Способ получения ферментного электрода для определения l- лактата

Способ получения ферментного электрода для определения l- лактата

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: анализ биологических растворов в медицине для диагностики и в микробиологической промышленности. Цель - упрощение процесса, уменьшение рабочего потенциала и увеличение чувствительности . Сущность: при изготовлении ферментного электрода цитохром bz наносят на поверхность стеклоуглеродного электрода , модифицированного сажей ПМ-75, предварительно окисленной в азотной кислоте , которую перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5% фторопластового лака и 12-20% сажи. 1 ил.. 3 табл. ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ся)з G 01 N 27/327

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ (21) 4932509/25 (22) 29.04.91 (46) 30.07.93. Бюл. N. 28 (71) Институт биохимии Литовской АН (72) С.Л.Сташкявичене, Н.К.Ченас и Ю.Ю,Кулис (73). Институт биохимии Литовской АН . (56) Иммобилизованные ферменты./Под ред,Березина И.В. и др. 1976, изд, УГУ, т.2, с.169-176, . Авторское свидетельство СССР

N 1242803, кл. G 01 N 27/30, 5 01 N 27/46, 07,07.86.

Авторское свидетельство СССР гчт 894534, кл. 6 01 В 27/28, 30.12.81, Изобретение относится к биохимии, а именно к методам получения ферментных электродов; и может быть использовано в энзимологии для научно-исследовательских целей и в медицине или микробиологической промышленности для электрохимического определения L-лактата в биологических средах, например в.крови, в целях диагностики.

Цель изобретения — упрощение процесса, Механизм действия ферментного электрода объясняется электроокисленйем восстановленного цитохрома Ь2 на поверхности модифицированного электрода.

Цитохром Ь2 восстанавливается L-лактатом:

ЦитЛщ )+ L-лактат — Ф" Цитлщ о.>+ пируват, 8 ходе обработки сажи азотной кислотой на ее поВерхности образуются электроактив. Ж „1831682 АЗ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1ЛАКТАТА (57) Использование; анализ биологических растворов в медицине для диагностики и s микробиологической промышленности.

Цель — упрощение процесса, уменьшение . рабочего потенциала и увеличение чувствительности. Сущность: при изготовлении ферментного электрода цитохром bz наносят на поверхность стеклоуглеродного электрода, модифицированного сажей ПМ-75, предварительно окисленной в азотной.кислоте, которую перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5% фторопластового лака и

12-20% сажи. 1 ил.. 3 табл. ные хиноновые группы (О), катализирующие электроокисление цитохрома Ü2:

Цит.о2(вос.) + Q » Цит.о2(ок,) + ОН2

ОН -2е -2Н+ sn,ypод 0

Изобретение осуществляют следующим образом.

Сажу ПМ-75 перед модификацией выдерживают в 55%-ной азотной кислоте s течение 5 сут при комнатной температуре.

После этого ее промывают водой до нейтральной реакции (рН = 7,0) и высушивают, Смесь приготовленной сажи и раствора фторопаастового лака в ацетоне диспергируют ультразвуком пр№44 кГц в течение 0,5-1 ч. 8 полученную. суСпензию сажи погружают электрод на 3-5 с, затем его сушат, промывает дистиллированной водой и буферным раствором последовательно. На поверхность модифицированного сажей электрода

1831682

Таблица 1 наносят 10 мкл цитохрома Ьг, накрывают капроновой сеткой, а затем диалиэной целофановой мембраной, которую закрепляют резиновым кольцом.

Электрод погружают в 0,1 M К-фосфатцитратный буферный раствор рН 7,0, подключают к полярографу, задавая рабочий потенциал -0,2 В относительно Ag/ÀäÑI. В измерительную ячейку вводят раствор исследуемого вещества и регистрируют зависимость стационарного тока электрода or концентрации L-лактата, Пример 1. Определение концентрации L-лактата в водном растворе, Электрод готовят по общей методике.

При диспергировании сажи ультразвуком берут раствор. ацетона, содержащий 2-5 фторопластового лака и 12-20% сажи, Определяют зависимость электрода от концентрации L-лактата при потенциале электрода

-0.2 В относительно Ag/ÀgCI электрода сравнения (см.табл.1).

Иэ таблицы видно, что линейная зависимость тока от концентрации наблюдается до

0,5 MM 1-лактата (см.чертеж).

Анализ показывает, что при использовании предложенного электрода электроакисление лактата протекает при низком потенциале, что позволяет исключить электроокисление аскорбиновой кислоты. Также, как видно из чертежа электрод обладает высокой чувствительностью (5.8 мкА/мм (лактата), что позволяет использовать для анализов биологические растворы. разбавленные в более высокой степени. При повышении концентрации сажи или лака выше верхнего предела ухудшается электрохимическая обратимость поверхностных групп сажи, и при выходе на нижний предел ухудшается стабильность электрода.

Аналогично примеру 1 устанавливают, что электроокисление аскорбиновой кислоты протекает при потенциале -0,1 В относительно Ag/AgCI, поэтому ее присутствие не влияет на определение лактата при -0,2 В, Пример 2, Определение стабильности электрода, Готовят электрод по общей методике, В течение 12 сут периодически определяют величину тока электрода (потенциал электрода -0,2 В относительно Ag/Ag CI, концентрация лактата 0,1-0.3 MM). Данные приведены в табл,2.

Видно, что предлагаемый электрод. сохраняет работоспособность не менее 12 сут, s ходе которых произведено не менее 40 измерений. Промывка электрода и измерение занимает не более 4 мин.

Пример 3. Определение концентрации лактата.в биологических растворах, Готовят электрод по общей методике, Определяют концентрацию -лактата в плазме крови и культуральной жидкости выращивания продуцентов вируса лейкоза бы"5 ка аналогично примеру 1. Параллельно определяют концентрацию лактата спектрофотометрическим способом, по восстановлению феррицианида, катализируемому флавоцитохромом Ьр при введении исследуемого образца в спектрофотометрическую ячейку. При введении в спектрофотометрическую или электрохимическую ячейку образцы биологических жидкостей разбавляются в 10-40 раз. Полученные данные приведены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, концентрации L-лактата, определенные при помощи ферментного электрода и измеренные спектрофогометрическим способом, практически совпадают. Время определения не превышает 4 мин. Следовательно, полученный электрод может быть применен для определения L-лактата в биологических средах.

Преимуществом способа является упрощение модификации стеклоуглеродного электрода.

Формула изобретения

Способ получения ферментного электрода для определения L-лактата. включающий адсорбцию цитохрома Ь на слое токопроводящего материала, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса, модификацию электрода проводят сажей, предварительно окисленной в азотной кислоте, при этом Сажу перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5 фторопластового лака и 12-20 7; сажи.

1831682

Таблица 2

Сутки:

12

100

Относит, ток, :

100

100

100

60

55 50

Таблица 3

Составитель Р, Пошкене

Техред M.Mîðãåíòàë . Корректор А Обру ар

Редактор

Заказ 2550 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета но изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101