Способ получения рекомбинантной плазмидной днк и способ получения зимогенной формы белка с человека

Способ получения рекомбинантной плазмидной днк и способ получения зимогенной формы белка с человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: получение новых форм бе/.ка С человека. Сущность изобретения: разработан способ получения зимогенноп формы белка С путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность со свойствами зимогенной формы белка С. Указанные формы белка отличаются от нативного белка С более высокими амидолитической и функциональной активностями, и имеют новые углеводородные структуры, В изобретении раскрываются также ДНК-соединения , векторы и трансформанты. 2 с.п.флы, 7 ил., 6 табл,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) и Я

7Е!(Л 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Уильям (21) 4894565/13 (22) 22.02.91 (46) 30.08,93. Бюл. и 32 (31) 07/484.081 (32) 23.02,90 (33) US (71) Эли Лилли Энд Компани (US)

Ф (72) Брус Эдвард Герлитз и Бриан

Гриннелл (US) (56) ЕПВ 0215548, кл. С 12 N 15/00, 1987.

ЕПВ, 0255771, кл. С 12 N 15/00, 1988.

ЕПВ, 0266190, кл. С 12 N 15/О(), 1988.

ЕПВ, 0245949, кл. С 12 N 15/00, 1987.

Изобретение относится к новым ДНКсоединениям и векторам клонирования рекомбинантных ДНК, кодирующих новые зимогенные формы белка С человека. Эти зимогены сконструированы таким образом, что типы гликосилирования являются совершенно иными по сравнению с зимогеном человеческого белка С дикого типа. Гликосилирование, в частности, если углеводородные части содержат высокие уровни сиаловой кислоты, может играть важную роль в секреции белка и его функции, Новые эимогены изобретения конструируют таким образом, что каждую из областей гликосилирования изменяют отдельно. Векторы экспрессии позволяют получить простой и эффективный способ экспрессии укаэанных зимогенных форм белка С человека B рекомбинантных хозяйских клетках. Изобретение позволяет получить способ продуцирования. Ж 1838411 АЗ (st)s С 12 N 15/09, 15/15, С 12 Р 21/02 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК И СПОСОБ

ПОЛУЧЕНИЯ ЗИМОГЕННОЙ ФОРМЫ

БЕЛКА С ЧЕЛОВЕКА (57) 11спольэование: получение новых форм бе .ка С человека. Сущность изобретения: разработан способ получения зимогенной формы белка С путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей аминокислотную последовательнос1ь со свойствами зимогенной формы белка С, Указанные формы белка отличаются от нативного белка С более высокими амидолитической и функциональной активностями, и имеют новые углеводородные структуры, В изобретении раскрываются также ДН1-соединения, векторы и трансформанты. 2 с,п.флы, 7 ил„6 табл, зимогенных форм белка С, которые при активации обладают более высокой амидолитической и антикоагулиру ощей активностью, чем нативная форма белка С.

Новые формы зимогенов человеческого белка С отличаются от известных зимогенных форм аминокислотными последовательностями различных областей гликосилирования, Эти новые зимогенные формы белка С обладают определенными преимуществами при лечении заболеваний крови, в частности, нарушений коагуляции, Белок С, витамин К-зависимый белок плазмы имеет большое физиологическое значение для регулирования гемостаза, Белок С синтезируется в виде неактивных молекул, называемых далее ранним белком С.

Как будет подробно описано ниже, этот ранний белок подвергается сложному процессингу, что приводит к образованию

1838411 различных неактивных молекул. Неактивные секретируемые формы белка С именуются в настоящем описании эимогенным белком С.

Активация белка С происходит в крови путем реакции с комплексом тромбодулинт- 5 ромбин. Активиррванный белок С вместе с его кофактором белком S является антикоагулянтом, обладающим высокой физиологической активностью. Активированный белок

С способствует предупре;кдению возникно- 10 вения интерваскулярного тромбоза и распространению образовавшихся тромбов.

Механизм действия активированной формы белка C и механизм активации неактивного зимогена в активную протеазу подробно описан в нескольких работах последних лет.

В активации белка С участвует тромбин, конечная форма сериновой протеазы в каскаде коагуляции, и гликопротеин, ассоциированный с мембраной эндотеl!uaëьной клетки, и называемый тромбомодулином.

Тромбомодулин образует тесный стехио летрический комплекс с тромбином. СвязыBaRch с тромбином, тромбомодулин резко изменяет функциональные свойства тром- 25 бина. Тромбин свертывает фибриноген, активирует тро лбоциты и превращает кофакторы свертывания крови V и И!! в их активные формулы, Va и Villa, И наконец, тромбин активирует белок С, однако, этот З0 процесс протекает очень медленно и неэф фективно, и кроме того, активация ингибируется физиологическим Са . Напро1ив, 2+ тромбин в комплексе с тромбомодулином не свертывает фибриноген, не активирует З5 тромбоциты и не превращает кофакторы свертывания Чи Vill в их активныедвойники

Ча и Villa, а становится эффек1ивным активатором зимогенного белка С в присутствии физиологического Са . Константа скорости 40 активации зимогена балка С с помощью комплекса тромбомодулин-тромбин в 1000 раэ превышает константу скорости процесса с участием лишь одного громбина, Для более ясного представления регу- 45 лирующей функции активированного белка

С в свертывании крови ниже приводится описание ферментативной системы коагуляции. Указанную систему коа уляции можно рассматривать как цепную реакцию с 50 последующей активацией зимогена в активные сериновые протеазы. В итоге указанная цепная реакция продуцирует фермент тромбин, который посредством ограниченного протеолиза превращает фибриноген плаз- 55 мы в нерастворимый гелеобразный фибрин, Ключевыми стадиями в каскаде коагуляции являются превращение фактора свертывания крови Х и Ха с помощью фактора свертывания !Ха и превращение протромбина в тромбин с помощью фактора свертывания

Ха. Обе указанные реакции происходят на поверхностях клеток, преимущественно на поверхности тромбоцитов, и для их осуществления необходимо присутствие кофакторов, Основные кофакторы, факторы V u Vill циркулируют в системе виде относительно неактивных предшественников, однако образование napf34lx нескольких молекул тромбина приводит к укреплению тромбиновых петель и активации кофакторов посредством ограниченного протеолиза.

