Способ получения промотора для конструирования вектора и способ конструирования вектора для экспрессии белков в клетках

Способ получения промотора для конструирования вектора и способ конструирования вектора для экспрессии белков в клетках

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Сущность изобретения заключается в том, что предложен способ получения нового типа промоторов для эспрессии чужеродного гена, которые конструируются из промотора Ра оперона рибосомальной РНК E.cofl и нескольких регуляторных последовательностей , происходящих от tac-оперонэ Е. coll. Сущность изобретения заключается также в том, что осуществляют делецию большей части оперона рибосомольной РНК Е. coll, встроенного в соответствующий вектор, соединяют вместе оставшуюся часть ггп-оперона, содержащего промотор Ра. с начальной частью ас-оперона вне областей -35 и -10 и ниже их, с тем, чтобы в точке соединения последовательностей создать новый сайт расщепления эндонуклеазы Nsi. Затем осуществляют делецию внутреннего элемента последовательности TGCA из вновь созданного Nsi-сайта расщепления и встраивают экспрессируемый структурный ген между указанными вновь созданными регуляторными последовательностями. 2 с.п. ф-лы, 10 ил. 1Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУбЛИК (sl)5 С 12 N 15/70, 15/72

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Е (21) 4743453/13 (22) 15.03.90 (86) РСТ/HU 88/00061 (14.09,88) (31) 4111/87 (32) 16.09.87 (33) Н0 (46) 23.08.93. Бюл. N. 31 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Термекек Дьяра РТ (НЦ) (72) Тамаш Лукачових, Пал Венетианер, Тамаш Гаал, Имре Борош и Габриелла Балико (Hu) (56) 1. ЕПВ, 0067540, С 12 Й 15/00, 1982.

2, ), Bacter, 1987, 169, рр, 272-277.

3. Авторское свидетельство СССР

N. 1510361, кл. С 12 Н 15/00, 1987. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОМОТОРА И

СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВЕКТОРА

ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ (57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Сущность изобретения заключается в том, что предлоИзобретение относится к новым векторам экспрессии, несущим новый тип промотров, которые конструируются из

Р2-промотора оперона рибосомальной РНК (ггп В-оперона) Escherlchla coll и нескольких регуляторных последовательностей из lacоперона Е, соП. Кроме того, настоящее изобретение относится к методу конструирования вышеупомянутых новых промоторов и новых векторов экспресии.

1836424 АЗ жен способ получения нового типа промоторов для эспрессии чужеродного гена, которые конструируются из промотора Р оперона рибосомальной РНК Е.соП и нескольких регуляторных последовательностей, происходящих от lac-оперона Е, coll.

Сущность изобретения заключается также в том, что осуществляют делецию большей части оперона рибосомольной РНК Е, coll, встроенного в соответствующий вектор, соединяют вместе оставшуюся часть rrn-оперона, содержащего промотор Р2. с начальной частью lac-оперона вне областей

"-35" и "-10" и ниже их, с тем, чтобы в точке соединения последовательностей создать новый сайт расщепления эндонуклеазы Nsl, Затем осуществляют делецию внутреннего элемента последовательности ТОСА из вновь созданного Мэ1-сайта расщепления и встраивают экспрессируемый структурный ген между указанными вновь созданными регуляторными последовательностями. 2 с.и. ф-л ы, 10 ил.

Гены любого происхождения, несущие любой тип информации, могут быть введены в бактериальные клетки путем ДНК-рекомбинации!и vitro, т.е. методом хорошо известным специалистам. Устойчивое сохранение чужой ДНК и экспрессия информации, которую она кодирует, могут быть осуществлены при помощи подходящих молекул носителя, т.е, векторов экспрессии, При экспрессии гена, кодирующего белок, в

1836424 бактериальных клетках ферменты бактерии сначала синтезируют копию мРНК на матрице ДН К в процессе транскрипции,.а затем полипептидную цепь с использованием информации, закодированной в НРК-информации во время процесса трансляции.

Инициация транскрипции происходит в области Д Н К, называемой и ромото ром. P HKполимераза узнает эту область и связывается с ней перед началом транскрипции. Методы ДНК-рекомбинации ln

vitro являются практически экономичными для получения белков, олько если эти белки продуцируются в относительно больших количествах, то есть и транскрипция и трансляция являются эффективными. Поэтому очень важно, чтобы промоторы были "сильными" (кроме других необходимых признаков), то есть, они должны обеспечивать высокий уровень транскрипции.

