Способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка тоlyросlаdiuм vаriuм

Способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов и штамм грибка тоlyросlаdiuм vаriuм

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: фармацевтическая и микробиологическая промышленность. Сущность способа: заключается в том, что грибок Tolypoctadlum varium NCAIM/P/F 001005 культивируют в аэробных условиях при t 25-30°C в питательной среде, содержащей в качестве источника азота пептон, сульфат аммония, трипказин, а в качестве источника углерода - глюкозу, мальтозу, сорбит. 2 с.п. ф-лы и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

cs»s С 12 Р 1/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (l OCllATf HT СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

С ф

Ql (21) 4742791/013 (22) 19.12.89

{31) 6497/88 (32) 20. 12.88 (33) HU (46) 23.08.93. Бюл. %131

{71) Биогал Дьедьсердьяр (НО) (72) Антониа Йеккель, Габор Амбруш, Ева

Тот, Иштван Михай, Агота Хюльбер, Аттила

Андор, Карой Альбрехт. Кальман Концоеп, Валериа Сеял, Ева Томори, Имре Моравчик, Кальман Полиа, Янош Эрдеи, Лайош Кишш, Карой Надь, Бела Палоташ, Этелка Дели, Карой Бузаши, Анико Молнар., Дьердь Шанта и Вилма Сасхедьеши (HU)

Изобретение относится к способу получения комплексного антибиотика циклоспорина и/ипи -его компонентов циклоспорина А, циклоспорина В и циклоспорина С, азробной ферментацией.

Отдельные компоненты комплекса представляют состоящие из 11 аминокислот циклические, нейтральные, неполярные олигопептиды, которые отличаются друг от друга только одной или двумя участвующими в построении аминокислотами.

Из компонентов комплексного антибиотика циклоспорин А и циклоспорин С были выделены сначала А. Ruegger и др. и циклоспорины В, О, Е и С R. Traber и др. из культуры идентифицированного ими раньше как Triehoderma polysporum (Link ех

Pers.) Rifae грибка {NRRL 8044). Позднее была уточнена систематическая классифика„„Я „„1836425 АЗ

{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО АНТИБИОТИКА ЦИКЛОСПОРИНА

И/ИЛИ ЕГО КОМПОНЕНТОВ И ШТАММ

ГРИБКА T0LYPOCLA0lUM VARIUM (57) Использование:. фармацевтическая и микробиологическая промышленность.

Сущность способа: заключается в том, что грибок Tolypocladium varlum NCAlM/P/F

001005 культивируют в азробных условиях при т = 25-ЗООС в питательной среде, содержащей в качестве источника азота пептон, сульфат аммония, трипказин, à в качестве источника углерода — глюкозу, мальтозу, сорбит. 2 с.п. ф-лы и 1 э,п. ф-лы, 1 табл. ция соответствующего штамма грибка (NRRl 8044), и с тех пор он был назван в литературе как Tolypocladlum inflatum

Gams.

В настоящее время известны уже 25 циклоспоринов, которые обозначаются буквами от А до 2.

Из компонентов, самым ценным по действию является имеющий избирательную иммуноподавляющую активность циклоспорина А.

Циклоспорин был известен сначала как антибиотик со слабым противогрибковым действием, его значительное иммуноподавпяющее действие было открыто лишь позднее.

При помощи целой серии опытов на живом организме и в пробирке можно было доказать, что циклоспорины А, С и G явля1836425 ются более специфическими активными веществами, чем известные до сих пор иммуноподавляющие лекарственные средства.

Оказалось, что циклоспорин А подавляет как гуморальный, так и целлюлярный иммунный ответ. При исследовании механизма действия было установлено, что он подавляет пролиферацию Т-клеток и прерывает синтез интерлейкина-2.

О применении циклоспорина А в качестве лекарственного сг!едства при пересадке органов у человека сообщали в 1978, Первое применение было описано в связи с пересадкой почки и трансплантацией костного мозга, Применением циклоспорина А при пересадке органов можно препятствовать отторжению органа (почка, поджелудочная железа, печень, сердце, легкое), при трансплантациях костного мозга отторжению костного мозга.