Активированные кофакторы Va u Villa ускоряютобе конверсии протромбина в тромбин и факторы Х в фактор Ха приблизительно на пять порядков величины. Активированный белок С предпочтительно действует на кофакторы свертывания Ча и Villa, т,е. активированные формы неактивных факторов V u

Vill путем протеолитической деградации, гидрослива и необратимого расщепления.

Напротив факторы свертывания V u Vill являются плохими субстратами длл аггиаированного белка С.

Ценным кофактором для активированного белка С является белок S, другой витамин К вЂ” зависимый белок плазмы, Белок S в основном в 25 раз ускоряет гидролиз факторов Va и Villa, опосрадоианный активированным белком С, Белок С известен специалистам как ценное терапевтическое средство. Av. иаированный белок С является новым антитромбином с более широки л терапевтическим индаксом по сравнению со стандартйыми антикоагулянтами такими, как гспарин, или антикоагулянтами тиг|а гидроксикумарина для перорального введения. Ни зимогенный белок С, ии активирэванный белок С не являются эффективными до тех пор, пока не будет образовываться тромбин, поскольку его присутствие является необходимым для превращения сверты-. вания V в Va u Vill в Villa, активированные формы этих двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного белка С. Для активации зимогенного белка С также требуется тромбин, при этом в отсутствии комплекса тромбомодулинтромбин превращение зимогена белка С в его активную формулу протекает очень неэффективно, Рктивированный белок С является предпочтительным актикоагулянтом, поскольку он действует посредством инактивации KQфакторов Va u Villa. Так как для превращения факторов Ч и И!.! в их активные Формы

Ча и И!!а требуется тро лбин, то белок С действует в качестве антикоагулянта л"шь

1838411

i0 30 40

10 5 -ATG TGG ÑÀG СТС.ACA AGC СТС СТО CTG ТТС GTG GCC ACC TGG GGA ЛТТ. Н2Ч-ИЕТ TRP GLN LEU TEIR .SER LEU LEU LEU РНЕ ЧЛ1. ALA TEER TRP GLY ILE

5 i0 г

50 60 70 80 90

ТСС .GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA ОТО ТТС ТCC AGC AGC ОЛО СОТ

SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER UAL РНЕ SER SER SER GLU ЛЯО

20 25 30

° 15

100 110 120 130 140

GCC САС СЛО GTG CTG СОО ATC CGC ЛЛА CGT GCC ААС ТСС ТТС CTG GAG

ALA HIS GLN VAL LZU APG ILE ARG:LYS ARG ALA ASN SZR PHE LEU ОП1

35 40 45

150 160 170 180 190

GAG СТС CGT САС ЛОС AGC СТО GAG CGG GAG TGC ATA GAG ОЛО ATC TGT

ЖЦ LEU ARG EEIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ПЕ GLU GLU П,Е CYS

50 - 55 60

200 210 220 230 240

GAC ТТС GAG GAG GCC АЛО ОАА.ЛТТ ТТС САЛ AAT GTG GAT ОАС ЛСЛ СТО

ASP PHE GIU GLU ALA IYS GLU ПЕ PHE GLN ASN VAL Л$Р ASP ТНЛ Ы11

65 70 75 80

250 - 260 270 280

GCC ТТС ТОО ТСС ААО САС ОТС ОАС GGT ОАС СЛО TGC TTG GTC ТТО ССС

ALA PEEE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU РКС

85 90 95

290 300 310 320 . 330

TTG GAG СЛС ССО TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG.TGC АТС

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILZ

100 105 110

40 после образования тромбина, В противоположность указанному активированному белку С, стандартные антикоагулянты сохраняют свое антикоагулирующее действие в системе кровообращения в течение всего 5 периода введения их пациенту, что значительно увеличивает риск осложнения в виде кровотечения, Поэтому активированный белок С является предпочтительным антикоагулянтом широкого применения и может 10 быть использован вместо гепарина и гидроксикумарина в качестве альтернативного средства.

При некоторых заболеваниях, таких, как наследственный дефицит белка С, зимоген 15 белка С является черезвычайно це ейным терапевтическим средством. Человек с врожденным гомозиготным дефицитом балка С обычно умирает в раннем детстве от молниеносной пурпуры, часто встречающейся ле- 20 тальной формы диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Человек с гетерозиготным дефицитом белка С обычно тяжело страдает от рецидивирующих тромбоэмболических осложнений. Клинически было установлено, что концентра-ы белка плазмы, предназначенные для лечения гемофилей В или дефицита фактора iX и содержащие в качестве примеси белок С, являются эффективными для предупреждения и лечения внутрисосудистого свертывания при гетерозиготном дефиците белка С, Было также установлено, что при тромботических состояниях, таких, как диссеминированное внутрисосудистое свертывание, и при заболеваниях, предрасполагающих к тромбозу таких, как обширная травма, обширное оперативное вмешательство, и рак, уровня белка С являются крайне низкими.