Путем использования многих аидов промоторов, например, lас, trp, Ыа, Ilp лямбда Р -промоторы можно конструировать различные векторы экспрессии, На практике чаще всего используется lac-оперон вследствие его хорошей регуляторной функции, хотя он является относительно слабым промотором. Так называемые гибридные промоторы различного происхождения описаны, например, в Европейской патентной заявке N. 82302532 (номер публикации — 0067540). Эти промоторы OTличаются тем, что их так называемые -35 и

-10 области(которые являются самыми важными областями промотора) являются различного происхождения, то есть, две части промотора различного происхождения соединены вместе в области, находящейся между -35 и -10-областями. Согласно вышеупомянутой патентной заявке, векторы экспрессии, сконструированные с использованием таких гибридных промоторов, являются ценными дпя промышленных целей, так как их функция является хорошо регулируемой и в то же время обеспечивает возможность эффективной транскрипции

Целью настоящего изобретения является построение векторов экспрессии, несущих бол ее сил ьн ые и ромоторы (для получения высокого выхода белка), которые являются в то же время хорошо регулируемыми, B начале работы над настоящим изобретением заявители использовали векторы экспрессии, описанные .в работе:

Lukaesovlch et al, "Новые регуляторные свойства промоторов гена рРНК Escherlchia соИ" (Nevv regulatory features of the

promoters of an Escherichia coll rRNA gene) (J. Balt. 169, 272-277). Лучшими из указанных векторов являются векторы, несущие промоторы со следующими свойствами: — они сконструированы из части, происходящей от Р2-промотора рибосомального оперона (rrn В) Е.соИ. и части, происходящей от регуляторных последовательностей 0 ! ас-оперона Е. coll — две части, происходящие от rrn В и

lac-оперонов соединяются вместе ниже области -10; — обе области -35 и -10 происходят от rrn

В-оперона, в то время, как CG — богатый участок, ниже -10-области e rrn В Рр заменяется аналогичными последовательностями, происходящими из 1ас-оперона, которые не проявляют репрессорного дей20 ствия, так, чтобы он не влиял на сильное функционирование других частей промотора, Хотя эти промоторы конструировались путем комбинации различных частей двух различных промоторов, однако, их нельзя классифицировать как гибридные промоторы, так как наиболее важные для фкункционирования области, то есть, области -35 и

-10 происходят от одного и того же промо30 тора, ггп В Р . Заявителями было обнаружено, что ати промоторы обеспечивают очень хорошую экспрессию. При дальшейших исследованиях было обнаружено, что удаление четырех пар оснований: TGCA ниже .

35 области -10 в векторах, несущих описанные выше промоторы, вдвое повышают интенсивность транскрипции.

Указанное открытие является неожиданным по нескольким причинам, С одной

40 стороны, в специальной литературе нет никаких намеков на то, что вышеупомянутые четыре пары оснований играют какую-либо роль в определении сиды промотора, и с другой стороны, удваивание интенсивности.

45 транскрипции является весьма значительным результатом в случае промоторов, которые изначально являются очень сильными, На основании вышесказанного, постоящее изобретение относится к промоторам, 50 которые конструируются из Рр-промотора рибосомального оперона rrn В Е. coll и из нескольких регуляторных последовательностей or lac-оперона E. соП, где укаэанные

5 две части различного происхождения соединяются вместе ниже области -10 промотора, а последовательность TGCA удаляется непосредственно за областью -l0.

Кроме того, настоящее изобретение относится ко всем векторам экспрессии, со1836424 держащим вышеупомянутые промоторы; клеткам-хозяевам Е. ooli, трансформированным указанными векторами. и способам конструирования указанных промоторов и векторов экспрессии.

Основные признаки векторов экспрессии настоящего изобретения и основные характеристики генной экспрессии, обуславливаемой укаэанными векторами, могут быть сформулированы следующим образом:

1. Промотор нового типа (обозначенный: 6/23 -Nslj), который является основным отличительным признаком вышеупомянутых векторов экспрессии, осуществляют инициацию транскрипции с высокой и постоянной интенсивностью независимо от физиологического состояния клетки-хозяина, — что составляет свыше 90 от всего

РНК-синтеза клетки-хозяина, и — a соответствии с этим, накапливание чужеродного генного продукта составляет вплоть до 30 — 80 от общего количества клеточного белка.

2, Терминация транскрипции происходит на двойном терминаторном участке. происходящим из rrn В-оперона, 3. Продуктом транскрипции является гибридная молекула мРНК, которая также содержит рРНК-сегмент, происходящий из

rrn В-оперона (помимо чужеродной кодирующей области), при этом стабильность переданной информации — выше, а полупериод жизни указанной мРНК-молекулы — более продолжительный, чем средний полупериод жизни мРНК.

4. Интенсивность транскрипции может регулироваться посредством встраивания

lac-операторной области.

5. С помощью нескольких членов указанного семейства новых векторов синтезируют чужеродный генный продукт в виде белка слияния. С одной стороны, это обеспечивает большую стабильность генного продукта и с другой стороны, позволяет обнаружить присутствие генного продукта и легко измерить уровень экспрессии гена с помощью партнера слияния (альфа-пептид бета-галактозидазы), Чужеродный ген может быть также встроен в указанные векторы ниже 1ас 2 не в форме белка слияния.

