Вещество, обладающее антикальциевым действием

Вещество, обладающее антикальциевым действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и касается применения вещества в качестве антикальциевым действием. Цель - повышение активности. Соединение 2,2 - диметил-3-окси-51,6,61,7-пиранокумарин предлагается в качестве вещества, обладающего антикальциевым действием,которое ранее было известно в качестве химического соединения.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОСУДАРСТВЕ ННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ЕДОМСТВО СССР

ГОСПАТЕНТ СССР) (5о5 А 61 К 31/37

ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПАТЕНТУ

НО

HHs CC н с

1) 4713965/14

2) 11.04.89

6) 23.08,93. Бюл. М 31

1) Ленинградский научно-исследователький институт вакцин и сывороток и Ленинрадский санитарно-гигиенический едицинский институт

2) А.Ç.Абышев, Г.И;Дьячук, Т.П,Вишневецая, Г.Я.Лапкина, H.À.Ëoáàíoà и Е.В.Семеов

3) Ленинградский научно-исследователь-. кий институт вакцин и сывороток

6) М.Д.Машковский "Лекарственные средтва", М, Мед. 1985, ч.1, стр.427.

ХПС, 1977. N 5, с.640.

1 !

Изобретение относится к медицине, a менно, к фармакотерапии патологии серечно-сосудистой системы и касается новоо биологически активного соединения, Обладающего антикальциевым действием.

Целью настоящего изобретения являетя расширение арсенала средств. обладаюих более выраженным антикальциевым ействием, чем у известных препаратов. казанная цель достигается использованим нового соединения кумаринового ряда ,2 -диметил-3 -окси-5,6,6,7-пи рано кума ри н, ормулы олекулярной массы 246, в дальнейшем менуемым ДЕКУРСИНОЛОМ. Предложеное соединение отличается от известных по

„„ Ц „„1836О87 АЗ (54) ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИКАЛЬЦИЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к области медицины и касается применения вещества в качестве антикальциевым действием. Цель — повышение активности. Соединение 2,21 диметил-3-окси-5,6,6,7-пиранокумарин

1 1 предлагается в качестве вещества, обладающего антикальциевым действием, которое ранее было известно в качестве химического соединения, химической структуре. Это отличие сообщает заявляемому соединению соответствие критерию новизны (химической структуры).

На фиг.1 приведены графики, отражающие уменьшение проницаемости мембран эритроцитов под влиянием декурсинола и верапамила. На фиг.2 представлено угнетающее влияние декурсинола на проявление биоэлектрической и миогенной активности гладко-мышечных клеток сосудов. На фиг,3 представлено угнетающее влияние верапамила на проявление биоэлектрической и миогенной активности гладко-мышечных клеток сосудов, Пример 1. Получение декурсинола, 1, Выделение и очистка, Декурсинол выделяют иэ этомольного экстракта (142 г) корней Se sell 9 ra n dl vittatv m schi sc hk c помощью колоночной хроматографии общепринятым методом. Очистку пооизводят двухкратной кристаллизацией из хлороформа. Получают 8,2 г однородного вещества

1836087 состава СI4HI404, т,пл. 180-181,5

/ /!з 2 — 8,98 (с 2,56; хлороформ), Rr 0,31 (фиолетовос, система VI), отвечающего по сг,оим конс Гантам (-) — декурсинолу. Найдено, 4: С 68,10; 68,15; I-! 5,45; 5,60, М 246, С74Н «04. Вычислено, %: С 68,25; Н 5,69; M

246, ИК-спектр (см ): 3460, 1710, 1635, 1570, .00, !400, 1375, 1340, 1300, 1270, "200, 1190, 150, !080, 1030, 935, 880, 830, 750, 710, Масс-спектр (3980A, 70 эВ): 246 (М ), 6

214, !08, 177, 148, 128, 71, 69, 43 m/е, В

ИК-спектра помимо других полос, наолюдается полоса поглощения при 3460 см (гидроксильная группа). Наличие в молекуле одной гидроксильной группы подтвер>кдено полу --lelli e 1 моноаце-.ильнОГО Гl!зоизводноГо в следующих условия><.

2, Аиеп1лированиа Декурсинола (1).

