Штамм гриба gliосlаdiuм сатеnulатuм gilмаn. ет аввотт для получения препарата против грибных возбудителей картофеля

Штамм гриба gliосlаdiuм сатеnulатuм gilмаn. ет аввотт для получения препарата против грибных возбудителей картофеля

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕ НТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ

Со

GD ,©

1 0

1 С) 4 (21) 4865244/13 (22) 10.09.90 (46) 30.08.93. Бюл. ¹ 32 (71) Институт экспериментальной ботаники им.В.Ф. Купревича и Главный ботанический сад АН СССР (72) Н,А. Дорожкин, Т.П. Алексеева, Ю.М, Плотникова, В,М. Гораль, Н.В, Лаппа, Т.Г.

Омельянец, Г.П. Мельник и Г,Т, Архипчук (56) Микология и фитопатология, 1989, т.23, в.2, 167 — 172.

Микробиологический журнал, 1988, т.50, ¹ 6, 63 — 67.

Acta Phytopath,et Entomologica, 1988, н,23, ¹ 1 — 2, 133 — 135.

Авторское свидетельство СССР

N 1771639, кл. А 01 N 63/00, 21.05.90. (54) ШТАММ ГРИБА G LlOCLADIUM

CATENULATUM GlLMANN ЕТ АВВОТТ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГРИБНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАРТОФЕЛЯ

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биологическому способу защиты растений, и может быть использовано против грибных возбудителей картофеля, Цель изобретения — получение нового штамма Gliocladium catenulatum Gilmann et

Abbott В Н И И СХМ-В ИЗ P Д-43, облада ющего широким спектром антагонистической активности по отношению к ряду грибов, возбудителей клубневых гнилей картофеля, а также микопаразитной активностью по отношению к возбудителю фузариоза, вертициллиоза, резиновой гнили.

Это достигается тем, что в качестве антагониста грибов, возбудителей клубневых гнилей картофеля используется штамм

„5U „„1836907 A l (57) Использование; микробиологическая промышленность, сельское хозяйство, производство средств защиты растений против возбудителей заболеваний, в частности грибных фито пати феля, Сущность изобретения: штамм Gliocladium

catenu1atum Gilmann et, Abbott. ВНИИСХМВИЗР Д-43 культивируют на картофельноглюкозном агаре при 25 С в течение 2 — 3 недель, смывают опоры с агара. Титр биопрепарата 6,5.10 конидий в 1 мл. Норма расхода — 10 мл на 1 кг картофеля. Обработка полученным препаратом клубней картофеля снижает развитие болезни, возбудителем которой является Fusarium

Sambucinum, на 81,37 „а препаратом на основе известного штамма Bacillus mycoides лишь на 51,4, 5 табл.

Gliocladium catenu1atum Gilmann. et Abbott.

453, депонированный в объединенной коллекции микроорганизмов ВНИИСХМ-ВИЗР

27 апреля 1990 года под регистрационным номером Д-43, выделенный с поверхности клубня сорта Невский с симптомами фузариозной гнили, отобранного в Ленинградской области, Идентифицирование штамма прово- j дилось по определителю 6 V.

Subramanian "Hyphomycetes" indian Council

of. Agricultural Research. New Delhi, 1971, . р.644.

Штамм Gllocladium catenulatum Gilmann е1 Abbott, ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 относится к классу Deutегоmyces, порядку Moniliales, роду Giicladium.

1836907

Ш i BMM имеет следующую характеристику, l. Кул ьтурал ьно-морфологические признаки, На картофельно-глюкоэном arape колония клочковато-пушистая, белая, с оливково-зелеными концентрическими зонами спороношения в центре колонии, Конидиеносцы шероховатые около 100 мкм длиной.

Кисточка трехярусная, веточки 15 — 20х4 мкм, метулы 7 — 10х2,5 мкм, фиалиды 10 — 20х2 мкм, Конидии зллипсоидные, 4 — 8х3 — 4 мкм, гладкие, светло-зеленные в длинных слизистых колонках.

