"способ получения комплекса липидов "фосфотим" из животного сырья"

"способ получения комплекса липидов "фосфотим" из животного сырья"

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, получав мый комплекс липидов может использоваться в медицине как иммунокоррегирующее средство. Сущность изобретения: в качестве сырья используют вилочковую железу крупного рогатого скота, которую измельчают , гомогенизируют в физиологическом растворе , центрифугируют, из флотирующей липидной фракции суспернатанта путем экстракции йзопропанолом в соотношении 1:{5-10). выделяют комплекс липидов, центрифугируют , из супернатэнта после переосаждения ацетоном в соотношении 1:(2-10) получают целевой продукт.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((9) (I 1) (si)s А 61 К35/26/! А 61 К 31/685

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ". "3

ПАТЕНТУ

) 5014084/14

) 20.11,91

6) 23.08.93. Бюл. М 31

) Институт биохимии им. H.Â.Ïàëëàäèíà

2) С.Н.Тихонова, С.В.Комиссаренко.

В.Волощенко, В.А.Богуславский, Ю.Мирошниченко и И.Н.Гавриш

) Малое предприятие "Биохим"

) Патент США М 4474773, А 61 К 31/685. 1984..

4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА

ПИДОВ "ФОСФОТИМ" ИЗ ЖИВОТНОГ СЫРЬЯ

Изобретение относится к фармацевтической и парфюмерно-косметической пром шленности, а получаемый комплекс ли идов может использоваться в медицине ка иммунокоррегирующее средство, в косм ике как компонент для регенерации клето кожи, В отличие от известного сущность предло енного способа заключается в следующе: — в качестве сырья используют вилочкову железу крупного рогатого скота, котору измельчают и гомогенизируют в фи иологическом растворе; — отделяют жидкую фазу (центрифуги руют) при этом образуется осадок и суспернатан с флотирующей липидной фракцией; — из флотирующей фракции зкстрагируют зопропанолом комплекс липидов;

1 (57) Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, получае мый комплекс липидов может использоваться в медицине как иммунокоррегирующее средство. Сущность изобретения: в качестве сырья используют вилочковую железу крупного рогатого скота, которую измельчают, гомогенизируют в физиологическом растворе, центрифугируют, из флотирующей липидной фракции суспернатанта путем зкстракции изопропанолом в соотношении

1:(5 — 10), выделяют комплекс липидов. центрифугируют, из супернатанта после переосаждения ацетоном в соотношении

1:(2-10) получают целевой продукт. — отделяют жидкую фазу (декантация и центрифугирование); — осаждают ацетоном комплекс биоло. гически активных липидов; — концентрируют(отгонка ацетона) и сушат конечный продукт.

Получаемый комплекс содержит: глицериды 37-55 . холестерин 4-13;4 (в свободном и зтерифицированном аиде). свободные жирные кислоты 6-12 Я при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщеным 1:1. 14-407 плазмалогены, фосфолипиды 2 — 13/, (фосфатидилхолин, фосфати дилзтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилиноэитол в соотношении 1; I:0,7:0,3), Несмотря на разнообразие общепринятых источников сырья для получения липидов, вилочковая железа, известная для специалистов как источник сырья для выде1836092 ления иммуноспецифических белков, никогда для этих целей не использовалась. В настоящее время из указанной железы выделяют исключительно белковые препараты, обладающие иммунокоррегирующими свойствами, например: "вилозен" (7), "тималин" (8), "тактивин" (9), Прй этом сырье используют недостаточно рентабельно, так как выход известных препаратов составляет всего 5 — 7 от веса исходного сырья.

Предложенное изобретение, не исключая выделения из вилочковой железы указанных белковых препаратов, позволяет получать параллельно комплексы биологически активных липидов благодаря оптимальной утилизации фракций гомогенизированного сырья после центрифугирования: супернатант используют для выделения известных белковых препаратов (7, 8, 9), а флотирующую фракцию — для выделения нового комплекса биологически активных липидов.

Исследования состава полученного комплекса выявляют существенный иммунокоррегирующий эффект, Возмо>кность осуществления нового способа, а также доказательства биологической активности комплекса липидов иллюстрируются примерами конкретного выполнения изобретения и испытания биологического действия конечного продукта, Пример 1. 10 кг вилочковой железы измельчают на мясорубке с диаметром фильеры 2 мм, гомогенизируют в 2 объемах физиологического раствора, центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин и температуре

4 С в рефрижераторной центрифуге. Из супернатанта выделяют препараты типа "вилозен". Флотирующую фракцию супернатанта отбирают и экстрагируют в реакторе 7 объемами изопропанола в течение 3 ч при перемешивании и последующем отстаивании экстракта в течение 16 ч и центрифугировании (3000 об/мин 30 мин, -4 С).