Циклоспорин А с успехом применяли так 1ке для лечения определенных аутоиммунных заболеваний (например, воспаление сосудистого тракта глаза, ревматический артрит, чешуйчатый лишай и тяжелая миастения).

По латентной литературе для получения содержащих комплексный циклоспорин ферментационных бульонов применяли до сих пор культуры следующих штаммов микроорганизмов, Су!!пс!осагроп luctdum

Boath, йй!1! 5760 (патент Швейцарии М 589

716), Tolypocladlurn inf latum Gams. ИВ%

8044 (по более старой номенклатуре:

Trtchoderma polysporivm (Link ех Pers) Rifai, патент Швейцарии йг 603790) по Bissett (1983) Totynfeatum!N, Gams, 1971 является синониумом с Tolyniveum (Rostrup) Bisset соотв, nov. u Fusarium зо!ап!, МС!-1549, MlC-1550 (опубликованная заявка íà патент Японии N 82 63093). Однако промышленное использование этих штаммов микроорганизмов в способах ферментации имеет тот недостаток, что времена ферментации продолжительные (11-14 дней), получают мало комплексного циклоспорина (около.20-30 р.r/ìë) и коэффициент полезного действия выделения комплекса из ферментационного бульона низкий (около 40 ).

В ходе исследований искали штаммы микроорганизмов, при помощи которых можно получать комплексный антибиотик циклоспорин или его компоненты в высокой концентрации и при более выгодных условиях, чем до сих пор. В процессе серийных исследований, которые распространялись на много тысяч штаммов грибка, смогли выбрать принадлежащий к виду То!урос!айиа микроорганизм, который за более короткое

55 время и в более значительном количестве биосинтезирует комплексный циклоспорин, чем известные штаммы, и который, как показали таксономические исследования, не идентичен ни с одним из известных продуцирующих циклоспорин штаммов грибка, Новый штамм (СУ/93) — который по собственным исследованиям следует рассматривать как член нового отличительного таксона рода Tolypocladium — был описан под названием Toiypocladtum var!urn

spectes nova как голотипный штамм.

Изобретение основывается, следовательно, на том открытии, что в результате ферментации неизвестного до сих пор штамма типа Tolypocladium var!urn species

nova (домашнее название; СУ/93), который был депонирован под номером NCAtM(P)F

001005 в Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов, можно получать ферментационный бульон с очень высокой концентрацией циклоспорина.

Ферментационный бульон наряду с основным продуктом циклоспорина А содержит в небольших количествах циклоспорин В и циклоспорин С.

Используемыедля систематизации признаки выделенного нового штамма грибка сравнивают ниже с важнейшими из диагностических характеристик известных видов

Toiypoc tadium.

Род Totypocladium был описан в 1971 бааз как новый вид населяющих почву

MonilaIes, Его характерными свойствами являются: медленный рост, полушкообразные белые или беловатые бактериальные колонии, конечные и боковые, расположенные частично на коротких боковых ветвях фиалиды с сильно разбухшим основанием, на котором можно различить нитевидную, часто дугообразно наклоненную шейку, которая оканчивается маленькой одноклеточной конидией (головкой). Внутри этого рода Gams различал 3 следующих новых вида; Т.

geodes, T. cylindrosporurn, Т. inftatum имеет поразительный, лапоминающий об актиномицетах запах земли, который полностью отсутствует у нового T,var!urn sp. nov, СУ/93. Кроме того, клетки носителя Т.

geodes значаительно уже, чем клетки носителя Т, var!urn sp, nov, СУ/93. Конидии Т. су!!пбгозрогов характерно длинные и растянутые, конидии Т. var!urn sp. пок СУ/93, напротив, шаровидные или слабо растянутые. Конидии Т, inflatum эллиптические и длиннее, чем конидии Т. var!urn sp, nov.