)линейный рост колонии на агаризованных средах:

1.Íà сусло-агаровой среде — на 5-ый день роста — 21 мм, на 10-ый день — 30 мм, на 20-ый день — 90 мм;

2.На картофельном агаре — на 5-ый день роста — 28 мм, на 10-ый — 44 мм, на 20-ый день — 80 мм;

3,На среде Чапека на 5-ый день роста—

21 мм, на 10-й день — 33,5 мм, на 20-ый день — 63,5 мм;

4.На овсянном агаре на 5-ый день роста — 24,5 мм, на 10-ый день — 43 мм; на 20-ый день — 75,5 мм;

5,На картофельно-глюкозном агаре на

5-ый день роста — ЗО мм, на 10-ый — 45,5 мм, на 20-ый день — 90 мм.

Спорообразование гриба на агаризованных средах на 21-ый день роста

1,На сусло-агаровой среде — 6,5х10 ко6 нидий в 1 мл;

2,На агаре Чапека — 7,2х10 конидий в 1

3,На картофельно-глюкозном агаре—

6,5х10 конидий в 1 мл;

4,На картофельном агаре — 4,4x10 конидий в 1мл;

5.На овсяном агаре — 1,2x10 конидий в

1 мл.

Спорообразование начинается на 5-ый день роста, максимум спорообразования на

21 день, ll, Физиолого-биохимические свойства, Из источников углерода усваивает глюкозу, галактоэу, сахарозу.мальтозу, фруктоэу, арабиноэу, рамнозу. Хорошо усваивает нитратный, нитритный и аммонийный азот.

Растет в широких пределах рН от 2,0 до

9,0, Продукт синтезируемый штаммом не устанавливался.

Признаки штамма устойчивые.

Штамм периодически пересевается и хранится в пробирках на картофельно-глюкозной среде и сусло-агаровой среде при температуре 20 — 25 С.

Штамм G I l oc la dium ca te nu l atum

Gilmann. ес Abbott, ВНИИСХМ ВИЗР Д-43 не патогенен для теплокровных животных.

Пример 1. Отбор штаммов грибов-антагонистов к возбудителю фузариоэа картофеля Fusarlum sambucinum Fuck.

Основным и наиболее опасным патогеном картофеля при хранении является гриб

Fusarlum sambuclnum Fuck. В связи с этим

"0 отбор грибов-антагонистов проводился к наиболее вирулентному штамму Fusarium

sambucinum Fuck. 34

Материалы и методы.

Объектами исследования служили гри"5 бы рода Gllocladium, Fusarium, Моп!егеПа, Cladosporium, Verticillium, Penicillium, Tricbocladium, Scopulariopsis, Раес Ilomyces и др„выделенные по общепринятой методике из клубней картофеля из разных обла20

ЗО

55 стей Советского Союза, Всего проанализировано свыше 200 штаммов грибов.

Штаммы предполагаемых антагонистов выращивали на картофельно-глюкозно-агаровой среде в течении 20 суток в чашках

Петри, затем из образовавшегося газона вырезали блоки 0,5 см в диаметре.

Тест-объект F.sambuclnum культивировали на картофель-глюкозном агаре в течение 14 суток. Из выросших культур готовили посевную суспензию с титром 1х10 макронидий в 1 мл. О 1 мл суспензии

F,sambucinum высевали газоном на поверхность застывшего картофельно-глюкозного агара в чашках Петри. В центре засеянных тесг-объектом чашек Петри располагали блок с предполагаемым антагонистом. Чашки Петри оставляли при комнатной температуре 22-25 С. Учет результатов опыта проводили на 6-е сутки, Среди исследованных штаммов нами отобраны иэоляты, дающие зону задержки роста тест-культуры рабиусом не менее 10 мм (табл.1). Высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителю фузариоза F.sambucinum обладали грибы рода Glicladium и Paecillomyces, причем в отдельных случаях наблюдалось нарастание колонии антагониста на колонию тест-кул ьтуры, Наибольшей антагонистической активностью по отношению к F.samcinum обладает штамм Gliocladium catenulatum Gilmann

et Abbott. Д-43.

