Способ приготовления эритроцитарного диагностикума на основе вируса диареи крупного рогатого скота

Способ приготовления эритроцитарного диагностикума на основе вируса диареи крупного рогатого скота

Реферат

 

Использование: биотехнология и диагностика вирусных заболеваний животных. Сущность изобретения: приготовление эритроцитарного диагностикума на основе штамма вируса диареи крупного рогатого скота ВК - 1 N28. При этом стабилизированные акролеином и танизированные эритроциты конъюгируют с антигеном с помощью смеси, состоящей из 0,1%-ного раствора хлорного хрома и раствора трипанового синего в разведении 1:500 при соотношении компонентов 5: 1. Предложенный диагностикум более точно выявляет постинфекционное и поствакцинальные антитела. 10 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, и в частности к диагностике вирусных болезней животных. Целью изобретения является повышение чувствительности эритроцитарного диагностикума. Указанная цель достигается тем, что для повышения чувствительности диагностикума для сенсибилизации используют штамм вируса диареи ВК-1 (зарегистрированный в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов под N 28) и для улучшения связывания вирусного антигена со стромой эритроцитов используется смесь 0,1% -ного раствора хлорида хрома с раствором трипанового синего в разведении 1:500 при соотношении компонентов 5:1. Штамм вируса диареи крупного рогатого скота (Bovine viral diarrhae mucosal disease) ВК-1 N 28 выделен из селезенки больного теленка С.А. Жидковым и Н. Н. Крюковым, депонирован во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветпрепаратов под N 28 и описан в ав.св. СССР N 1322673. Данный штамм предназначается для изготовления живой вирус-вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота (авт.св. СССР N 1538304). Существенным отличием предлагаемого способа изготовления эритроцитарного диагностикума от известных является то, что при сенсибилизации стабилизированных акролеином, танизированных эритроцитов крупного рогатого скота в качестве вирусного антигена используется штамм вируса диареи крупного рогатого скота ВК-1 N 28 в титре 5,5-6,5 lg ТЦД 50/мл и конъюгирующими агентами являются 0,1%-ный раствор хлорида хрома и раствор трипанового синего 1:500 в соотношении 5:1. Обоснованием для применения трипанового синего как дополнительного конъюгирующего вещества является то, что он взаимодействует с неживыми клетками и белками. В данном изобретении носитель антигена стабилизированные акролеином эритроциты вирусный антиген присоединяют трипановый синий, что усиливает сорбцию антигена на эритроцитах. Предлагаемый способ приготовления эритроцитарного диагностикума с антигеном вируса диареи крупного рогатого скота предлагается для выявления диагностически ценных антител у животных, переболевших вирусной диареей, вакцинированных вирус-вакциной а также при определении качественного состава сывороточных биологических препаратов. П р и м е р. Кровь получают от клинически здоровых бычков в возрасте 8-18 месяцев из яремной вены в колбу со стеклянными бусами и дефибрицируют. Эритроциты отмывают 3-кратно изотоническим раствором натрия хлорида до исчезновения белка в надосадочной жидкости путем центрифугирования при 2-3 тыс. об/мин. Эритроциты стабилизируют путем соединения равных частей 10%-ной суспензии эритроцитов и 0,2%-ного раствора акролеина (акрилового альдегида) на фосфатном буферном растворе (ФБР) рН 7,2 и контакта 30-45 мин при 37^оС. Стабилизированные эритроциты отмывают ФБР 2-3 раза до исчезновения запаха акролеина. Их можно хранить при 2-4^оС в течение 4 лет без потери способности к сорбции вирусных антигенов. Танизацию эритроцитов производят путем соединения 5%-ной взвеси стабилизированных акролеином эритроцитов и раствора танина 1:200000 в соотношении 1: 1. Смесь выдерживают в течение 30-40 мин при 37^оС, после чего 2 раза отмывают ФБР и 2 раза изотоническим раствором натрия хлорида (для удаления фосфат-ионов). Сенсибилизацию стабилизированных акролеином, танизированных эритроцитов крупного рогатого скота осуществляли путем соединения компонентов в следующих пропорциях, ч. 50%-ная взвесь стабили- зированных акролеином, танизированных эритро- цитов крупного рогатого скота 1 антиген вируса диареи из штамма К-1 N 28 1 изотонический раствор натрия хлорида 2 раствор трипанового синего в разведении 1:5000 на изотоничес- ком растворе натрия хлорида 1 0,1%-ный раствор хлорида хрома на изотоническом раст- воре натрия хлорида свежеприготовленный 5 Компоненты тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин, после чего сенсибилизацию останавливают 10-кратным количеством 0,05 М ФБР и в конце после 2-кратного центрифугирования осадок ресуспендируют в 0,3%-ном фенолизированном изотоническом растворе натрия хлорида с 1% нормальной кроличьей или лошадиной сыворотки, инактивированной при 56^оС в течение 30 мин и абсорбированной нормальными эритроцитами крупного рогатого скота при 37^оС в течение 30 мин. Для сенсибилизации использован штамм вируса диареи крупного рогатого скота ВК-1 N 28 из штамма вируса диареи "Орегон С-24У" (прототип) в титре 5,5-6,5 lg ТЦД 50/мл. Вирусосодержащую жидкость получали путем накопления вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или ее субкультуре (СПЭК). В табл. 1 представлены результаты сравнительной чувствительности