1836425

СУ/93. Фиэлиды T. Inflatum расположены или непосредственно на гифе или не клетках держателя длиной 2 — 3 м клубком.

Для фиалидов Т. varium sp. поч. СУ/93 расположение клубком не является характерным и наблюдается только в отдельных случаях, Бактериальные колонии всех известных до сих пор видов Tolypocladium белые, что объясняется, в первую очередь, белым; ватообразным воздушным мицелием. Нижняя сторона бактериальных колоний желтовато-серая. бесцветная или желтая, характерный растворимый пигмент не производится. И в этом отношении Т, varlum sp. nov, СУ/93 отличается от известных видов: на питательных средах с глюкозой и пептоном, также на питательных средах с солодовым экстрактом/дрожжевым экстрактом грибок вырабатывает темный, варьируемый во времени от густого серого до черного цвета. пигмент.

Диагностические признаки Tolypocladlum

varlum sp. nov. СУ/93 можно сообщить следующим образом. Бактериальные колонии возрастом 10 дней имеют диаметр 10 — 25 мм, их поверхность покрыта ватообразным белым, насыщенным спорами воздушным мицелием.

Нижняя сторона бактериальных колоний желтовато-серая или грязно-серая, На многих комплексных питательных средах образуется темно-серый растворимый пигмент. На гифах воздушного мицелия спорообразование протекает как конечное, так и боковое.

Фиалиды расположены местами или иногда также пучком на гифах или на коротких (длиной 2 — З,и м) клетках держателя. Фиалиды состоят из разбухшей основной части (2 — 4 х х2 — 3 р м) и длиной нитевидной шейки (3-4 х 0,5 — 0,6 р м). Колонии головок небольшие (2-3 х 1,3 — 2,2 р м), в общем, шаровидные и ровные. Видовое определение "Varlun" относится к изменчивости фиалидов . Tol.

varium проявляет в своем жизненном цикле определенную схожесть с Genus

harposporlum, о чем позже еще будет говориться. Штамм CY/93 не использует рафинозу, однако хорошо растет в присутствии источников углерода: Маннит, инозит, сахароза, фруктоза, рамноза, галактоза, глюкоза, арабиноза и ксилоза. На питательном агаре и солодовом агаре его культуры развиваются слабо, на соевом агаре, агаре С арех и картофельном агаре они растут усиленно. Овсяно-дрожжевой экстракт, глюкозо-дрожжевой экстракт и овсяный агар не слишком подходит для сохранения.

Tol. varium резко отличается от Tol.

Trogonosporum так как последний продуцирует Trlgonale conidia, который имеет слабо изогнутые края, Tol. varlum отличается также от Tol, baIanoldes, так как последний продуцирует боковые фиамиды.

Кроме того, отличается голотипный штамм (СУ/93) Tolypocladlum varlum n. sp. от зарегистрированного тикового штамма (C8S 714.70) Т. Inflatum также тем, что последний образует на солодовом агаре обильный белый воздушный мицеллий, в противоположность этому Т. varlum sp. nov.

СУ/93 не образует никакого мицелия. Тиковый штамм Т. Inflatum производит в суб15 страте мицеллия на железо-пептоновом агаре красновато-коричневый конечный пигмент.

В противоположность этому мицеллийсубстрат Т. varium sp. поч. СУ/93 остается бледножелтым, Т., varlum sp. поч, СУ/93 не перерабатывает араблюзу, в противоположность Т, inflatum.