Пример 2. Для анализа изменения репродуктивной активности F.sambucinum под действием грибов-антагонистов проводили учет количества конидий тест-культуры в зоне ингибиции и в контроле (культура

F.sambucinum без антагониста) при помощи камеры Горяева.

1836907

Данные приведены в табл.2.

Наибольшее снижение репродуктивной способности F,sambuclnum наблюдалось под действием гриба Gtlocladlum

catenulatum Д-43.

Пример 3. Микопаразитные свойства

Gllocladlum catenulatum Д-43 по отношению к возбудителям клубневых гнилей картофеля.

Для изучения микофильных свойств предметные стекла, покрытые тонким слоем картофельно-глюкозного агара, инокулировали одновременно (противоположные стороны) микопаразитом и тест-грибом.

Совместные культуры инкубировали в стерильных чашках Петри на влажных фильтрах при температуре 25 С, B качестве тест-культур были взяты: Fusarium

sambucinum, Geotrichum candidurn, Verticillium lateritlum. Через 5 — 7 дней препараты окрашивали метиленовой синькой, микроскопировали и проводили исследования с помощью светового микроскопа Leitz, Установлено, что под воздействием

Gliocladium catenulatum Д-43 происходит разрушение конидий F.sambucinum, наблюдались случаи обвивания гифой микопаразита гиф Verticillium lateritium u

F.sambucinum, их параллельный рост, при этом происходят изменения в цитоплазме гиф тест-культур, их вакуолизация, сужение, разрыв. При помощи сканирующего микроскопа обнаружены контактные органы этого микопараэита, представленные длинными, тонкими ветвями, обвивающие гифу хозяина (тест-культуру), а также специализированные органы — конические апрессории, внедряющиеся в гифу хозяина, разрушая локально его оболочку.

Пример 4. Использование штамма

Gliocladium catenulatum Д-43 при получении препарата.

Для размножения штамм культивировали в пробирках на картофельно-глюкозном или сусловом arape в течение 2 — 3 недель при температуре 25 С. Препарат используют в виде суспензии спор. Для этого в пробирку с культурой гриба добавляют стерильную воду до верхнего уровня среды и встряхивают до образования суспензии.

Подсчет конидий в полученной суспензии проводят в счетной камере Горяева, после чего доводят концентрацию до 10 конидий

6 в 1 мл воды. Титр биопрепарата 6,5х10 коб нидий в 1мл.

При хранении штамма в холодильнике при температуре 5 — 10 С в пробирках на картофельно-глюкозном агаре пересев требуется раз в год. Приготовленный биопрепарат (суспензия штамма) используется в

35 течении 24 часов. Норма расхода 10 мл на 1 кг картофеля.

Пример 5. Использование препарата (штамма) Gliocladlum catenuiatum Д-43 при проверке его антагонистической активности по отношению к Fusarium sambuclnum

34 (табл.3).

Исследования проводили путем искусственного заражения клубней картофеля суспензией конидий грибов F,sambuclnum u предполагаемых антагонистов грибов рода

Gliocladlum, Инфицировали картофель суспензией конидий в соотношении 1:1. Титр суспензии 1х10 конидий в 1 мл.

Г1ромытые. обработанные спиртом и обожженные над спиртовкой клубни повреждали штампом на глубину 10 мм в пуповинной части.

В полученные углубления пипеткой вводили до полного наполнения приготовленную суспензию. Для каждого образца брали по 10 клубней. В контрольные образцы с механическими повреждениями вводили стерильную воду совместно с суспензисй гриба F.sambucinum в соотношении 1:1.

Клубни укладывали в выстланные фильтровальной бумагой зксикаторы, нижняя часть которых заполнялась стерильной водой.

Эксикаторы накрывали крышками и помещали в термастат или помещение с температурой 23 — 25 С и в холодильные камеры с температурой 5 С.

Учет загнивания клубней проводили через 10 дней после их продольного разреза через точку механического повреждения.