0,25 г ",20 мл уксусного ангидр1лда и 5 мл и:1ридина нэгрeBЯ1от на водяной бане в течение 5 час. !1олуча от смесь исходного вещества 7 ;, его ацетата, <отору.о разделя ог на колонке (3 х 42 см) с 150 г окиси ал1омин11Я I I I сте Г1ен и активности. Эл юи!зу ю Г бен зол ом (! 8 фракция), затем xrlopoформам (9-17 фракция), собирая фра:<ции

i10 50 мл. Из 6 — 12 фракций после с>ггонки растворителя и перекристаллизации из ГекcBI Ie l>o 1у le loT О, 1 9 f BUeTNllbI I of и pol i3 BOBIно О деку!зсинола (II) С1<1!11605, т,пл. I4! -142 С. Rr 0,68 (ф1 оле roBoe, сис тема И), ИК-спектр (см ): 1740, 1640, 1570, 1500, 1440, 14Г10, 1380, 7360, 1290, 7260, 1230, 1200. 1 !50, 1050, 1040, 935. 890; 830, 760, 720.

Масс-спектр (9800 А, 70 эВ): 288 (М ), 229, 214, 1 76, 748, 131, 92, 77, 69, 43 m/å.

3. Дегидратация декурсинола (I).

0,26 r (I) растворяют в 30 мл метанола, добавляют 50 мл 20 " / серной кислоты и нагревают на водяной бане 4 часа. Метанол отгоняют под вакуумом и реакционную смесь обрабать1ваюг обычным способом, Полученный остаток (0,15 г) разделя1от препаративно. При этом получают вещество с т,пл. 126 128", идентифицированное с ксантилетином (III). И !<-спектр (см ): 1720, 1630, 1590, 1580, 1450, 1395, 1290, 1140, 940, 900, 850, 830. 800, 760, 7-10, Масс-спектр (5980 А. 70 эВ): 228 (M ), 214, 186, 7 58, l38, 114, 66., 43 m/е. Из вышеприведенных данных вытекает, что декурсинол (1,1 ОтнОситсЯ к i!зуппа

3,4-дигидропиранокумаринов линейного ряда. В !1МР-спектре 1 в области слабого гиля име1отся два дублеса при 6,0 и !,ЗЗ м.д„z = 10 Гц и два синглата при 6.54 и 6,94 мд. (по 1 Н ка>кдый), 311ачения химических .дви1OB этих с иГналоп и их констаHT ст1ин5 10

50 спинового взаимодействия соответствуют протонам в положениях 3,4-Q -пиронового цикла и 8,5 ароматического ядра, соответственно. Эти дан11ые показывают, что кумариновое ядро декурсинола замещено в положениях 6, 7, причем заместителем является шестичленная циклическая система, так как в области сильного поля отмечаются сигналы протонов 2,2 -диметил-3,4 дигидропиранового цикла, в котором метильные группы оказываются неэквивалентными, поэтому их сигналы. обнаруживаемые при

1,26 и 1,28 мд., расчепляются на 1,5 Гц.

Дублет при 2,08 м,д, z = 6 Гц, по-видимому относится к протону гидроксильной группы, Отнесение этого сигнала подтверждаетс.: тем, что при сьемке спектра в дейгерохлороформе с добавкой дейтероэтанола расщепление сигнала гидроксильного протона исчезает и в спек ра наблюдается одиночный пик. Очевидно, расщепление сигнала происходит за счет спин-спинового взаимодействия гидроксильного и 17-углеродного протонов. Сигнал о» последнего наблюдается; IpN 3,7 1 м.д. в виде квартета, 21 =- 1 Гц, z7 =- 5 Гц. Сигналы MGT4lieíов0 1 Группы, и!зисоединенной к аро латическому ряду, обнаружиьаются B виде двух квартетов (2,66 и

2,97 м.д., zi =- 17 Гц, 22 =- 5 Гц). Последний позволяе Отличать 3,4-дигидропиранокума ри н ь1 От 4,5 -ДиГи дрофу ра но к >сMct pNH oB, в спектрах которых сигналы данной группы проявляются в вида дублетов при 3,20 — 3,50 м,д. с константой спин спинОВОГО взаимоДействиЯ z =- 8 8,5 I Ц.

Таким образом, из вышеизложенных данных следует, что (11 является (-) — 3 -окси3, -4 дигидроксантилетином, что соответствует новому пиранокумарину — (-)—

3 (R)-декурсинолу. Это закл1очение подтвер>кдается и результатом излучения ПМРспектра I l, в которотл отмечается трехпротонный eèãëåò GT метила ацетильной группы при 2,0 м,д. и парамагнитный сдвиг сигнала QT метилового протона в поло>кении 3 (триплет при 4,93 м.д., z = 6,5 Гц), друг в сигналы, наблюдаемые в спектре tl, аналогичнь таковым, обнаруживаемым в спектре I.