Этот тип конструкции функционирует подобно бактериальному оперону и чужеродный генный продукт синтезируется как отдельный белок. В этом типе конструкции чужеродный ген может также содержать сайт связывания рибосомы Е. соИ. У других членов этого семейства векторов чужеродный ген может встраиваться со своим началом, т.е, положением начала трансляции с оптимальным расположением в конструкции в

5 сайте связывания рибосомы. В этом типе конструкции собственный ATG-кодон чужеродного гена обеспечивает правильную инициацию трансляции. Если встроенный чужеродный ген не имеет укаэанного ATGкодона в начале, его можно соединить с синтетическим С!а I-линкером, имеющим в себе ATG-элемент последовательности. Чужеродные гены, имеющие собственные сайты связывания рибосом могут также встраиваться в указанные векторы с помощью других сайтов распознавания для рестриктирующих эндонуклеаз.

6. При конструировании промоторов нового типа, функционирующих в векторах настоящего изобретения, удаляют расположенную ниже регуляторную область рибосомального промотора. Таким образом, характеристическии контроль фуйцции рибосомального промотора, которая является весьма восприимчивой к физиологическим условиям, устраняется и указанный промотор может функционировать в высокой степени независимо от физиологических условий.

7. Транскрипция начинается у цитозинового основания в исходном рибосомальном опероне. Заменив это основание на аденин или гуанин, можно значительно уве35 личить активность транскрипции промотора.

8. Регуляторные области lac-оперона соединяли вместе с указанными промоторами, Такое построение не влияет на максималь40 ную интенсивность при индуцированных условиях, но при этом позволяет регулировать функцию промотора аналогично lac-оперону; а это препятствует слишком высокому постоянному уровню транскрипции и транс45 ляции, который может оказывать неблагоприятное воздействие на метаболизм клетки-хозяина, 9. Предпочтительными вектооами экспрессии настоящего изобретения являются описанные ниже векторы, которые отличаются тем, что они имеют: размер 2800 — 4500 основных пар; ген устойчивости к ампициллину; оптимизированное расстояние между сигналами транскрипции и трансляции; известную пол ную ДН К-посл едо вател ь ность;

CoI El репликативного типа; число копий

20-30 на клетку(хотя были построены также варианты с высоким числом копий, в соответствии с патентной заявкой Венгрии, опубликованной под номером Т/35280): не1836424 сколько различных сайтов распознавания рестриктирующих эндонуклеаз для встраивания в зкспрессируемый чужеродный ген, причем чужеродный ген может быть встроен при всех трех рамках считывания..

Новые векторы экспрессии, описанные в приведенных ниже примерах, содержат следу ощие сайты распознавания рестриктирующих эндонуклеаэ: например, Pvu li, Hind ill, Са l, EcoR 1, Bam Hl, Bgi II, ХЬа 1, Нра 1.

Способ настоящего изобретения для конструирования указанных векторов экспрессии содер>кит, в основном, следующие стадии (которые ниже описаны более подробно):

1. Клонирование rrn В-оперона E. co!i в векторе рВР322.

2, Стабильное субклонирование промоторов указанного опе рона в плазмидах, удаление основной части структурного гена; помещение областей начала транскрипции (промотор) и завершения транскрипции (терминатор) на близком расстоянии друг от друга, 3. Присоединение начальной части lacоперона к укороченному rrn В-оперону.

4, Конструирование промотора 6/23 с соответствующими областями регулирования. В результате модификации такого промотора получают промотор 6/23 (-Nsij

5. Введение различных сайтов рестрикции в соответствующую часть вектора, что дает возможность встраивания чужеродного гена. Разработка других конструкций векторов зкпрессии.

Пример 1, Конструирование нового семейства векторов экспрессии настоящего изобретения.

1. Выделение полной ДНК из E. coll или трансдукция бактериофаговой ДНК E. coll, несущей оперон ггл В. которая может служить в качестве исходного материала при выделении рибосомального оперона rrn В из клетки Е. coll. Оперон rrn В выделяли согласно методу Kiss, А et а!. (Gene 4, (1 978), 137 — 152), начиная с трансдукции ДНК фага

rif d16, или согласно способу Вогое Т. et al., (Nuel-АсЫ Res. 6, (1979), 1617-1830) с использованием получения хромосомной

ДНК. В первой стадии конструирования вектора экспрессии настоящего изобретения строили плазмиду рВВ9 (MNG 00300), изображенную на Рис, 1. Эта плазмида была построена путем разрезания плаэмиды вектора рВР322 (MNC-00298) (Sateiiffe, J.С„

Cold Spring Harbor Symp. Quano. Biol 43, (1978), 77-90) в единичном сайте рестрик35

55 двухнитевых линейных ДНК-молекул. Полученный в результате образец ДНК, содержащий линейные ДНК-молекулы, происходящие от рВВ9 и укороченные до различной протяженности при помощи BAL