Измеряли диаметр и глубину загнивания, с последующим вычислением площади некроза.

Двухфакторный дисперсионный анализ данных по площади некроза картофеля при заражении возбудителем фузариоза совместно с грибами рода Fusarium позволяют говорить о достоверности различий и о более высокой антагонистической активности

G.catenuiatum Д-43. Препарат (штамм)

G,catenulatum снижает развитие болезни как при высоких температурах, так и при низких (5 С).

Пример 6, Использование штамма

Gliocladium catenuIatum Д-43 для подавления развития сухой фузариоэной гнили клубней картофеля по сравнени о с Bacillus

mycoides (прототип).

В табл.4 приведены данные по развитию патологического процесса в клубнях, инфицированных F,sambucinum, при внесении в гриб-суспенэию бактерии Bacillus

mycoides 683 (прототип) и предлагаемого штамма Gliociadium catenul turn Д-43.

1836907

Таблица 1

Антагонистическая активность грибов рода ОНос!абйгп и

Paecillomyces по отношению к возбудителю фуэариоэа картофеля Fusarium sambucinum Fuck. N 34 in vitro

Из результатов опыта следует, что использованием штамма G,catenulatum Д-43 ведет к более значительному снижению развития болезни на 81,3 ф,, при примененйи

ВасИШв mycoides эта величина составляет

51 4ф, Пример 7, Антагонистическая активность 6llociadlum catenulatum Д-43 по отношению к грибам возбудителям клубневых гнилей картофеля по сравнению с Bacillus

mycoides 133 (прототип), Методика проведения опыта описана, выше, Повторность опыта 6-кратная, Из данных табл.5 видно, что предлагаемый штамм Gliocladium catenulatum Д-43 обладает большим антагонистическим эффектом по отношению к фитопатогенным грибам картофеля. а также более широким спектром действия по сравнению с Bacillus

mycoides 133.

5 Таким образом, использование штамма

Gliocladium catenulatum Д-43, обладающего антагонистическим и микопаразитным действием в отношении фитопатогенных грибов, позволяет расширить арсенал

10 биологических средств борьбы с возбудителями клубневых гнилей картофеля.

Формула изобретения

Штамм гриба Gllocladium catenulatum

Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43

15 для получения препарата против грибных возбудителей картофеля.

1836907

Таблица 2

Таблица 3

Влияние грибов рода Gliocladium на развитие болезни клубней картофеля сорта Огонек при разных температурах, инфицированных возбудителем фузариоза F.sambucinum 34

1836907

Таблица 4

Развитие болезни, Ва иант опыта

100

Fusarlum sambuclnum (контроль) Bacillus: mycoides + F.sambuclnum

Gliocladium catenulatum D-43+ F,sambuclnum

48,6

18,7

Таблица 5

Зона отс тствия оста г иба по а и с, мм

Текст-культура

В.m соЫез и ототип

G.catenulatum -43

15,0+ 2,0

17,0 2,0

18,0 + 1,5

14,0 + 2,0

- Fusarlum sambuclnum

Fusarium avenaceum

Fusarium culmorum

Fusarium solanl

5,0 +1,0

4,0 +1,0

13,0 +. 2,5

5,0 "= 1,0

10,0 +. 2,0

Составитель Н. Дорожкин

Техред М.Моргентал Корректор М, Максимишинец

Редактор

Заказ 2846 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Fusarium solanl var.argiliaceum

Fusarium oxysporum

Говагium gramenial

Fusarlum lateritium

Phoma exlgua чаг,exigua

Geotrlchum candidum

Alternarla alternata

Verticilium lateritium

Trichocladium asperum

Scopulariopsis brevicaulis

25,0+ 0,0

18,7 +1,0

38,8 «-2,0

23,7 + 0,95

40,0 +.0,0

20,2 + 1,6

19,5 2,0

21,0+ 1,0

32,0 "- 2,0

21,0 + 1,0

350 й1 1

21,0 - 0,365

34,3 +0,7

20,04 0,0