Для лучшего понимания механизма активации белка С настоящего изобретения, ниже представлена последовательность аминокислотных остатков для раннего белка С человека. Указанная аминокислотная последовательность и ее соответствующие области в целях настоящего изобретения также характеризует "нативный белок С человеKB

1838411

Х-7953А

340 . 350 360 370 380

С С GGC ATC GGC AGC ТТС AGC TGC ОЛС TGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC

ASP GLY ILK GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG ЯЕВ GLY TRP СЮ GLY

115 120 125

390 - 400

CGC ТТС TGC CAG ССС GAG GTG AGC

ARG РНЕ CYS ИЛ ARG GLU ЧАХ SKR

130 135 !

440: 450

GGC GGC ТСС ACG САТ ТЛС TGC СТЛ

GLY GLY CYS TIIR 1ПБ TYR CYS LKU

145 150

410 420 430

ТТС СТС AAT TGC TCG CTG GAC АЛС

РНЕ ХЕК ЛБИ СУБ БЕВ НЛ ЛБР ЛЯИ

-140

460

GAG GAG

GLU GLU :470 480

GTG GGC TGG CGG CGC TGT

ЧЛЬ ЖУ ТВЗ ЛВС АВО CYS

155 . . 160

490 500, 510 . 520

AGC TGT GCG ССТ GGC ТАС hAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG СЛС ТОТ CAC

SER CYS ALA PRO GLY TYR ЬУБ LEU GLY ASP ASP LKU I„KU GLN CYS IIIS

165 170 175

530 540 550 . 560 570

CCC GCA GTG ЛЛО TTC CCT TGT. GGG AGG CCC TGG hAG CGG ATG GAG AAG

РВО А1.Л ЧЛЬ ЬУБ РНЕ РВО СУБ О17 ЛВО РВО ТВР LYS AHG IET GLU LYS

180 185 190

580 590 600 610 620

AAG CGC AGT CAC CTG ЛЛЛ CGA GAC ACA GAA GAC СЛЛ GAA GAC CAh, GTA

IYS ARG SER HIS LKU LYS ARG ASP *ПППБ GLU ASE- GLN GLU hSP СЕЛ VAL

195 200 205

630 . 640 650 " 660 670

GAT CCG CGG CTC ATT СЛТ GGG. ЛЛО ATG ACC AGG CGG GGA GhC AGC CCC

ЛЯР PRO ARG LEU ПЕ ASP GLY IYS ИЕТ ТЛВ hRG ЛКС GIY ASP БЕГ(PRO

210 215 220

680 690 700 710 720

ТСС СЛС ОТО СТС СТО СТО СЛС ТСЛ ЛАС ЛЛО ЛЛС СТО ССС ТСС ОСС ССЛ

ТВР СЬИ VAL VAL LKU LKU ЛБР БЕВ LYS IУБ ХУБ LEU ЛЬЛ CYS GLY А1Л

225 230 235 240

820 830 840 850 860

TGG GAG AAG TGG GAG СТО GAC СТО ОЛС ЛТС AAG GAG GTC ТТС СТС СЛС .

TRP GLU LYS TRP GLU LKU ASP LEU ASP ПЕ LYS GLU VAL PIIK VAL 1ПЯ

275 : 280 285

730 740 750 760

GTG СТС АТС CAC CCC ТСС TGG GTG СТО ЛСА GCG GCC CAC TGC ATG GAT

VAL LKU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU TIIR ALA ALA IIIS CYS ИЕТ ЛБР

245 250 255

45 7953Р 770 780 790 800 :810

GAG ТСС AAG ЛЛС СТС СТТ ОТС AGG СТТ GGA GAG TAT СЛС CTG CGG CGC

GLU SKR LYS LYS LEU LKU ЧАХ ARG LEU GLY GIU ТУВ ЛЯР LKU ЛВО hRG

260, 265 270

1838411

870 880 890 900 910

ССС AAC TAC AGC AAG AGC АСС АСС GAC АЛТ GAC ATC GCA CTG CTG CAC

PRO ASN TYR SER LYS SER ТНВ THR ASP ASN ASP ПЕ ALA LEU LEU НТ8

290 295 300

920 930 940 950 960

CTG GCC CAG ССС ОСС АСС СТС TCG CAG АСС ATA GTG ССС ЛТС-TGC СТС

LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN ПП ПЕ VAL PRO LE CYS LEU

305 310 315 320

970: 980 990 1000

CCG ОЛС AGC GGC СТТ GCA GAG CGC GAG СТС.АЛТ CAG GCC GGC CAG GAG

PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY 61Л GLU

325 330 335

1010 1020 . . 1030 1040 1050

АСС CTC GTG ACG GGC TGG GGC ТАС САС АОС AGC CGA GAG ЛАО GAG GCC

TEER LEU VAL TIER GLY TRP GLY TYR HIS SER SER hRG ОЕБ ЪТЛ 6111 ИЛ

340 345 350

1060 1070 1080 1090 1100

АЛ6 AGA ААС CGC ACC ТТС GTC CTC ЛЛС ТТС ЛТС AAG ЛТТ ССС GTG GTC

LYS ARG ASN ARG ТНЙ РНЕ VAI, LEU ЛНП PIE IIX LYS ПЕ PRO ЪЛХ. 7М

355 360 365

GAG ЯС

GLU ASN

ОЛО GGC

GLU GLY

400

Х-7953А

1210 1220 1230 1240

GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC ТСС ХТС САС GGC АСС TGG ГГС CTG