31-энзонуклеазы, лигировали с помощью полинуклеотидной лигазы Т4 в реакционной смеси. которая является оптимальной для тупо-конечного лигирования и циркуляризации, и клеткия Е. coll Н В101 трансформировали смесью лигирования. Единичные колонии трансформантов выделяли, и из них получали плазмидную ДНК. В выделенных плазмидных препаратах определяли длину делений посредством переваривания рестриктирующей эндонуклеазой и гельэлектрофореза. Затем отбирали плазмиды с различными делетированными rrn В-оперонами, в которых синтезированные более короткие РНК-молекулы все ще имеют 5 - и

3 -концы, характерные для зрелых рРНК-молекул, с тем, чтобы получить делвтированные rrn В-опероны, еще продуцирующие рРН К-подобные молекулы, которые участвуют в нормальном катаболическом пути обмена для рР.НК-молекул. Эти плазмиды обозначили рВВ9 Л, а одной иэ них является рВВ9 Л9 (Рис, 2). На основании анализа ции Bam Hl и легирования с 7.5 кв Bam

Hl-Bam Hl-фрагмента ДНК rif 18. Эта .7,5 кв-вставка в полученной рекомбинантной ,плазмиде содер>кит полный rrn В-оперон, несколько дополнительных последовательнйТей. происходящих от Е. coll и элемент последовательности длиной приблизительно 400 п,о., происходящей от лямбда-фага.

В регуляторной области rrn В-оперона име"0 ются два промотора; Р1 и Р2, расположенные на 180 и 300 п.о., ниже 16S рРНК-гена. соответственно, (Csordas Toth Е. et al, Nuel.

Acid. Res, 7, 1979, 1335 — 1342).

2. Рекомбинантные плазмиды, содержащие rrn В-оперон или область его промотора, вследствие своих сильных рибосомальных промоторов, инициируют крайне высокий уровень транскрипции, что перегружает механизм транскрипции клетки-хозяина и приводит к нестабильности при хранении плазмиды. Для устранения этого недостатка in vitro делетировали все части рВР9-плазмиды, которые не являются важными для дальнейших стадий конструирования. В этой стадии сначала расщепляли

ДН К р В В9 Н ра1-рестри ктирую щей эндонуклеазой и обрабатывали полученную линейную молекулу BAL 31 — энзонуклеаэой в

30 течение разных периодов времени. Фермент постепенно укорачивал оба конца

1836424

Была осуществлена также третья делеция в целях удаления области, расположен- по ной выше области промотора rrn В-оперона. Iac

Для этого плэзмиду р889 Ь 28 переварива- хо

ДН К-последовательности, делетированный ггп В-оперон указанной плазмиды содержит первые 269 п.о. зрелой 16 S рРНК-молекулы и полный ген 5 S pPHK e конце оперона.

Нуклеотидная последовательность в окрестности двух конечных точек делеции, расположенных в первой части гена 16 S pPHK и рядом с концом гена 23 S рРНК, соответственно, представлена на Рис. 3.

В следующей стадии создавали дополнительные делеции в плаэмиде с целью получения делетировэнного rrn В-оперона в как можно меньшей плазмиде, Плазмиду р889

9 линеаризовали путем расщепления ее в единичном сайте Sal I рестиктирующей эндонуклеаэы, который происходит от рВР322-вектора (В ггп В-опероне имеются два Sall-сайта расщепления, но они были делетированы в предыдущей стадии). Затем полученную линейную ДНК-молекулу переваривали BAL 31 — энзонуклеазой для получения сокращения приблизительно длиной

1600 п.о.; расстояние между единичным $а1

1-сайтом и концом делетированного rrn Воперона составляет около 800 п.о. в плазмиде рВВ9 Л 9. С целью удлинения полученной делеции в направлении, противоположном rrn В-оперону, и удаления более несущественных частей векторной ДНК, перед циркуляризацией переваривали также укороченные линейные ДНК-молекулы с помощью Pvu il-рестриктирующей энзонуклеазы. Этот фермент, разрезая ДНК, создает тупые концы, так,что оба конца линейных

ДНК-молекул, один из которых образован

Pvu ll, и другой BAL 31-перевариванием, могут быть соединены вместе без дополнительной модификации. ДНК-лигирование, трансформация и выделение колоний путем физического картирования проводили так, как было описано выше. Для дальнейшей работы по конструированию была выбрана плаэмида р889 b 28 (Рис, 4), в которой делеция, осуществленная путем Sal I ÂAL31—

Pvu И-переваривания, составляла 2174 п.о.

Одна конечная точная этой делеции располагается на 510 п.о. ниже конца зрелой 5 S

PHK-последовательности, а другой конечной точкой является сайт расщепления Pvu

ll вектора pBR322, т.е. 2067 п.о, в соответствии с нумерацией pBR322, Нуклеотидная последовательность окрестностей двух конечных точек делеции представлена на Рис.