Вышеизло>кенные данные согласуются со структурой 1, предложенной для декурсинола.

Данные по отнесению химических сдвигов и констант спин-спинового взаимодействия представлены ниже в, м.д, (2, Гц).

С вЂ” 2 161 0 С вЂ” 9 153,6

С вЂ” 3 112,7(173) С вЂ” 10 1t2,5

С вЂ” 4 142,9 (168) С вЂ” 2 78,0

1836087

-со-сн, IV о

С вЂ” 5 128,6 (164) С вЂ” 3 69,9 (149)

С вЂ” 6 116,4 С вЂ” 4 30,6 (138) (H

j Н !

0 (сн со) о ъ

О 0 0 0 с.о,i

Н2. S0> соон сн

О-C (00Н О о

У Снз 0—

С вЂ” 7 156,2 С вЂ” 2 25,1 (136)

С вЂ” 8 104,8 (164) С вЂ” 3 21,9 (130) Таким образом, представленные физико-химические и спектральные характеристики позволяют привести. структурную 5 формулу (1).

Пример Ii. Испытания проницаемости эритроцитарных мембран под влиянием декурсинола

Анализ проводят следующим образом; 10 в 8 центрифужных пробирок наливают по 5 ! мл рабочих растворов с возрастающим соержанием мочевины. В первую пробирку ряда наливают 5 мл изотонического раство-! ра хлорида натрия, в восьмую — 5 мл изото- 15 ( нического раствора мочевины (0,3 М). Это талон нулевого и 100% гемолиза. Затем в аждую пробирку добавляют по 0,1 мл взвеи зритроцитов, осторожно перемешивают оставляют стоять на 3 — 5 мин. Затем все 20 робирки центрифугируют при 1000 об/мин течение 5 мин. В центрифугате определят степень гемолиза путем фотометрироваия на ЛФК вЂ” 69 зеленым светофильтром в ювете с рабочим расстоянием 1 см против 25 талонов, приготовленных из этой же пробы ритроцитов. Интенсивность гемолиза расчитывают в процентах по отношению к опической плотности гемозата в пробирке М (100% гемолиз в изотоническом растворе 30 очевины).

Формула расчета:

Дх 100Д ц ц = % гемолиза де Дх — оптическая плотность надосадочой жидкости в пробирке с данной концен- 35

- рацией мочевины в рабочем растворе.

Д оч-оптическая плотность надосадочной жидкости в пробирке с изотоническим аствором мочевины (100% гемолиз).

Увеличение проницаемости характери- 40 уется увеличением степени гемолиза, ее меньшение- снижением процента гемолиа в пробе.

Опыты проводят на крысах в условиях Ь

ivo u in vitro. Для сравнительной оценки 45 используют известный антагонист кальция — верапамил в дозе 10 мг/кг. Декурсинол вводят внутривенно в дозах 0,5 — 10 мг/кг.

Через 2 часа животных декапитируют для забора крови. Для изучения действия веществ в условиях in vitro растворы добавляют к цитратной крови из расчета 0,2 мг на 5 мл крови. Полученные данные представлены на фиг.1.

Из графиков видно, что декурсинол уменьшает проницаемость эритроцитарных мембран в дозе 5 мг/кг, а в меньших дозах декурсинол не оказывает влиния на проницаемость мембран эритроцитов. Верапамил уменьшал проницаемость эритроцитарных мембран лишь в дозе 10 мг/кг.

Таким образом, декурсинол, как и его аналог верпамил уменьшают проницаемость мембран эритроцитов, причем декурсинол в большей мере и в меньшей (в 2 раза) дозе, что свидетельствует об уменьшении проницаемости мембран для электролитов.

Пример iii. Сравнительное испытание антикальциевого действия декурсинола и верапамила на изолированных сосудах.

Эксперименты проводят на изолированных препаратах воротной вены крыс длиной 4-6 мм и массой в среднем 0,2-0,6 г. Гладко-мышечные клетки (ГМК) сосудов обладают спонтанной электрической и сократительной активностью s виде потенциалов действия и фазных сокращений.

