл 25 мМол АТР, 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед/мнл, ВМВ), 1 мкл ТЧ ДНК лигазы (400 ед., МЕВ) и 19,8 мкл Н О в смесь ренатури- 35 рованной ДНК. Реакционную смесь полимериэации инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем при

37 С а течение 4 ч и затем в течениме ночи при 4 С. 40

Реакцию прекращают в результате экстракции фенолом-хлороформом и осаждения ДНК этанолом и ацетатом натрия (йаОАс); ДНК извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 40 мкл бу- 45 ферного раствора SI (0,3 Мол NaCI, 0,03 Мол . NaOAt:, рН "45 и 0,3 мМол ZnCIQ, после чего вводят в раствор ДНК, Раствор ДНК распределяют в равных количествах по двум пробиркам, и в одну иэ 50 пробирок вводят 100 ед(ВМВ) нуклеазы SI.

Реакционную смесь с Sl инкубируют при комнатной температуое в течение 5 мин, и реакцию прекращают путем однократного .экстрагирования реакционной смеси насы- 55 щенным TE фенолом в