5

55 ли EcoRI- u Fspll-рестриктирующими эндонуклеазами, обе из которых имели один сайт распознавания, расположенной выше 16 S

РНК-гена rrn В-оперонэ и выделяли вектор и фрагмент, содержащий большую часть делетировэнного ггп В-оперона, Липкие концы выделенных EcoRI — Fspll-фрагментов обрабатывали фрагментом Кленова ДНКполимеразы I и замыкали их путем лигирования с помощью полинуклеотидлигазы Т4.

При соединении обработанных концов вместе, обе последовательности распознавания RcoRI- u Fspli-рестриктирующих эндонуклеаз реконструировали:

GAATTCGA

СТТААСБТТ таким образом, полученная плазмида (р

408-5, IVING — 00301) может быть линеаризована обоими ферментами (Рис. 5), В следующей стадии линеаризовали плазмиду p408 — 5 путем расщепления Fspiiферментом, сайт распознавания которого расположен на 100 п,о. выше Прибнов-бокса промотора Р1 и создавали серии делеций, распространяющихся до промотора Р2, с помощью ограниченного BAL 31-переваривания (Рис. 5), После лигирования и трансформации определяли конечные точки делеций s выделенной плазмидной ДНК путем рестриктирующего картирования с помощью BSpRI, Mspl u Hhal-рестриктирующих эндонуклеаз и при помощи секвенирования

ДНК. В плазмиде р419-10 делеция длиной

197 п.о. удаляла промотор Р1 и оканчивалась у 100 п.о. выше промотора Pz. Эта делеция также удаляла иэ векторной ДНК последовательность длиной 100 п,о., находящуюся вь1ше гена устойчивости к ампициллину, Нуклеотидная последовательность в окрестностях конечных точек делеции показана на Рис, 3.

3, В следующей стадии указанный укороченный оперон rrn В соединяли с началом

lac-оперона. Он был выделен eo Hind EEcoRl-фрагменте из qLBu3-плазмидной

ДНК (Gentz, R., Langer A„Chang А.С.I., Cohen, S.N. ano Bujard, Н., Cloning and

analysis of strougpromotor in и;аде possible

by downstream placement of PNA termination

signal Proc. Natl. Acad. Sci USA 7Д, (1981)

4936 — 40). Изолированный фрагмент содержит следующие части в направлении от

EcoRi к Hind Ш: 160 п,о, ДНК неизвестного происхождения и функции, соединенные с тью, происходящей из lac-оперона и рэсложенной на 4 п.о. выше Прибнов-бокса

-промотора. Эта последняя часть, происдящая от атэс-оперона. содержит часть iac1836424

В одной из полученных плазмид (PER—

Vl/23) последовательность 2 п.о. концов, происходящих от rrn В, расположенных ниже -10-области промотора Р2 и регулятор5 ные области транскрипции и трансляции, происходящие от(ас-оперона (lac-оператор, сайт связывания рибосомы, начальная точка трансляции) соединяли с промотором Рр с тем же расстоянием, как зто имело место

10 для lac-промотора в lac-опероне, Эта конструкция обеспечивает оптимальные условия для трансляции и для регулирования трансляции, так же как в lac-опероне. Эта плазми15 да не содержит элемент С-G-богатой последовательности длиной приблизительно 25 п.о., расположенный ниже области -10 лромотора Pg, и который ингибирует активность промотора в различной степени в зависвимости от физиоло ических условий клетки. Роль этого элемента последовательности в регулировании активности промотора исследовалась в лаборатории (Lut

et al„J, 8 act 169, (1987) 272-277).

Сайт инициации транскрипции этого сконструированного промотора (обозначенного. 6/23) расположен в последовательности, происходящей от tac-оперона и, вероятно, является таким же, как и в lac-one30 роне (GGAATT). Конструкция этого промотора, осуществленное с помощью плазмиды

pER — Vl/23. обеспечивает экспрессию гена а -пептида на порядок выше, чем другие похожие конструкции, где различные части, происходящие от rrn В и tac, соединены вместе в других сайтах. Уровень экспрессии гена а-пептида легко измерить спектрофотометрическими методами с помощью так называемой реакции а-комплементации

40 (Miller: Experiments in rnolecuiar geneticsCold Spring Нагоаг, 1972). Еще одним преимуществом конструкции промотора 6/23 является уникальный сайт расщепления Nsi

I- рестриктирующей эндонуклеазы, образо45 ванный у сайта соединения двух частей различного происхождения, который позволяет упростить дальнейшие альтерации. Одной наиболее ценной из таких альтераций является удаление четырех внутренних нуклео50 тидов сайта расщепления Nsi 1(А TGCA Т); что может быть сделано, например, путем промотора -10 область, полный оператор, сайт инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы, расположенный возле 5 конца мРНК, ATG-кодон начала транскрипции и область, кодирующую первые 70 аминокислот Р -галактозидазы. Этот

N-концевой полипептид (обозначенный апелтидом) не обладает р-галактозидазной активностью, но он мох<ет воспроизводить часть этой активности при взаимодействии с определенным специфическим типом дефективных молекул Р -галактозидазы (а

-акцепторные мутанты), которые сами по себе являются неактивными.