Спонтанная ритмическая активность ГМК воротной вены поддерживается в экспериментальных условиях без существенных изменений в течение нескольких часов и быстро восстанавливается после различного рода стимулирующих воздействий. Сосудистые препараты перфузируют раствором

Кребса следующего состава (в ммоль/л):

NaCf-133, KCI-4,7, йаНСОз — 16.3, МаНРО4 — 1,38, CaCl2-2,5, MgC4-1,2, глюкоза — 7,8, рН вЂ” 7,4, температура 37О, Буферный рас1836087 твор насыщают газовой смесью. содержащей 16-21% кислорода, 74-.79% азота и 5 )(, углекислого газа. Для снижения P0z в буферном растворе содержание кислорода в газовой смеси уменьшают до 1 $, а для увеличения Р02 увеличивают содержание кислорода до 80, Контроль насыщения кислородом в буферном растворе осуществляют полярографическим методом. Биоэлектрические показатели (уровень мембранного потенциала. амплитуда и частота потенциалов действия) регистрируют с помощью метода сахарозного мостика. Участок ткани между отводящими электродами постоянно промывают изотоническим рас твором сахарозы с высоким (не менее

10 -! 0 O см) удельным сопротивлением. Благодаря этому электролиты практически полностью вымываются из внеклеточного пространства и замещаются раствором сахарозы. Тем самым исключаетд дя шунтирующее влияние электролитов внеклеточной жидкости и создается воэможность регистрировать максимально близкие к истинным величинам мембранного потенциала и потенциалов действия. Активность препаратов воротной вены зависит от концентрации ионов кальция.

Исследуемый сосудистый препарат помещают в 3-х секционную камеру, отсеки которой отделяются друг от друга тонкослойными резиновыми мембранами, Левая секция (тестируемая часть) перфузируется раствором Кребса, средняя — раствором сахарозы, правая — раствором КС! .(120 ммоль/л). Электрическая активность отводится с помощью хлорсеребряных неполяризующихся электродов, погруженных в агар-агар и подается на вход катодного повторителя усилителя постоянного тока. Для регистрации сократительной активности клеток сосудистых гладких мышц сосудистый препарат (воротная вена крысы) фиксируют в перфузионную ячейку объемом 0,6 мм, помещенную внутри камеры. Внутри камеры размещают также емкости для тестирующих растворов, механоэлектрический преобразователь, датчик температуры, нагревательные элементы регулирования и многовходовый распределительный кран.

Одновременно с помощью механотрапного преобразователя 6МХ1С регистрируют сократительную активность ГМК (спонтанные сокращения в изометрическом режиме). Регистрацию электрических и сократительных реакций проводят на диаграммой ленте автоматического потенциометра, Для сравнительной оценки аникàRьциевого действия декурсионола используют верапамил — известный антагонист кальция. В условиях перфуэии воротной вены нормально оксигенированным буферным раствором

Кребса электрическая активность ГМК проявлялась в медленных изменениях мемб5 ранного потенциала в виде так называемых медленных волн деполяризации продолжительностью 2-4 с и амплитудой 2 — 4 мВ. На их фоне наблюдается появление разрядов потенциалов действия, состоящие из 3 — 7

1-0 пиковых потенциалов амплитудой 1 — 3 мВ, которые отражают вход Са2+ в ГМК. Сократительная активность характеризуется ритмическими фазными сокращениями амплитудой 3-4 мН и продолжительностью

15 3-5 с. Содержание декурсинола в буферном растворе определяли из расчета эффективной дозы вещества, которое оказывало в наших исследованиях противоаритмическое и коронарорасширяющее действие, а

20 содержание верапамила — из расчета дозы, в которой он используется в терапевтической практике при сердечно-сосудистой патологии. Перфузия буферного раствора, содержащего 1 . 10 ДЕКУРСИНОЛА, при25 водила через 5-7 мин к полному торможению биоэлектрической и миогенной

° активности ГМК сосудов, что свидетельствует об антикальциевом действии соединения (фиг.2), При перфузии буферным раствором, 30 содержащим 1 10 верапвмила отмечается, подобно перфузии декурСи налом, торможение проявлений биоэлектрической и миргенной активности ГМК сосудов, что видно на фиг.3.