полученных эритроцитарных диагностикумов с использованием штаммов вируса диареи "Орегон-С-24У" и ВК-1 N 28. Результаты исследований свидетельствуют о более высокой чувствительности эритроцитарного диагностикума, изготовленного из штамма ВК-1 N 28 по сравнению с диагностикумом из штамма "Орегон С-24У". В табл. 2 представлены сведения об отработке оптимальной концентрации вируса при изготовлении эритроцитарного диагностикума. В табл. 3 представлены результаты испытания различных веществ с целью повышения чувствительности эритроцитарного диагностикума с антигеном вируса диареи. Данные табл. 3 показывают, что трипановый синий из всех исследуемых препаратов повышает чувствительность эритроцитарных диагностикумов. В табл. 4 представлены результаты исследований по отработке оптимальной концентрации трипанового синего и количества его объемов при сенсибилизации эритроцитов вирусным антигеном. Оптимальными вариантами оказались следующие: использование для сенсибилизации 1 части трипанового синего в разведении 1:500 на изотоническом растворе натрия хлорида (рН 6,5-7,0). Диагностические ценные антитела к вирусу диареи крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации выявляются следующим образом. Исследуемые сыворотки крови разводят в растворителе, представляющем собой 0,3%-ный фенолизированный изотонический раствор натрия хлорида с 1%-ной нормальной лошадиной или кроличьей сывороткой, инактивированной при 56^оС и абсорбированной эритроцитами крупного рогатого скота при 37^оС по 30 мин 0 от 1:2 до 1: 4096 с коэффициентом 2. Разведение сывороток проводят микрометодом в микротитраторе системы "Такачи" в объеме 0,025 мл. После разведения сывороток в каждую лунку вносят по 0,025 мл эритроцитарного диагностикума в 1%-ной концентрации. Учет результатов РНГА осуществляют через 60-90 мин. Оценивают агглютинацию эритроцитарных диагностикумов в + по 4-бальной системе: 4+ четко выраженный "зонтик" с загибающимися внутрь краями; 3+ четко выраженный "зонтик". 2+ "зонтик" с заметным кольцом в центре лунки; 1+ четко выраженное кольцо в центре лунки со слабовыраженным "зонтиком". Диагностически положительной считается положительная РНГА при разведении сывороток от 1:8 и выше при интенсивности агглютинации эритроцитарного диагностикума на 2+.4+. В табл. 5 представлены результаты определения специфического эритроцитарного диагностикума с антигеном вируса диареи с использованием различных сывороток крови при исследовании в РНГА. Исследования показали, что эритроцитарный диагностикум, изготовленный с использованием трипанового синего при сенсибилизации эритроцитов по чувствительности в 2-6 раза вышел диагностикума, изготовленного без трипанового синего. В табл. 6 представлены результаты сравнительных исследований выявления противодиарейных антител в исследуемых сыворотках крови с использованием РНГА и реакции нейтрализации (РН). В табл. 7 представлены результаты исследований наличия постинфекционных антител в РНГА. В табл. 8 представлены результаты изучения наличия поствакцинальных антител в сыворотках крови вакцинированных вирусвакциной животных. В табл. 9 представлен материал изучения наличия антител в сывороточных биологических препаратах (неспецифическом глобулине, сыворотке реконвалесцентов). Таким образом, результаты представленные в табл. 7-9, показывают, что с помощью эритроцитарного диагностикума, изготавливаемого по заявляемому способу, с более высокой точностью определяется наличие постинфекционных и поствакцинальных антител, а также выявляется большее количество качественных сывороточных биологических препаратов, имеющих защитные титры противодиарейных антител и предлагаемых для лечения и профилактики вирусной диареи крупного рогатого скота. Для изучения специфичности эритроцитарного диагностикума он использован в качестве иммуносорбента для извлечения противовирусных антител из гипериммунной сыворотки. В табл. 10 показаны результаты использования полученного диагностикума в качестве иммуносорбента. Таким образом, полученный эритроцитарный диагностикум с использованием при сенсибилизации трипанового синего совместно с хлорным хромом, а также с использованием штамма вируса диареи крупного рогатого скота ВК-1 N 28, обладает высокой активностью, чувствительностью и специфичностью. Результаты таблицы показывают, что чувствительность эритроцитарного диагностикума с антигеном вируса диареи наивысшая при концентрации вируса при 5,5-6,5 lg ТЦД 50/мл. При более высокой концентрации вируса чувствительность диагностикума остается высокой, но имеется вероятность его самоагглютинации, а при более низкой чувствительность снижается.

Формула изобретения

Способ приготовления эритроцитарного диагностикума на основе вируса диареи крупного рогатого скота, предусматривающий сенсибилизацию стабилизированных эритроцитов антигеном вируса диареи с помощью коньюгтирующего агента, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, для сенсибилизации эритроцитов используют штамм вируса диареи крупного рогатого скота ВК-1 ВГНКИ N 28 в концентрации 5,5 6,5 log₂ ТЦД 50/мл, а в качестве коньюгирующего агента применяют смесь, состоящую из 0,1%-ного раствора хлорного хрома и раствора трипанового синего в разведении 1 500 при соотношении компонентов 5 1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 29-2000

Извещение опубликовано: 20.10.2000