Плазмиду р419 — 10 расщепляли Stn l-рестриктирующей эндонуклеазой между лромОтОрОм Р2 и терминатОрОм Р1 и к тупым концам полученных линейных ДНК-молекул присоединяли синтетический ЕсоИ-линкер, Смесь лигирования: линкер-плазмиды переваривли EcoR t-рестриктирующей эндонуклеазой и снова лигировали в условиях, оптимальных для циркулизации плазмиды.

После трансформации выделяли плазмиду р808-2, которая отличалась от плазмиды р419-10 олько отсутствием сайта расщепfleHNB Stn l рестриктирующей зндонуклеаЗОЙ, который был замещен на EcoRl-caAT расщепления путем введения линкера (Рис, 6). Выделенный Hihd ill EcoRl-фрагмент плазмиды р а Ви 3 лигировали с р808-2плазмидной ДНК, переваренной Hihd iltЕсоВ и клетки Е, coil трансформировали смесью лигирования, Колонии трансформантов выращивали на твердой среде, содержащей окрашенный индикатор, и через

24 — 36 часов наблюдали голубые колонии, цвет которых указывал на низкий уровень а -пептидной экспрессии, Из этих колоний выделяли плазмидну о ДНК и физическое картирование показало, что эти колонии содержат плазмиду рВ27-10 (MNG 00307), созданную посредством соответствующего присоединения указанных двух фрагментов (Рис. 6), 4. В следующей стадии, создавали делеции между промотором Pz rrn В-оперона и начальной точкой трансляции, в целях повышения эффективности трансляции. Плазмиду р827-10 линеаризовали путем обработки ДНК-полимеразой Т4 после расщепления Nsi-эндонуклеазой. ДН К-полимераза Т4 переваривает четыре избыточных нуклеотида Nsi l-расщепленного липкого конца. При лигировании таким образом обработанной лри помощи ДНК-лигазы Т4 плазмидной молекулы получали конЧтрукEcoRi-переваривания, последовательности разной длины (до 400 п,о.), удаляли путем переваривания BAL 31-экзонуклеазой и полученные укороченные ДНК-молекулы снова замыкали посредством ДНК-лигазы, Трансформанты, показывающие интенсивный синий цвет (интенсивный синтез апептида) на индикаторных чашках, были цию промотора, в которой -10-область провыделены.

1836424 мотора Pg остается интактной, тогда как сайт инициации транскрипции смещается вниз на несколько пар оснований, Вследствие не совсем ясных причин, эта альтерация, кроме того. повышает эффективность транскрипции, не изменяя при этом эффек-, тивности трансляции или регуляторных свойств. Эти конструкции плазмиды и промотора обозначали: pER — Vl/23 (-Nsi) и 6/23 (-Nsl), соответственно. На Рис. 7 изображены последовательности промоторов 6/23 и

6/23 (-Nsi). 5, Плазмиды pER — И/23 (-Nsl) u pERVl/23 по большей части отвечают требованиям экспрессии векторов. Однако, их значительным недостатком является ограниченная возможность встраивать чужеродные гены. Это можно сделать лишь при помощи двух уникальных сайтов расщепления рестриктирующих эндонуклеаз: Pvu li u

Hind Ill, расположенных в кодирующей области а -пептида и непосредственно за этой областью, соответственно. С помощью дополнительных преобразований создавали семейство векторов, дающих возможность встраивать чужеродные гены с помощью обычно используемых рестриктирующих эндонуклеаз при всех трех рамках считывания. При конструировании этого семейства векторов, кроме того, руководствовались требованием сделать возможной экспрессию чужеродного гена как Отдельного белка, так и белка слияния, который сплавлен со стабильным белком Е. coll. Этот последний вариант необходим, если полупериод жизни чужеродного экспрессируемого белка в бактериальной клетке очень короткий, например, человеческого проинсулина. В этих случаях N-концевая часть 40 белка слияния, которая происходит от Е.

coli, может защитить нестабильный чужеродный белок от разложения.

Конструкция семейства векторов, отвечающих вышеуказанным требованиям, бы- 45 ла обозначена: рЕР-И/23 (будет описана ниже). После конструирования указанных плазмид типа pER — Vl/23, плаэмиды типа

pER — Vl/23 (-Nsi) строили в соответствии с вышеописанным способом. Во всех случаях 50 при исследованиях было установлено повышение уровня экспрессии гена.