ASP SER GLY GLY PRO ИЕТ VAL ALA SER PHE HIS GLY THR ТМ& РНЕ ЫИ

405 410 415

1250 1260 12?О 1280 1290

GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG СТС" CTl CAC ААС ТАС

ЧАТ GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

420 425 430

1300 1310 1320 1330 1340

GGC 6TT TAC АСС AAA GTC AGC CGC ТАС СТС GAC TGG ATC СЛТ GGG СЛС

GLY VAL TYR THR LYS VAL SER AR6 TYR LEU ЛЯР TRP ILE HIS GLY HIS

435 440 445 1350 1360 1370 1380

ATC AGA GAC AAG .GAA GCC ССС CAG AAG AGC TGG ОСА ССТ TAG-3

ПЕ ARG ASP LYS 610 ЫА РНО О?Л 17$ SER TRP ALA PRO-СООН

450 455 460

1110 1120 1130

CCG СЛС АЛТ GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC ААС

PRO HIS ASN GLU CYS SER iLU VAL ИЕТ SER ASN

370 . 375

1160 1170 ., 1180

ATG CTG TGT GCG GGC ЛТС СТС GGG GAC CGG CAG

MET LEU CYS ЛХ.А GLY ПЕ LEU G Y ASE ARG GLN

385 390 395

АХО GTG TCT

ИЕТ VAL SER

GAT GCC ТОС

ASP ALA CYS

1838411 где А — дезоксиаденил, G -дезоксигуанил, С вЂ” деэоксицитидил, Т вЂ” тимидил, ALA — аланин, APG — аргинин, ASN — аспарагин, ASP — аспарагиновая кислота, -СООН вЂ” карбоксильный конец, CYS — цистеин, GLN — глутамин, GLU — глутаминовая кислота, 61 У— глици!1, I-IIS — гистидин, Н2 — аминоконец, iLE — изолейцин, LEU — лейцин, LYS — ли.зин, MET — метионин, РНŠ— фенилаланин, PRO — пролин. SEB — серин, ТН — треонин, TRP — триптофан, TYR — тирозин, и VAL— валин.

Изображенная выше ДНК-последовательность происходит от клонов кДНК, полученных от мРНК печени человека, которая кодирует белок С человека, Каждому специалисту известно, что способность генетического кода к вырождению дает воэможность сконструировать много. различных ДН К-последовательностей, кодирующих одну и ту

>ке аминокислотную последовательность.

Таким образом, изображенная выше кДНКпоследовательность для раннего белка С человека является лишь одной из многих возможных последовательностей, кодирующих ранний белок С человека. При конструировании кДНК-клонов, 5 поли G последователы1ость, 3 поли С последовательность, и 5 и 3 - последовательности распознавания рестриктирующего фермента Ps(1 были построены у концов кДНК, кодирующей белок С. Два из указанных кДНК-клонов были модифицированы в целях построения ДНК-молекулы, содержащей кодирующую последовательность раннего белка С человека, а также участки

ДНК, кодиру1ощей нетранслированну!о мРНК у 5 и 3 — концов кодирующей области. Указа1гную ДНК-молекулу вводили в

Pst1-сайт плаэмиды рВР322 в целях построения плазмиды рНС7. Таким образом, плазмида РНС7 содержала вышеуказанную кодиру1ощую последовательность и указанные ниже дополнительные последовательности изображена лишь одна нить молекулы: 5 - CTGC AGG GGG GGG GGG GGG

GGG GG6 CTG ТСА TGG CGG CAG САС CGC

GAA CTT 6CA 6ТА TCT ССА CGA ССС GCC

ССТ ACA GGT GCC AGT GCC ТСС AGA — 3 и

5 - CGA ССС TCC CTG CAG GGC TGG GCT

ТТТ 6СА TGG САА TGG ATG GGA САТ ТАА

A6G GAC ATG ТАА САА GCA CAC CCC ССС

ССС ССС ССС ССС ССС ССС ССТ GCA G - 3 у концов 5 и 3 соответственно кодирующей нити последовательности, кодирующей ранний белок С человека. Благодаря комплементарности при спаривании оснований

ДНК, последовательности одной нити двухн иге вой ДН К-молекул ы впал не достаточно для определения последовательности про10

25 тивоположной нити. Плаэмида рНС7 может быть выделена стандартным способом иэ штамма Е.cali К12 RRI/рНС7, депонированного и являющегося частью постоянного фонда коллекции клеточных культур Северной региональной научно-исследовател ьской лаборатории (RR). Пеория, Иллинойс, Укаэанная культура Е,col! К12 РР! /рНС7 может быть получена из NRRl,. под входящим номером МВИ 8-15926. Сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды р IC7 представлены на фиг.2.

Ниже приводятсл так>ха схематическое изображение раннего белка С.

1 42 43 97 19S 199 200 21! 212 1() I ргс-pro С KR ЛР Л! IC

Ф 3 -I

-! !С рге-рго — аминокислотные ос7атки 1 — 42 раннего белка С человека, которые кодиру1от сигнальный пептид и пропе13тид белка С человека, играющие важную роль в направлении секреции и г"карбоксилирования белка С. ! С вЂ” аминокислотные остатки 43 — 197 ра1гнего белка С, которые после пост-трансляционной модификации содср>кат легкую цепь (! С) двухцепочечного з14могг.11а (обраэова11ного из одпоцепочечного эимогена путем удаления дипептида, KBK указано ниже) !1 активированных форм белка С;

KR — аминокислот11ые остатки 198 — 199 раннего белка С человека; указан «1ыа ос1атки, очевидно, могут быть удалены (на основе гомологии с бычьим белком С) с помощью