Суспернатант декантируют и концентрируют путем вакуумной отгонки растворителя, Целевой продукт получают переоса>кдением 2 объемами ацетона при 4 С. Фильтрацией и сушкой. Выход конечного продукта составляет 4 от веса исходного сырья и

20% от влажного веса флотирующей липидной фракции.

Состав комплекса липидов: холестерин

6 o свободной и этерифицированной форме: свободные жирные кислоты 12 при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщенным 1:1, фосфолипиды

2 (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилинозитол при соотношении 1:1:0,7:0,3), глицериды

45, плазмалогены 35 ., Пример 2. 10 кг вилочковой железы обрабатывают аналогично примеру 1 и получают флотирующую фракцию супернатанта, которую отбирают и экстрагируют в реакторе 5 обьемами изопропалона в течение 3 часов при перемешивании и последующем отстаивании экстракта.

10 Надосадочную жидкость декантируют и центрифугируют при 0 С в течение 20 мин при 1500 об/мин, Надосадочную жидкость декантируют, а растворитель удаляют вакуумной отгонкой, Целевой продукт получают

15 переосаждением липидов 5 объемами ацетона при 0 С, фильтрацией и сушкой. Выход конечного продукта составляет 6 от массы исходного сырья и 30 от влажной массы флотирующей фракции.

20 Состав комплекса, ; глицериды 55, холестерин 13 в свободной и этерифицированной форме, свободные жирные кислоты 8 при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщеным 1:1, фосфолипи25 ды 10 (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилнозитол в соотношении

1;1;0,7:0,3), плазмалогены 14, Пример 3. 10 кг вилочковой железы

30 обрабатывают аналогично примеру 1 и получают флотирующую фракцию супернатанта, которую отбирают и экстрагируют в реакторе 10 объемами изопропанола в течение 3 часов при перемешивании и последу35 ющем отстаивании экстракта.

Надосадочную жидкость декантируют, а растворитель удаляют вакуумной отгoHKQA.

Целевой продукт получают переосаждением липидов 10 объемами ацетона при 0 С, 40 фильтрацией и сушкой. Выход конечного продукта составляет 7 от веса исходного сырья и 35 / от влажного веса флотирующей фракции.

Состав комплексов, ; глицериды 37, хо45 лестерин 4 в свободной и этерифицированной форме, свободные жирные кислоты 6 при массовом отношении насыщенных жирных кислот к ненасыщенным 1:1, фосфолипиды 13 (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, 50 сфингомиелин, фосфатидилинозитол в соотношении 1:1:0,7:0,3), плазмалогены 40.

Пример 4. Активность полученного комплекса липидов "фосфотим" определяют в эксперименте in vl)ro параллельно с конт55 ролем — препаратом "Вилозен" (7). Лимфоциты тимуса мышей выделяют разволакиванием ткани пинцетами в среде

R P M1-1640 (Комиссаренко С. В„Уманский

B.Þ„ÄMèTðåHêî H.Ï. Активность аденозиндезаминазы и ферментов обмена AMP в

1836092

6 Иммунология, 1982, Мг 2..1

1 : стимулированных КонА тим имоцитах крыс. соавт. 1972) и "активного" спонтанного оросодержит НЕРЕС 20 мМ Na . с. 6-18), Среда зеткообразования (Та-PO), являющиеся (), НСОз (1,5 маркером дифференцирующейся субполямг мл), пенициллин (50 Е/мл), стрептоми- ции T-лимфоцитов (Н.MIne, N.Kenlchl 1978, цин(50 мкгlмл) и эмбриональную сыворотку 5 G.Bertogllo 1976). Для исследований отбиракрови 5%), рН среды доводят до 7.3-7,5% ют лимфоциты лиц, у которых содержание бикарбонатом натрия. Суспензию клеток Ta-PO в периферической крови менее 20%, фильтруют через кап роновое сито и дважды т.е. имеющие дефект в процессе созревания центрифугируют по 10 мин при 8000 g. Жиэ- лимфоцитов. Преинкубацию проводят в тенеспособность лимфо итов оп ф ц ределяют ме- 10 чение 2 ч с последующим отмыванием лимтодом витального окрашивания 0,1% фоцитов 10мл среды 199, раствором трипанового синего в изотониче- еакцию т — проводят по методике ском растворе NaCI. В полученной суспен- М.Jendal (1972) в модификации Петрова .эии содержится не менее 99 живых (1978), а Та-PO по методу J.Wybran, леток. Тимоциты культивируют в среде вы- 15 N.N.Fundenber (1973). К еления при 37 С, кон ент а и г9 . онечная концентеления при, концентрация составля- рация в инкубационной среде нового компимоцитов вызывают преинкубацией клеток Количество лимфоцитов, формирующих течение 2 часов с полученным комплексом Та-PÎ, повышается после преинкубации их ипидов(0,05-0,3мгlмл) и препаратом "ви- 20 с новым липидным комплексом в г ппе озен" (контроль) в таких же к н р ) х е концентрациях больных с ревматоидным артритом н 82% комплексом в группе последующей отмывкой инкубационной и наблюдается у всех 10 обследованных лиц редой путем центрифугирования в течение этой группы, Более отчетливо стимул