Т. Inflatum дает с нитритом натрия обильный мицеллий, в противоположность этому Т. varium sp. nov. СУ/93 едва растет, Сравнение с зарегистрированными штаммами других видов Tolypocladluma, а

30 также со штаммами Trlchoderrna polysporum

АТСС 16641 и Culindrocarpon lucidum ИВК1

5760 приведено в таблице

Предметом изобретения является способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов: циклоспорина А, циклоспорина В и циклоспорина С культивированием биосинтезирующего названные антибиотики штамма грибка в со40 держащей усваиваемые источники углерода и азота и минеральные соли питательной среде, при аэробных условиях, и отделением образованных продуктов, Для способа отли.чительной чертой является то, что продуци45 рующий комплексный антибиотик циклоспорин штамм нового вида грибка

Tolypocladium varIum, предпочтительно депонированный под номером NCAIM(P)F

001005 в Будапештском Университете садоводства и пищевой промышленности в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов штамм

TolypoctadIum varium sp. поч, СУ/93, культивируют в содержащей источники углерода, а

55 также органические и неорганические источники азота и минеральные соли питательной среде, при аэробных условиях, при температуре 25 — 30 С, в случае необходимости выделяют образованный комплексный антибиотик или его компоненты из фермен001005 В Будапештском Университете садоводства и пищевол промышленности в Национальном собрании сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов Штамма

Toiypocladium аг(игл зр. пок СУ/93 делают посев культуры на косом агаре, суспензией спор и суспензией мицелия которого прививают питательную среду инокулята, затем добавляют культуру инокулята возрастом 3 дня к приблизительно десятикратному количеству среды продуцирования и инкуби40 руют среду продуцирования при 25-30 С, предпочтительно 25 С, в течение 5-7 дней, Во время ферментации поддерживают величину рН между 6,0 и 2,5, предпочтительно при 5,2, Ферментация происходит при азробных условиях и при интенсивном перемешивании (950-1000 мин ). Потребность культуры в воздухе составляет около

300 л/час.

Во время ферментации за содержанием активного вещества в ферментационном бульоне наблюдают путем микробиологического измерения величин и путем жидкостной хроматографии при высоком давлении (Н LC). Когда содержание активного вещества достигло своего максимума, ферментацию прекращают и антибиотик выделяют методами зкстракции и/или адсорбции. тационного бульона и в случае необходимости очищают.

По изобретению для получения комплексного антибиотика циклоспорина применяют предпочтительна культуру нового 5 штамма Tolypocladlum varlun -зр.-печ;—

СУ/93, Этот штамм вследствие свое о быстрого роста является особенно выгодным.

Сахарозу, глюкозу,,сорбозу, мальтоэу, фруктозу, крахмал, глицерин и различные жиры и масла он хорошо использует как источник углерода. В качестве источников азота принимают в расчет различные органические и неорганические источники азота, например, воду набухания кукурузы, пептон, 15 дрожжевой экстракт, мясной экстракт, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и различные аминокислоты. Кроме этих источников углерода и азота питательная среда может содержать еще минеральные оли (например, хлористый калий, сульфат агния или кислыл фосфорнокислый калий), микроэлементы (например, медь, марганец и железо), а также витамины и пеногасящие вещества.

По предпочтительному варианту осуществления способа по изобретению от депонированного под номером NCAlM(P)F

Для микробиологического измерения величин используют оказанное циклоспорином А на многие гифомицеты избирательное торможение роста. В качестве тест-организмов наиболее подходящим являются

Aspergillus nigor, Aspergliius japanicus u

Curvularla lunata. Для анализа жидкостной хроматографией при высоком давлении (HPLC) ферментационного бульона применяют фильтрат разбавленных в отношении

1:10 метанолом проб (аппарат: КВ, модель насоса 2150, модель ультрафиолетового детектора 2151; измерение при 220 нм; колонка BST — 10C-Са, 7,и м; высота колонки 25 см, внутренний диаметр 0,4 см; жидкий элюент: ацетонитрил и триэтиламин фосфорной кислоты (рН 6;8) в отношении 65:35).

Э кспериментальные опыты показали, что новый штамм Tolypocladium varium sp.

nov. СУ/93 дает с очень высоким выходом (950,и г/мл) комплексный антибиотик, содержащий в качестве основного продукта циклоспарин А и наряду с ним в качестве небольших компонентов циклоспорин В и циклоспорин С.