35 двухстадийного сг3особа, эак>ночающегосл сначала в расщеплении (либо между остатками 197 — 198, либо между оста7ками 199—

200), а затем в воздействии карбоксипептидазой или GI111110IIQI3TII/1Us031

40 с образованием двухцепо1счного белка С;

АР— аминокислотные оста ки 200-211 раннего белка С, содержащие пепгид активации, который удаля!от иэ эимоге1 ных форм белка С в целях получе11ия акгивированного белка С;

ЛНС вЂ” аминокислотные остатки 212 — 461 раннего белка С, которые после пост-трансляционной модификации содер>кат активированну1а тяжелую цепь (АНС) активного

50 белка С;

НС вЂ” тяжелая цепь двухцепочечной формы зимогена белка С которая после посттрансляционной модификац! Iи состоит lз аминокислотных остатков 200-461, АР и

55 АНС, Зимоген человеческого белка С является предшественником сериновой протеаэы, синтеэируемым в печени и присутству1ощим в крови. Для экспрессии новой биологичеcKoI4 активности белок C нуждается 13 пост13

1838411

14 трансляционной модификации, для которой необходим витамин К. Двухцепочечный, с дисульфидной связью зимоген белка С может быть получен из одноцепочечного зимогена путем ограниченного протеолиза.

Указанный ограниченный протеолиз, очевидно, включает в себя расщепление и удаление аминокислотных остатков 198 и 199.

Активация двухцепочечного зимогена в активную сериновую протеаэу представляет собой протеолитическое расщепление пептидной связи APG — LEU {остатки 211 и 212).

Указанное расщепление высвобождает до. декапептид (остатки 200 — 211), пептид активации, который включает в себя амино-концы большей (тяжелой) цепи двухцепочечной молекулы зимогена. Белок С является значительно гликосилированным; зрелый фермент из плазмы содержит 1523 углеводов. Белок С также содержит некоторое число редко встречающихся аминокислот, например, у-карбоксиглутаминовую кислоту и Р-гидроксиаспарагиновую кислоту (эритро-Ц3-гидроксиаспйртат), у-Карбоксиглутаминовая кислота (gia) может быть получена из остатка глутаминовой кислоты путем ) -глутамилкарбоксилирования с использованием микросомной карбоксилазы, для которой в качестве кофактора требуется витамин К. Ниже схематически представлена актинация белка С человека. При этом каждому специалисту известно, что порядок стадий, показанный на схеме, не обязательно отражает порядок стадий при метаболическом пути in vivo рге-pro-LC-KR=AP-AHC ранний белок.С пост-трансляционная модификация, т.е. у-карбоксилирование конкретных остатков глутаминовой кислоты, Р-гидроксилирование остатка аспарагиновой кислоты, и гликосилирование секреция, удаление остатков 1-42, которое может состоять из более. чем одного протеолитического расщепления

LC-KR-AP-ÀÍÑ одноцепочечный зи моген удаление остатков 198-199; около 90 зимогенного белка С, найденного в крови человека. является его двухцепочечной формой (S-S-дисульфидная связь)

4С

I активация тромбин- я g двухцепочечныи зимо ген

ДНС-ДК тромбомодулином 4С

1 активированный, < белок С

Изобретение относится к получению новых соединений, векторов. трансформантов и способов рекомбинантной экспрессии новых зимогенов белка С.

Были использованы следующие обозначения:

Ad2LP — главный подний промотор аденовируса типа 2.

Аминокислотные остатки в белках и пептидах обозначены аббревиатурами, представленными в табл.1, ApR — ампициллин — устойчивый фенотип или его несущий ген

ВК вЂ” ДЕК от ВК-вируса

Enh или энхансер — энхансер BK-вируса. ер или SV40 ер - ДНК - сегмент, содер. жащий SV40 — ранний промотор гена T-антигена. области связывания T-антигена, 40- энхансер, и точка инициации репли20 KaL;èè SV4G. у"карбоксилирование — реакция присоединения карбоксильной группы к глутаминовым кислотам у у-углерода. у-карбоксилированный белок — белок, в

25 котором некоторые остатки глутаминовых кислот были подвергнуты 1карбоксилированию, GBMT — транскрипционная единица— модифицированная единица регулирования

30 транскрипции, содержащая знхансер Р2

ВК-вируса, расположенный непосредственно выше регуляторного элемента главного позднего промотора аденовируса; поздний главный промотор аденовируса-2, элемент

35 поли-GT, с1 имулирующий указанный промотор, и ДНК-последовательность, содержащую разделенную на три части сплайсерную лидерную последовательность аденовируса. G BMT — транскрипцион40 ная единица находится приблизительно на

HlflcIIII - рестриктиционном фрагменте 900 п.с. плазмиды pGTIV - ДН К, кодирующая интрон, так называемая внедряющаяся последовательность, 45 MMTpro — промотор мышиного гена металлотионеина-1.

Ранний белок -полипептид,продуцированный после трансляции мРНК-транскрипта. до любых пост-трансляционных

50 модификаций. Однако пост-трансляционные модификации, такие, как карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспаргиновой кислоты, могут иметь место перед тем, как

55 белок будет полностью транслирован о м P Н К-тра нскрипта, NoeR - ген, несущий устойчивость к неомицину, который .может быть также использован для переноса устойчивости к антибиотику 6418.

1838411

16 клетку-реципиент ДНК, измсняющую генотип указанной клетки-реципиента. 45

55 рА - ДНК - последовательность, кодирующая сигнал полиаденилирования, Промотор - ДНК-последовательность, которая направляет транскрипцию ДНК. в

РН К.