0 ин, при 800 g, после чего в культураль- щее влияние (на 12% — < 001) у ируюиюсе инкби у р ду у рующихся клеток опытной 25 больных с травмой позвоно а % — р <, ) в группе контрольной г пп вн я и позвоночника, осложр и групп вносят конкавалин А ненной повреждением спинного мозга. о конечной концентрации 5 мкг/мл, Меч/мл, Мече- Аналогичные тенденции, хотя и менее ие ДНК и оизводят в течение 2-ч р д - ом (6-Нд ие 2-часового выраженные. отмечаются под влиянием ноериода с Н-тими ином (6- НкМ . Включени м р д - д ом (6- Н-тимидин, 4 зого липидного комплекса на Тт — PO. Н и

). ю е. ие метки определяют через 30 комплекс повышает на 5,6% способность !

2 ч от начала культивирования. лимфоцитов больных ревматоидным артриВключение меченого и е ш т р д ес венника том людей к образованию "тотальных розев ДНК исследуемых тимоцитов определяют ток". У лимфо лимфоцитов альных с травмой б и радиоактивности кислотонерастворимо- позвоночника.ос ложненнои повреждением б мажных ильт ах "ЧЧ г осадка клеток после их осаждения на 35 спинного мозга, актив зга, активация нового комплекмажных фильтрах "Whatman — ЗММ" и са более значительна и составляет 7,8% и омывании 6 ТХУ, Н20 и зтиловым спир- (р < 0,01). т м, высушивания зфи ом, Pà ф р, адиоактив- . Факт более значительного влияния нон сть фильтров подсчитывают в вого комплекса на процесс Та — PO по сравс интилляционной жидкости ЖС вЂ” 1, 40 нению с Тт-PO позволя

Включение — нию с т- позволяет предположить ключение меченого тимидина в ДНК воздействие. прежде всег его, на предшестреинку ированных с 0.05 мг/мл венники клеток, популяцию Т-лимфо итов н воголипидного комплекса в3 а а в к, в раза выше, поверхностные маркеры которых выявляютч м в тимоцитах, преинкубированных с 0,05 ся в реакц Т -PO, и м /мл вилозена" (контроль), 45 дифференциации. к ии а-, т.е. клеток на стадии

Пример 5. Испытания имм иммунной Таким образом, новый комплекс, очеа ивности полученного комплекса липидов видно, активирует созревание Т-лимфоци та к ови20 осфотим" проводят in vitro на лимфоци- тов, особенно в сл т итом, 10 осложн та крови 0 больных (10 ревматоидным ар- таких сложных патол тологиях как ревматоиди воночника с пов еж ни

0 осложненной травмой 50 ный артрит и травма позво о н чника, осложм зга). повреждениями спинного ненная повреждением спинного мо зга.

В опытах in vitro оценивают влияние . Ф о р м у б ормула изобретения получения комплекса липидов пр инкубации нового комплекса с лимфоци- Способ получения та и периферической крови, выделенными 55 "фосфотим" из животного сырья, включаюв r адиенте плотности фиколл-верография, щий измельчение сырья, экстракцию органа процессы "тотального" спонтанного ро- ническим р с ч ским растворителем, отделение эе кообразования (Тт-PO) лимфоцитами супернатанта со нта. содержащего целевой пробо ьных с эритроцитами барана, являющи- дукт, центриф . ц нт ифугированием с последующим ес маркером Т-лимфоцитов (M Gondal и его концентрированием, отгонкой о т л и чI

1836092

Составитель С.Тихонов

Гехред М,Моргентал . Корректор С. Юско

Редактор

Заказ 2991 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного. комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 а ю шийся тем, что в качестве сырья используют вилочковую железу крупного рогатого скота, после измельчения сырье гомогенизируют в физиологическом растворе, центрифугируют, флотирующую фракцию суспернатанта зкстрагируют изопропанолом в соотношении 1.:5-10, снова центрифугируют, а целевой продукт после отгонки обрабатывают ацетоном в соотношении

5 1;2-10.