В качестве начальной стадии осуэществлялось клонирование 109 п.о. Hind lii — Hind

Ill-полилинкера, происходящего ото VX-ми- 55 ниплазмиды (Т, Maniatls et al. Motecular

Clonlng А laboratory manual; Cold Spring

Harbor, (1982), р. 353 в обоих направлениях к уникальному Hind Itl-сайту расщепления плаз миды p E R — Vl /23. Помимо двух сайтов расщепления Hind III этот полилинкер содержит Clat, EcoRI, Bam HI, Pst I, Bg ltl u

Xbal-сайты расщепления для рестриктиру щих эндонуклеаз (см. Рис, 8), Полученные плазмиды, которые содержали полилинкер в направлении, показанном на Рис. 8 и в противоположном направлении, соответственно, обозначили; pER È/23 PLH4 и pER

Vl/23 PLH5. В этой плазмидной конструкции и ее производных имеется. по меньшей мере, один сайт расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы во всех трех рамках считывания, расположенный в области полилинкера, что дает возможность встроитьлюбой чужеродный ген, экспрессируемый вместе с а -пептидом в виде белка слияния. Специалистам известно, что различные чужеродные гены могут быть слиты с частями Р-галактозидазы различной длины для обеспечения максимальной защиты.

Поэтому. были сконструированы еще два члена указанного семейства векторов. 733 п.о. Pvu Ii-Cia f-фрагмента (ас Z- ена (ген, кодирующий Р -лагактозидазу в Е. соН) клонировали в Pvu It — С1а I-сайтах плазмиды

pER — Vl/23 PLH4. Этот фрагмент кодировал дополнительные 244 аминокислот j3-галактозидазы. Полученную плазмиду обозначали; pme а/23.

1621 п.о. Pvu Il — EcoRV-фрагмента tazгена лигировали при тупых концах с 150 по

Pvu ll-EcoRl-фрагмента гена, кодирующего хлорамфеникол-ацетил-трансферазу (САТ; происходит от плазмиды рВР329, Gene Q, (1982) 79 — 89), соединяя вместе EcoRV u Pvu

tl-тупые концы. Полученный Pvu ll — EcoRIфрагмент длиной 1771 п.о, (который является ОднОЙ длинной 0TKp6tTQA рамкОЙ считывания) клонировали в Pvu II — EcoRIсайтах плазмиды pER-Vl/23 PLH4. Полученную плазмиду обозначили: pL-альфа lnt/23.

При этом также были сконструированы многокопийи ые версии плазм ид p E R — Vi/23

PLH4, pER — М/23 PLH5 и pL-альфа Int/23 (см. патентную заявку Венгрии N. Т/35280).

При помощи указанных членов семейства векторов, любой чужеродный белок может быть экспрессирован как часть белка слияния, в котором первые 70 (pER-И/23

PLH4, pER Vl/23 PLH5, первые 280 (pme а

/23) или первые 390 (pL-альфа Int/23) аминокислот происходит от Е. coll (P -галактоэидаза, САТ). На Рис, 9 схематически изображены указанные плазмиды.

Вышеупомянутые конструкции векторов также позволяют экспрессировать интактные чужеродные гены в неслитой

1836424 форме. Это может иметь место, если встроить чужеродный ген таким образом, чтобы трансляция, начинающаяся на кодирующей области, происходящей от Е. coll (!ас z или

lac z + CAT), останавливалась непосредственно перед стартовым кодоном экспрессируемого чужеродного гена, и/или если чужеродный ген имеет сильный сайт связывания с рибосомой Е. соП. В атом случае конструкция работает аналогично бактериальному оперону, содержащему два гена.

Однако, в системе. содержащей два гена, часто трудно достичь оптимизации экспресии гена (результат являлся ненадежным), и поэтому были разработаны новые члены вышеупомянутого семейства векторов, которые, в основном, используются в экспрессии интактных генов. Для достижения этой цели, из плазмиды рЕР-VI/23

PLH4 удаляли область, кодирующую й-пеп„ тид, сохраняя при этом регуляторные после довательности, и встраивали соответствующий сайт расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы в плазмиду с оптимальным расстоянием до lac-регуляторных последовательностей. В первой стадии указанного конструирования клонировали небольшой Кз !- АЬ 1 — фрагмент плазмиды pER-Vl/23 PLH4 (см. Рис. 7) в уникальные сайты Nsi 1-Pvu II той же плазмиды, Как показано на Рис. 7, указанный Alu

1-сайт расположен непосредственно выше стартового кодона трансляции, и очевидно также, что, в то же время, левая половина этого Alu I-сайта расщеплсния является половиной Pvu I t-сайта расщепления. Следовательно. если соединение указанных двух фрагментов бь ло осугцествлено правильно, то уникальный Pvu И-сайт расщепления плазмиды рЕН-И/23 PLH4 будет регенерирован. Полученная плазмида была обозначена; pER-Vt/23 (ATG); эта конструкция является подходящей для экспрессии чужеродных генов, имеющих. свой собственный стартовый кодон трансляции ATC.