Активность белка С вЂ” любое свойство белка С, ответственное эа протеолитическую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую антикоагулирующую или профибринолитическую активности, Методы испытания белка на антикоагулирующую активность хорошо известны, Вектор клонирования рекомбинантной

ДНК - любой агент, например агент хромосомной интеграции, автономно реплицирующиеся плазмиды, и фаги, содержащие

ДНК-молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных

ДН К-фрагментов.

Вектор экспрессии рекомбинантной

ДН К - любой вектор клонирования рекомбинантной ДНК, в который вводят промотор в целях стимулирования генного продукта. .Вектор рекомбинантной ДНК вЂ” любой вектор клонирования и экспрессии рекомбинантной ДН К.

Репликон - ДНК-последовательность, контролирующая и направляющая автономную репликацию плазмиды или другого вектора.

Фрагмент рестрикции — любая линейная ДН К-последовательность, генерированная с помощью одного или нескольких рестриктирующих ферментов, Восприимчивая клетка-хозяин — клеткахоэяин, которая неспособна развиваться в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединения, если отсутствует ДНК-сегмент, несущий уСтойчивость к данным соединениям.

TcR — тетрациклин — устойчивый фенотип или ген, несущий указанный фенотип.

Трансформация — введение в хозяйскую

Трансформант — хозяйская клетка-реципиент, подвергнутая трансформации.

Трансляционйая активирующая последовательностьть — любая ДН К-последовательность, включающая последовательность, кодирующую область связывания с рибосомой и кодон инициации трансляции, такой, как 5 -ATG - 3, который обеспечивает трансляцию мРНК-транскрипта в пептид или полипептид.

Зимоген — ферментативно неактивный предшественнйк протеолитического фермента. Используемый в настоящем описании термин "зимоген белка С" относится к

40 секретируемым неактивным одноцепочечным или двухцепочечным формам белка С.

На фиг. 1 представлены рестрикционный сайт и функциональная карта плазмиды

pLPC-Q097; на фиг.2 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC0248; на фиг,3 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды pLPC-0313; на фиг.4 — сайт рестрикции и фун кционал ьн а я карта плазмиды pLPC-Q329; на фиг.5 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды РОТС; фиг, 6 представляет собой сайт рестрикции и функциональную карту плаэмиды pGT-d; нэ фиг.7 — сайт рестрикции и функциональная карта плазмиды РОТ-I>, Изобретение позволяет получить ДНКсоединения, кодирующие. экспрессию новых зимогенных форм белка С человека, Некоторые способы получения зимогена нативного белка С человека и раннего белка С человека известны. Способы прототипов направлены на экспрессию зимогенных форм белка С человека, аминокислотная последовательность которых не отличается от аминокислотной последовательности эимогенных форм, присутствующих в крови человека. При экспрессии в„определенных линиях эукариотических клеток, таких, как линия 293 клеток почки человека, секретируется зимоген нативного белка С человека с новым типом гликосилирования, который отличается от формы зимогена, обнаруженного в крови человека.

Изобретение относится к получению эимогенных форм белка С человека, которые имеют измененные типы гликосилирования вследствие сайт-направленных изменений в последовательности аминокислотных остатков. указанные активированные зимогенные формы имеют более высокую амидолитическую и антикоагулирующую активность по сравнению с нативным белком

С человека. Изобретение также относится к

ДНК-соединениям, векторам экспрессии рекомбинантной ДНК, линиям трансформированных клеток и способам рекомбинантной экспрессии указанных новых зимогенных форм белка С человека, Способ продуцирования ухазанных форм зимогена белка С человека заключается в том, что:

А) эукариотическую хозяйскую клетку

lр,ансформируют с помощью фактора рекомбинантной ДНК, причем указанный вектор содержит: (i) ДНК-последовательность, кодирующую последовательность аминокислотных остатков, которая от аминоконца до карбоксильного конца включает в себя следующую аминокислотную последовательность. t838411

x — 7953 A

10 fKT TRP (ЛЛ LKU THR SER IXU LEU LEU РНЕ VAL ALA ПВ TRP GLY ILE

SER GLY T«lR PRO ALA PRO LEU А$Р SFR VAL РНЕ SER SER SER GLU ARG

ALA HIS GLN VAL LKU ARG ILE ARG LYS ARG Л?А ASN SER PHE LEU GLU

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG СЫ CYS ILE GLU GLU ILE CYS

ASP PHE GIU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAI, ЛЯР ASP ТНВ LEU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAI, ASP GLY ASP GLN CYS LEU ЧАТ; LEU PRO

LEU GLU «ПБ PPO CYS ALA SER LEU GYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ПЕ

ASP GLY ПЕ GLY SER РНЕ SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY

ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER РНЕ LEU 21 CYS SER LE«J ASP ASN

GLY GLY CYS ТЫЛ HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU СЬУ ЛБР ASP LEU LEU GLN CYS !ПБ

PRO ALA VAL LYS РНЕ PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG ИЕТ GLU LYS