Выделение комплексного циклоспорина из ферментационного бульона целесообразно проводить экстракцией. Выгодно перед экстракцией удалять,,мицелий из питательной среды фильтрованием или центрифугированием. От. отдельной биомассы прилипший антибиотик целесообразно промывать низшими спиртами, особенно метанолом, или кетонами, особенно ацетоном, в то время как для экстракции растворенных

s питательной среде циклоспоринов находят применение несмешиваемые с водой растворители, например, этилацетат, ri"áóтилацетат, i-бутилацетат, дихлорметан, 1,2дихлорэтан или хлороформ, предпочтительно и-бутилацетат. Полученный экстракцией сырой продукт загрязнен продуцирован ными грибком красными и лиловыми пигментами. Последние можно удалять адсорбцией на.активном угле или силикагеле. Имеющиеся при случае в ферментационном бульоне примеси липидного характера (например, антивспениватели) можно удалять диспергированием сырого продукта в петролейном эфире и содержащим 10% воды метаноле, Липидообразные примеси переходят в фазу петролейного эфира. Из воднометаноловой фазы метанов удаляют выпариванием в вакууме, остающуюся водную фазу экстрагируют дихлорметаном и выпаривают экстракт. Из полученного таким путем очищенного продукта можно отделять циклоспорин А и другие образо1836425 ванные в меньшем количестве компоненты циклоспорина хроматографией на колонне или перекристаллизацией, При сравнении с известными до сих пор способами способ по изобретению имеет ряд преимуществ, которые можно суммировать следующим образом:

1. Основное преимущество способа состоит в том, что штамм То!урос!адйт varlum

sp. nov. СУ/93 дает в несколько раз более количество комплексного циклоспорина, получаемого известными до сих пор методами, при лабораторных условиях количества достигают до 950,и г/мл.

2. Новый штамм дает комплексный циклоспорин благоприятного состава (около

85% комплекса состоят из циклоспорина А), и поэтому ферментационный бульон можно проще и экономичнее перерабатывать, чем это имеет место при известных способах.

Выделенные продукты идентифицировали исследованиями ультрафиолетового спектра, инфракрасного спектра, спектра

Н-ядерного магнитного резонанса и Сядерного магнитного резонанса, анализом аминокислот и жидкостной хроматографией при высоком давлении.

Изобретение поясняют подробнее на основании следующих примеров.

Пример 1. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5 — 7 дней культуры штамма Totypociadium varlum sp.

nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 00 I005) приготовляют с 5 мл 0,9% ного раствора хлористого натрия суспензию спор. При помощи 1 мл этой суспензии спор засевают 100 мл питательной среды с инокулятом, которая находится в колбе Эрленмейера объемом 500 мл, Состав питательной среды с инокулятом 1С глюкза 40 г казеиновый пептон нитрат натрия кислый фосфорнокислый калий 2г хлористый калий .0,5 г сульфат магния 7HzO сульфат железа (II) . 7HzO в 1000 r водопроводной воды

5г

Зг

0,5 г

0,01 г

Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121 С в течение 25 минут.

Культуру встряхивают на аппарате для встряхивания (340 мин, отклонение 3,5 см)

1 при 25 С в течение 3 дней. При помощи 5 мл полученной культуры инокулята засеивают

5 15 колб Эрленмейера объемом 500 мл, в которых находятся по 100 мл стерильной питательной среды FC>.

Состав питательной среды FCt глюкоза 80г трипказин 40r мочевина 2г сульфат аммония 12r нитрат натрия 3 г кислый фосфорнокислый калий 2г хлористый калий 0,5 г сул ьфат магния 7HzO 0,5 r сульфат железа (II) 7HzO 0,01 г в 1000 мл водопроводной воды.

Питательную среду устанавливают до рН 5,2 и после этого стерилизуют при 121 С в течение 25 минут.

Колбы встряхивают на аппарате для встряхивания (340 мин, отклонение 3,5 см) при 25 С. За изменением содержания антибиотика в ферментационном бульоне наблюдают при помощи микробиологического метода диффузии в arape.