Этот тип чужеродных генов может быть встроен во вновь созданный Pvu It-сайт расщепления, после затупления концов. Эффективная экспрессия чужеродного гена возможна в том случае, если он имеет не более, чем 8 п.о. (предпочтительно 4 п,o.) выше АТ6-кодона. В этом случае расстояwe между стартовым кодоном трансляции чужеродного гена и сайтом связывания с рибосомой ас-происхождения является оптимальным или близким к нему, Кроме того, для облегчения экспрессии синтетических генов осуществляли дополнительную модификацию плазмиды рЕЯ—

Vl/23 (-ATG). В укаэанный уникальный Pvu

II-сайт расщепления встраивали синтетический Clat-линкер (содержащий Clat-сайт

5 расщепления). Фрагмент между вновь созданным Clat — сайтом с Clat-сайтом в области полилинкера плазмиды удаляли. Это было осуществлено путем рециркуляризации большего фрагмента после расщепления плазмиды рестриктирующей эндонуклеазой Ctat, Полученную в результате плазмиду обозначали: pER — И/23 (+ATG). Эта плазмида является исключительно ценной для экспрессии чужеродного гена, не имеющего стартовый кодон трансляции ATG (в основном для синтетических генов). Любой чужеродный reH, подобный этому, может быть встроен в Clat-сайт указанной плазмиды, после присоединения линкеров Clat к его концам. В этом случае если ориентация вставки была правильной трансляции чужеродного гена будет начинаться в ATG-последовательности Clat-линкера, Расстояние между этим ATG-кодоном и Iac-происходящим сайтом связывания с рибосомой составляло 8 п.о., что является оптимальной в Е. соИ. Указанный вектор, конечно, является весьма ценным для экспрессии чужеродных генов, имеющих свой собственный сайт связывания с рибосомой.

Клонирование таких генов легко осуществить при помощи сайтов расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы, располо35 женных в обл.сти полилинкера плазмиды (Clat, EcoRt, BamHI, Pst I, Bg Ш, Xba I, Hind

И!). Яа Рис. 10 схематически изображены плазмиды pER-Vt/23 (-ATG) и pER — Vl/23 (+Ата), 40 Как указывалось выше, удаляя внутренние 4 п.о. уникального Nsi i-сайта расщепления из каждой из описанных выше плазмид, можно получить в соответствии с вышеописанной процедурой семейство век45 торов pER — Ч1/23 (-Nsi), В нижеследующей части описания настоящего изобретения приводятся примеры использования некоторых членов семейства векторов pER — И/23 (-Nslj.

Пример 2, Осуществление эффективной экспрессии генов при помощи векторов, полученных в настоящем изобретении.

В целях иллюстрации того, что с помощью векторов экспрессии настоящего

55 изобретения можно действительно осуществлять более эффективную экспрессию генов, чем с помощью известных векторов, проводили следующие сравнительные эксперименты.

1836424 ный белок аккумулировался в бактериальных клетках в количестве до 20 — 60 g от полного клеточного белка.

Пример 4. Для иллюстрации исполь5 зования семейства новых векторов настоящего изобретения в общих чертах и для экспрессии низко и высокомолекулярного белка экспрессиЯ высокомолекулярного белка обычно является проблематичной в Е, coll проводили следующий эксперимент:

1. С!а1 — Pstl-фрагмент клонированного ас-оперона Е. coli встраивали в Clai — Pstlсайт плазмиды PL-альфа Int/23 (-Nsi) (при15 меняя частичное Pst 1-переваривание, расщепляли только один Pst 1-сайт), Таким образом, была встроена полная кодирующая последовательность гена iac z, Продукт

lac г-гена (фермент Р-галактозидаза), являются одним из самых крупных белков (мол. масса; 135000). В соответствующем штамме хозяина, после индуцирования с помощью ! РТ6, можно производить этот фермент в значительной степени (до 15 — 30-",ь от общего клеточного белка) в ферментно-активной форме, 2. Векторы экспрессии настоящего изобретения могут также действовать как бактериальный оперон, содержащий два гена.

Испытания этих функций векторов проводили с использованием двух различных чужеродных генов бактериального происхождения, Первым таким геном являлся вышеупомянутый ген хлорамфениколацетил-трансферазы, который был выделен из плазмиды рВР329.

Tag l-фрагмент, выделенный иэ рВР329. клонировали в Cta l-сайт плазмиды pER—

И/23 (-Nsi) PLH4. В этом конструировании .

40 CAT-ген экспрессировался из промотора б/23 (-Nsi), с использованием его собственного сайта связывания с рибосомой. Процесс транляции проходил на одной длинной мРНК-молекуле. которая является общей

45 для а-пептида и САТ-генов. После проведения электрофореза в ПААГ полного клеточного белка индуцированных клеток было выяснено, что две самые сильные полосы относились к а -пептиду и САЧ-белку. Кон50 струкцию плазмиды также модифицировали в плазмиду, экспрессирующую