35 Отмывание препаратов проводили тремя обьемами физиологического раствора

Кребса, после чего восстанавливалась авторитмическая активность ГМК. Таким образом, равноценный эффект на

40 биоэлектрическую и миогенную активность

ГМК сосудов вызывает декурсинол в разведении 1 10, а верапамил в разведении

1 10 5, что свидетельствует о превышении активности декурсинола в сравнении с вера45 памилом в 10 раз, Введение норадреналина в концентрации 1 10 ммоль/л в нормально оксигенированный раствор Кребса приводило к деполяризации мембраны на 6-8 мВ, увеличению частоты спонтанных потен50 циалов действия и фазных сокращений, т.к. норадреналин активирует резерв неактивированных хемочувствительных потенциалнезависимых Са-каналов. Возбуждающее действие норадреналина на ГМК сосудов

55 является результатом активации хемочувствительного входа Са в клетку, управляемог+ .

ro альфа-адренорецепторами. Эти данные позволяют сделать вывод, что один иэ наиболее важных звеньев в цепи сопряжения

1836087

Составитель А.Абышев

Техред M.MopfGHTaë Корректор М.Максимишинец

Редактор Заказ 2991 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 о збуждения с сокращением в ГМК являетя система трансмембранного пассивного

2+ ранспорта Са, на которую оказывает влиние верапамил, как антагонист кальция, и екурсинол, который проявлял антикальцивое действие в наших исследованиях. Сниение кальциевой проницаемости арколемы миоцитов сосудистой стенки соровождается падением входящего кальцивого тока, нарушением генерации отенциалов действия и фазных сокращеий, уменьшением развиваемого ГМК уров я изометрического напряжения.

Таким образом, на основании провеенных экспериментов видно, что новое содинение декурсинол обладает нтикальциевым действием, а по своей акивности превосходит верапа лил.

Пример IV. Испытание антикальциеого действия декурсинола по его влиянию а включение Са в отдельные структуры оловного мозга.

j

Влияние декурсинола на включение

Са в нервные клетки отдельных структур

5 ! оловного мозга изучено в экспериментах а 54 крысах. Крысам BHутрибрюшинно BBQят декурсинол в дозах 1 и 10 мг/кг, аерапаил в дозах 10 20, 30 и 40 мг/кг и

45 дновременно всем крысам вводят Са из асчета 38 мк БК 1 мк С на 100 г массы кивотных. Контрольным животныM вводят

1 израствор и Са. Животных через ЗО мин

45 декапитируют, извлекают мозг, по возмо>к ости освобождают его от крови и помещат в чашку со льдом. Выде IBIQT отдельные области мозга (гипоталамус, кору) и подверают их гидролизу в 1 í NaOH (0,7 мл) при

60 С в течение 30 мин. Гидролизат нейтрализуют 1 мл 0,67 í HCI. Включение Са

4;> определяют по уровню радиоактивности в

l идролизате ткани (имп/мин на 1 мг белка),,оторую определяют в жидкостном счетчике ! Магк-3". Для этого 1 мл гидролизата вносят во флаконы с 10 мл сцинцилляционного раствора ЖС вЂ” 8. Белок определяют по Лаури.

При введении декурсинола в дозе 1 мг/кг нами не отмечено ингибирования

5 включения Са в нервные клетки изучаемых структур головного мозга (гипоталамусе и коре), При введении декурсинола в дозе 10 мг/кг нами отмечен высокий процент ингибирования включения 5Са в нервные клет10 ки гипоталамуса и коры — количество импульсов в тканях гипоталамуса уменьшилось и составило 87, а в коре процесс ингибирования был выражен в большей мере — количество импульсов при этом соста15 вило 54%, что свидетельствует об угнетающем влиянии декурсинола на проницаемость нейрональных мембран для

45Са. Верапамил в дозах 10, 20 и 30 мг/кг не оказывал ингибирующего влияния на вклю20 чение Са в изучаемых структурах головного мозга. В дозе 40 мг/кг верапамил ингибировал включение Са в гипоталаму45 се — количество импульсов при этом уменьшилось до 917, а в коре до 85$, т.е, 25 ингибирующее влияние верапамила выражено в меньшей мере, чем декурсинола, который вызывал более выраженный эффект уже в дозе 10 мг/кг, Таким образом, способность декурси30 нола ингибировать включение Са в отдель4 ные структуры головного мозга (гипоталамус, кора) свидетельствует о том, что он проникает через гематоэнцефалический барьер и оказывает угнетающее влия35 ние на проницаемость нейрональных мембран для Са. Отмечена большая актив45 ность декурсинола по сравнению с верапамилом (декурсинол превышает активность верапамила в 4 раза).

40 Формула изобретения

П р и м е н е н и е 2,2 -диметил-3 -окси5,6,6,7-пиранокумарина в качестве вещества, обладающего антикальциевым действием.