Метод диффузии в агаре для микробиологического измерения величин основывается на противогрибковом действии циклоспорина А. В качестве тест-организма применяют Asperglllus niger. Активность образованного комплексного циклоспорина измеряют относительно циклоспорина Астандарта. Содержащие 2 — 8,и г/мл циклоспорина. А, приготовленные с водным спиртом стандартные растворы дают на со40 держащей дрожжевой экстракт и глюкозу агаровой среде эоны торможения диаметром 16-25 мм.

Ферментацию продолжают 168 часов, потом выделяют образованный комплексный антибиотик из ферментационного бульона.

Из одного литра ферментационного бульона, который при прекращении ферментации содержал 400,и г/мл комплекс50 ного циклоспорина, получают антибиотики следующим образом.

Клетки удаляют фильтрованием из ферментационного бульона и прилипшие антибиотики отмывают 2 х 200 мл метанола. Из

55 водно-метаноловой промывочной жидкости удаляют метанол при пониженном давлении и экстрагируют полученный водный концентрат 2 х 50 мл и-бутилацетата. Из фильтрата ферментационного бульона экс1836425

12 трагируют комплексный циклоспорин 200 мл и-бутилацетата. Экстракты соединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении при

40 С. Полученный сырой продукт(3,7 г) растворяют в 10 мл метанола, и липофильные примеси удаляют элюированием с метанолом на слое геля из Sephadex LH-20(высота .40 см, диаметр 2,6 см). Содержащие комплексный циклоспорин фракции выпаривают при пониженном давлении при 400С. Полученный комплексный циклоспорин разделяют на его компоненты на приготовленной иэ 20 г силикагеля (силикагель 40, Реанал, .Будапешт) колонке элюированием повышающим градиенты хлороформа-метанола содержанием метанола. Элюирование начинают с 100 мл хлороформа и продолжают с 100 мп — количествами элюента, в котором содержание метанола при каждой стадии повышают на 0,5%. За содержанием циклоспорина в хроматографических фракциях следят при помощи тонкослойной хроматографии (ппастины с сипикагелем 60

Fgsn, DC алюминиевая фольга, Мерк; конструктор: этилацетат и изопропанол 95:5, ок. раска: пары йода). Циклоспорин А отделяют от колонки содержащим 2,0% метанола хлороформом, цикпоспорин В идет при 2,5 содержания метанола, и циклоспорин С можно найти во фракции с 3,0 метанола.

Хроматографические фракции, содержащие отдельные компоненты цикпоспорина в чистом виде, выпаривают в вакууме. Таким путем получают 225 мг циклоспорина А(точка плавления: 137-140 С; f а)о: — 189 (метанол); 25 мг цикпоспорина В (точка плавления: 149-151 С) и 52 мг циклоспорина С (точка плавления: 150-152 С).

Пример 2. Описанным в примере 1 способом приготовляют на аппарате дпя встряхивания культуру инокулята, 200 мл этой культуры засевают 5 литров питательной среды с инокулятом 1С, которые находятся s лабораторной установке для ферментации объемом 10 литров, и стерилизуют при 1210С в течение 45 минут. Культуру перемешивают при 25 С с числом оборотов

750 мин и при этом аэрируют количеством воздуха ЗОО л/час.

После 72 часов ферментации 500 мп полученной культуры инокулята применяют для засевания 5 литров питательной среды г=Сг, которая находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 л. и стерилизуют при 121 С в течение 45 минут.

Состав питательной среды РСг глюкоза . 80г трипкаэин 40 r

2г

2Г

0,5г

0,01 г мочевина сульфат аммония 12 г нитрат натрия 3r

5 кислый фосфорнокислый калий хлористый калий 0,5 r

10: сульфат магния 7НгО сульфат меди ° 7НгО 0,01 r сульфат

15 марганца (й) . 7НгО сульфат железа (П) 7Нг О 0,01 r в 1000 мл водопроводной воды.