LYS ARG SER «ПБ LEU LYS ARG ASP THR GLU АБР GLN GLU ASP GLN VAL

35

ASP PRO ARG LEU ПЕ ASP СТ,Ъ IYS ИЕТ Т«П ARG ARG GIY ASP SER PRO

ТВР С?Л ЧЛЬ ЧЛТ.,Е«« ЪЕ«« ЛБР ЯЕВ ЬУБ ЬУЯ ЕУБ ?Е«« ЫЛ СУЯ GLY ALA

VAL LEU ILE JlIS,PRO SER TPP VAL LKU TER ALA ALA HIS СУЯ ИЕТ ЛЯР

GLU SER LYS

Х-7953А

TRP СЫ LYS

LYS LEU LEU

TRP GLU LEU

LYS ARG Вз ЛКС THR PHE VAL LEU ASN PHE IIE LYS ПЕ PRO VAL VAL

PRO HIS R4 GLU CYS SER GIU VAL ИЕТ SER ASN ИЕТ VAI. SER GLU ASN

ИЕТ LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GIY

ASP SER GLY GLY PRO ИЕТ VAL ALA SER PHE «ПЯ GLY T«IR TRP PHE LEU

VAL GLY LEU VAI, SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR

GLY VAL TYR ТНЯ IYS VAL SER ARG TYR LEU АБР ТИ. ILE HIS GLY HIS

ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SEP, TRP ALA PRQ-COOH

PRO Rg TYR SER LYS SER

IEU AIÀ СТ«« РВ0 АХ.А Т«В

PRO ASP SER GLY LEU ALA

THR LEU VAL THR GLY TRP

VAI. АРС LEU GLY GLU TYR ASP LKU ARG ARG

ASP СКЦ ASP ILE LYS GLU VAL P«K VAL «ПБ

THR T««R ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS

LEU ЯЕР GLN THR П.Е VAL PRO П.Е CYS LEU

GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY ИЛ GLU

GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

1838411

20 м

O где В1 выбирают иэ группы. содержащей

ASN и GIN, Rz выбирают из группы. содержащей ASN и GIN, Вз выбирают из группы, содержащей ASN u GIN и Из выбирают-из группы, содержащей ASN и GIN; R4 выбирают из группы, содержащей ASN и GIN; (П) промотор для регулирования экспрессии укаэанной ДН К-последовательности;

В) хозяйскую клетку, трансформированную в стадии (А) культивируют при условиях, способствующих экспрессии указанной

ДНК-последовательности и

С) указанный зимоген белка С выделяют из культуры, Изобретение также относится к ДНКсоединениям, используемым в целях получения новых зимогенных форм белка С человека, Все укаэанные соединения кодируют препропептид, содержащий сигнальный пептид для направления секреции и пропептид из у-карбоксилированного (посредством воздействия витамин К-зависимои карбоксилаэы), белка. Такие пропептидные последовательности хорошо известны специалистом. См., например, Su>tie и др., 1987, Proc.Matt, Acad. Sei.

34:634-637. Предпочтительно для простоты конструирования, если последовательность, кодирующая сигнальный пептид, и последовательность, кодирующая пропептид, будут происходить от аминокислотной последовательности пре-пропептида у-карбоксилированного белка. Примерами таких у-карбохсилированных белков являются (но не ограничиваются ими) фактор Vll, фактор

IX, фактор Х, протромбин, белок S, белок Z и белок С, ДНК-последовательность, .кодирующая пре-и ропептид белка С человека является предпочтительной для введения в вектор настоящего изобретения, Кроме того, ДНК-соединения изобретения содержат последовательность кодирования для легкой цепи белка С человека, которая расголожена непосредственно за пре-пропептидкодирующей последовательностью и втрансл,яционной рамке считывания. Легкая цепь белка С человека содержит аминокислотные остатки от 43 до 197 включительно, раннего белка С, как указано выше. Амино-концевые части витамин

К-зависимых белков плазмы, также, как амина-концевая часть легкой цепи белка С, имеют область связывания C кальцием, Области связывания с кальцием указанных белков плазмы, таких, как фактор Vil, фактор IX, фактор У., протромбин и белок S могут быть использованы аналогично областям связывания с кальцием легкой цепи белка С чело10

50 века. В одной из новых форм зимогена (097) изобретения остаток аспарагина в положении 139 в легкой цепи заменяли на остаток глутамина. удаляя тем самым область гликосилирования.

ДНК-соединения изобретения, кроме того, содержат последовательность, кодирующую дипептид LYS-ARG (KP), которая расположена непосредственно за последовательностью, кодирующей легкую цепь и в трансляционной рамке считывания с этой последовательности. Двухосновный дипептид, такой, как LYS — APG расположен в раннем белке со стороны карбоксильного конца легкой цепи. Ориентация дипептида

LYS-ARG в экспрессированном белке не относится к целям изобретения. Для целей изобретения, двухосновные дипептиды, такие, как LYS — LYS или ARG ARG, эквивалентны дипептиду LYS — ARG. Однако для целей изобретения, дипептид LYS — ARG, который представляет собой дипептид нативного белка С человека, является предпочтительным.

Непосредственно ниже за кодонами для LYS — ARG-дипептида расположена последовательность, кодирующая пептид активации. При этом следует отметить, что зимогены изобретения в основном отличаются от нативных форм зимогенов белка С человека, описанных ниже.

Кроме того, другие замещения аминокислот, в дополнение к замещению в положении 139 в легкой цепи, также может способствовать:усилению амидолитической и антикоагулирующей активностью полученного эимогена. Выражение "полученный зимоген" указывает на то, что, хотя замещения описываются со ссылкой «а положения в раннем белке С человека, однако ранний белок С человека должен быть сначала выделен (в результате удаления аминокислотных остатков от 1 до 42) для получсния эимогенной формы. Таким образом, замещение остатка аспарагина в положении 139 (в раннем белке С человека) остатком глутамина приводит к новой форме эимогена настоящего изобретения, Замещение остатка аспарагина (в активированной тяжелой цепи) в любом иэ положений 290, 355 или 371 остатком глутамина привоДит к новой форме зимогена изобретения.