Величину рН питательной среды уста20 навливают перед стерилизацией до 5,2. Посевную культуру перемешивают при 25 С с числом оборотов 750 мин и при этом аэрируют количество воздуха 300 л/час. Ферментацию продолжают в течение 144 — 168

25 часов и прекращают после достижения максимальной концентрации циклоспорина.

Из 4,8 литра ферментационного бульона, который к концу ферментации содержит

500 è г/мл комплекстного циклоспорина, выделяют цикпоспорин А следующим образом, Клетки удаляют из ферментационного бульона фильтрованием, прилипшее на клетках содержание антибиотика вымывают

2 х 1 литром метанола. Из промывочной жидкости метанол удаляют при пониженном давлении и активное вещество экстрагируют из концентрата 2 х 250 мл

40 п-бутилацетата.

Из фильтрата ферментационного бульона комплексный циклоспорин экстрагируют

2 х 500 мп п-бутипацетатом. Экстракты соединяют, сушат над безводным сульфатом

45 натрия и выпаривают при пониженном давлении при 40 С. Полученный сырой продукт (19,2 r) предварительно очищают методом хроматографии на колонне íà 100 r сипикагеля 60 (размер частиц: 0,063-0,2 мм) с хло50 роформом: метанолом; ацетоном = 92:4:4 в качестве элюента. Содержащие комплексный циклоспорин фракции (тонкослойная . хроматография на пластинах из силикагеля

60 F2, DC-алюминиевая фольга (Мерк);

55 конструктор: гексан и ацетон в отношении

2:1, окраска; хлор и толидин) выпаривают досуха. Из остатка от выпаривания (5,28 г) отделяют методом хроматографии на колонне циклоспорин. Колонна содержит 115 г

1836425

0,5 г

Посевную культуру поддерживают термостатом при 25 С, йеремешивзют (1000 мин ") и аэрируют 300 литрами/час воздуха.

Культуру ферментируют 120 — 168 часов, после этого ферментационный бульон по микробиологическим измерениям величин содержит 600,и г /мл комплексного циклоспорина. Из одного литра ферментационного бульона описанным в примере 2 способом получают 310 мг циклоспорина А. силикагеля 60 (размер частиц: 0,063 — 0,2 мм}.

B качестве растворителя применяют содержание ацетона, повышающее градиен гексана-ацетона. Циклоспорин А промывают содержащим 23 ацетона и-гексаном из колонны. Выпариванием содержащих циклоспорин А фракций получают 1,46 г циклоспорина А.

П ри м е р 3. Из выращенной насодержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladlum varlum sp.

nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9 -ного раствора хлористого натрия суспензию спор. Суспензию спор применяют.для посева 800 мл питательной среды 1С указанного в примере 1 состава; которая находится в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и которая предварительно была стерилизована. Колбу встряхивают е аппарате для встряхивания (340 мин ", отклонение 3,5 см) при 25ОС в течение 2,5 дней. Полученной культурой инокулята засевают 5 литров пйтательной среды ЕСз.

Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 л и была предварительно стерилизована при 121 С в течение 45 минут.

Состав питательной среды FCs сорбоза 60 г трипказин 40r мочевина 2г . сульфат аммония 12r нитрат натрия Зг кислый фосфорнокислый калий 2г хлористый калий 0,5 г сульфат магния 7Н20 сульфат марганца(П) . 7НгО 0,01 r сульфат железа (11) 7Н20 0,01 г в 1000 мл водопроводной воды.

12г

0,5 г

0,01 г

Пример 4. Из выращенной на содержащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5-7 дней культуры штамма Tolypocladlum varlum sp.

5 nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0,9 -ного раствора хлористого натрия суспензию спор, Суспензию спор применяют для посева 500 мл питательной среды 1С указанного s примере 1 состава.

-10 которая находится в колбе Эрленмейера объемом 3 литра и биле предварительно стерилизована. Колбу встряхивают в аппарате для встряхивания (340 мин, отклонеwe 3,5 см) при 25ОC в течение 3 дней.