Таким образом предпочтительные новые формы зимогена белка С человека изобретения могут быть получены в результате секреции и процессинга молекул раннего белка С человека, имеющих следующую аминокислотную последовательность:

22

1838411 х- в зА

ИЕТ TRP GLN LEU THR SER LEU

SFR GLY THR PRO АХА PRÎ LEU

ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER РНЕ I.ÅU GLU

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU

ASP PHE GLU GLU ALA IYS GLU

ALA PHE TRP SER LYS HIS VAI ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO

LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY ТНВ CYS ПЕ

ЛЯР GLY ILE GLY SKR РНЕ SKR CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP FLU GLY

ARG РНЕ CYS GLN ARG GLU VAL SER PIIE LEU R CYS SKR LKU ASP ЛЯК

GLY GLY CYS ТНВ HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS

SER CYS ALA PR0 GLY TYR LYS LKU GLY ASP ЛЯР LEU LEU GLN CYS НЕЯ

РВО АХЛ ЧАХ. ХУЯ РНК РВО СУЯ ОХ,У АВО РВО ТВР ХУЯ АВС МКТ 6Ы ХУЯ

35 - 79535

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL

GLY LYS ИЕТ ТНВ ARG ARG GLY ASP SKR PRO

ASP PRO ARG LKU ПЕ АЯР

VAI, LEU LEU ASP SER IYS LYS LYS LKU ALA CYS GLY AIA

HIS PR0 SKR TRP VAL LEU ТНВ ALA ALA HIS CYS ИКТ ASP

TRP GLN VAL

ЧАХ LEU ПЕ

GLU SER LYS LYS LEU LEU VAI ARG LEU GLY GLU TYR ASP LKU ARG АВС

TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LKU ASP ILE LYS GLU VAL РНЕ VAL HIS

PRO Rg TYR SER LYS SER ТНВ НП ASP ASN ASP ILE ЛХА LKU LEU HIS

ILE ЧЛХ PRO ILE CYS LEU

Х,Е1Х SKR GLN ТНВ с

GLU ARG GLU LEU

ЛЯБ GLN ALA,GLY GLN GLU

THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA

LYS ARG Вз ARG THR РНЕ ЧАХ LEU ASN РНЕ П,Е LYS LE PRÎ ЧАХ VAL

PR0 HIS R4 GLU CYS SKR GLU ЧЛХ ИКТ SER ASN МЕТ ЧАХ SER GLU ASN

MET LEU CYS ALA GLY ПЕ LEU GLY ASP ARG GLN ЛЯР ALA CYS GLU GLY

ASP SER GLY GLY PRO LENT VAL ALA SER PHK kkIS GLY TkkR TRP PkiE LEU

VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS

GLY ЧАХ TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU

GLY LEU LEU HIS ASN TYR

ASP TRP П.Е HIS EELY HIS

ПЕ ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN ЛЯ SKR TRP ALA PRO-СООН

LEU ALA GLN PR0 ALA THR

25 PRO ASP SER GLY LEU ALA

LEU LEU PHE VAL ALA TliR ТВР GLY П,Е

ASP SER ЧЛХ РНЕ SER SKR SER GLU ARG

GLU ARG GLU CYS ПЕ GLU GLU ILE CYS

1 с

ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

1838411 где R ) выбирают иэ группы, содержащей

ASN и GIN, Rz выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, йз выбирают из группы, содержащей ASN и GIN, и R4 выбирают из группы, содержащей ASN u GIN.

Новый зимоген Q,097 включает замещение остатка аспарагина в положении 139 остатком гпутамина. Зимоген 0,248 включает замещение остатка аспарагина в положе10

15 нии 290 остатком глутамина, Зимоген Q,313 включает в себя замещение остатка аскарагина в положении 355 остатком глутамина, а зимоген 0.329 включает в себя замеЩение остатка аспарагина в положении 371 остатком глутами <а.

При этом следует отметить, что вследствие вырождения генетического кода некото рые ДНК-соединения могут кодировать изображенный выше полипептид. Следова20 тельно, описанные ниже конструкции и примеры получения предпочтительных

ДНК-соединений, векторов и трансформантов изобретения являются всего лишь иллюстративными и не ограничивают объема изобретения, Кроме того, замещение GIN

25 вместо ASN является иллюстративным и не ограничивает объема настоящего изобретения, поскольку могут быть использованы и другие.заiлещения, за исключением CYS или PRO. К тому х<е следует отметить, что

30 ченный для усиления экспрессии от промотора, Векторы были трансформированы в Е.coll К12 AGI êëåòêè и депонированы в основном фонде клеточных культур Северс ной региональной исследовательской лаборатории в Peoria, Иллинойс 61604 от 9 января 1990 r. Конкретные культуры, даты депонирования и входящие номера представлены в табл.2.

С помощью стандартной техники получают культуры и выделяют плаэмиды, кото45

55 рые затем тра нсфецируют непосредственно в хозяйские эукариотические клетки в целях прордуцирования зи логенных форм белка человека С. Плаэмиды предпочтительно трансформировать в хо зяйские клетки, которые экспрессируют не \ различные замещения отдельных. аминокислот настоящего изобретения могут сочетаться для создания новых зимогенов, Все ДНК-соединения изобретения были получены посредством сайт-специфическо- 35 го мутагенеза гена белка С человека. Подвергнутые мутагенеэу зимоген-кодирующие молекулы затем вводили в эукариотические векторы экспрессии для осуществления экспрессии генов зимогенов с помощью глав- 40 л ного позднего промотора аденовируса-2.

Указанные векторы содержат также элемент знхансера Р2 ВК-вируса, предназнапосредственно ранний генный продукт аденовируса EIA, поскольку BK-энхансер. действующий на векторной основе, наиболее эффективно усиливает