15 Полученной культурой инокуляра засевают

5 литров питательной среды FCp. Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации объемом 10 литров и онз былз предварительно стерилизована при 121ОС в течение 45 минут.

Состав питательной среды FC4 мальтоза 80r трипказин 40r мочевина 2 г сул ьфат аммония нитрат натрия кислый фосфорнокислый

2г хлористый калий 0,5 r сульфат магния . 7Hz0 сульфат меди (И) 7Н20 0,01 r сульфат марганца (И) 7Н20 сульфат железа (И) 7Н О 0,01 г в 1000 мл водопроводной воды.

Питательную среду перед стерилизацией устанавливают до величины рН 5,2.

Посевную культуру подвергают фермента45 ции при 25 С и при перемешивании (1000 мин ) и аэрации (300 л/час) в течение 144 часов. В конце ферментации ферментационный бульон по микробиологическим измерениям величин содержит 620 /c г/мл

50 комплексного циклоспорина. Из одного лит- . ра ферментзционного бульона описанным в примере 1 способом получают 305 мг циклоспорина А.

Пример 5. Из выращенной на содер55 жащем солодовый экстракт и дрожжевой экстракт косом агаре возрастом 5 — 7 дней культуры штамма Tolypocladium чегет sp.

nov. СУ/93 (NCAIM(P)F 001005) приготовляют с 5 мл 0.9 -ного раствора хлористого

1836425 натрия суспензию спор. Суспензию спор применяют для засевания 500 мл питательной среды 1 С указанного в примере 1 состава, которая находится в колбе Эрленмейера обьемом 3 литра. Колбу встряхивают при 5

25 С на вибрационной машине с мельничным ситом (430 мин, отклонение 3,5 см) в течение 2 дней, Полученной культурой инокулята засевают 5 литров питательной среды FC>. Питательная среда находится в лабораторной установке для ферментации обьемом 10 литров и она была предварительно стерилизована при 121 С в течение

45 минут. Посевную культуру подвергают ферментации при 25ОC при перемешивании (750 мин ) и аэрации (300 л/час). В .96-й час добавляют 2% отдельно стерилизованной мальтозы, затем производят ферментацию до 144-го часа. Ферментационный бульон содержит к этому моменту по микробиологическим измерениям величин 950 ф г/мл комплексного циклоспорина. Из 2,8 литра ферментационного бульона описанным в примере 2 способом выделяют 2,75 г циклоспорина А.

Формула изобретения

1. Способ получения комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов, включающий культивирование продуцента при аэробных условиях в питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода, азота и минеральной соли с последующим выделением целевых продуктов, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют грибок

Tolypocladium varlum NCAiM(P)F 001005, при этом культивирование осуществляют при температуре 25-30 С.

2. Способ по и, 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что в качестве источника азота применяют пептон, сульфат аммония, трипказин, в качестве источника углерода — глюкозу, мальтозу, сорбит, 3. Штамм грибка Tolypoctadlum varium

NCAIM(P)F 001005 — продуцента комплексного антибиотика циклоспорина и/или его компонентов, 18

1836425

Продолжение таблицы стойкость к 60-мин. нагреву при 50 С .I

+++ +++

,получеггие кислоты иэ глюкозы

I, °

+ ++.

+ усваемость а-салицилата усваяемость А а-малоната

++ усваяемость а-тартрата !

++

++ лиловый растворимый пигмент на тироэин-лейцин-агаре

+++ +++

Составитель P.Êàðïåíêo

Техред М.Моргентал Корректор Л.Филь

Редактор

Заказ 3008 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Е з г- о аа ал о

A CO о, с гФф г-4 Ш

Е

"Э

t0 о о а ав

Oi O ю-4 О о в

Ео

:)

° Л °

1о A

6) CV

° "Ч 1 о о ы

a ai

>. чэ о о в

3 oч> о а-

Ц: оо ы

° о v o о а а о

D O о r» л ЕВ о л.гч R

1-1 о {

О ЗZ (2 с=4=