Способ получения рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей бычий гормон роста, способ биосинтеза производного бычьего гормона роста

Способ получения рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей бычий гормон роста, способ биосинтеза производного бычьего гормона роста

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: генетическая инженерия , биосинтез белков, в частности бычьего гормона роста. Сущность изобретения: рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие бычий гормон роста получают в результате лигйрования фрагмента BamHI-Xbal плазмиды pCZ101 размером 10,2 kb или BamHI-EcoRI фрагмента той же, плазмиды с Ipp промотором и репликоном, теряющим контроль числа копий при 30°С, с BamHI- Xbal .фрагментом плазмиды pCZ101 или pCZ106 размером 0,6 kb, кодирующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды. кодирующие последовательность активации трансляции, стартовый кодон и кодон для N-конца производного бычьего гормона роста. Способ биосинтеза состоит в том, что культивируют штамм Escherlchia coli, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pCZ110, или pCZ153. или pCZ154, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 15 ил. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N.15/18, 15/70

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПЛТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОсплтент сссР) «

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 3867006/13 (22) 04,03.85 (46) 30.08.93. Бюл, N. 32 (31), 586582; 634920 (32) 06,03.84; 26.07,84 (33) US (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Хансен Максвелл Хсиунг (СА) и (TW), Рональд Джордж Шонер и Бригитте Элизабет Шонер (US) (56) Е P N. 0075444, кл. С 12 N 15/00, 30.03.83. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ БЫЧИЙ ГОРМОН РОСТА, СПОСОБ

БИОСИНТЕЗА ПРОИЗВОДНОГО БЫЧЬЕГО ГОРМОНА РОСТА (57) Использование: генетическая инженерия, биосинтез белков, в частности бычьего гормона роста. Сущность изобретения: рекомбинантные плазмидные ДНК, кодируюИзобретение относится к новым селективным и автономно реплицирующимся

В6КТораМ экспрессии, рекомбинантной

ДНК, которые состоят из транскрибируемой и транслируемой. активированной нуклеотидной последовательности, находятся в рамке считывания гена, который кодирует биоактивное производное бычьего гормона роста (бГР), и репликона, который в индуцированных условиях утрачивает контроль числа копий.

Изобретение относится также к способу биосинтеза бычьего гормона роста с использованием указанных векторов.

Развитие и эксплуатация технологии рекомбинантной ДНК для получения бГР были сильно затруднены проблемами экспрессий Ы«„1838412 АЗ щие бычий гормон роста получают в результате лигирования фрагмента BamHI-Xbal плазмиды pCZ101 размером 10,2 kb или

BamHI-EcoR1 фрагмента той ж плазмиды с

Ipp промотором и репликоном, теряющим контроль числа копий при 30 С, с BamHIXbal .фрагментом плазмидьг pCZ101 или

pCZ106 размером 0,6 kb, кодирующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды, кодирующие последовательность активации трансляции, стартовый кодон и кодон для N-конца производного бычьего гормона роста. Способ биосинтеза состоит в том, что культивируют штамм

EscherIchia cali, трансформированный рекомбинантной плазмидндй ДНК рС2110, или pCZ153, или pCZ154, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 15 ил, гена. Некоторые иэ этих проблем, детально описанные в заявке на Европейский патент

N 0075444,, включают транскрипцию функционально субоптимальной мРНК. Такая мРНК имеет вторичные конфигурации стержня и петли, что препятствует нормальному рибосомному связыванию и таким образом резко снижает или даже предотвращает бГР экспрессию. Изобретение разрешает эту проблему, обеспечивая векторы для высокого уровня экспрессии производных бГР.

На фиг.1 — 4 изображена схематическая иллюстрация протокола конструирования плазмиды pNM575; на фиг.5-8 — схематическая иллюстрация протокола конструирования плазмиды pNM7898; на фиг.9 — карта сайта рестрикции плаэмид рС21920 и pJR1:

1838412

ATG слт ттт ссс сст лтс тст

ЮС ° ° i 1 ° 1 ° .111 11 С

TAC CTA AAA ССС Ct!Л TAC ACA

ATG АЛЛ GGG ЛЛТ ТСТ ATG GCC TTC

Ф II III III I! III III ° С

TAC ТТТ CCC ТТА АСЛ TAC CGG AAG (5) 5

3 (1) 5

3 стс тсс ссс 3 .а-а

CCA CCC ATC ТСС ТТ0 ТСС CGC

111 Iс tс II ФФI ° I а а

CGT CGG ThC ACG ААС AGG CCG а

ATC ТТТ CCA CCT.ATC TCT СТА

I I

ATG GAT CAT AhG ТТТ CCG CCT ЛТС

1 I\ III 11 11\ С\ 111 ° II

TAC CTA СТА TTC ААЛ CGC CGA TAC (6) 5

3 (2) 5

Э тлс ллл Сст ccA TAG hch GAT

10 тст стс тсс Gcc 1 э

°, -а-а1

AGA GAC ACG CCC 5, TCT CCT 3

1 I

ACA CCA 5

15 лтс GTT ттт ccc ccT ATG TcT

1 I t С I \ С I I I Ю I Ф

ТЛС CAA AAA CCC CGA AGA

Атс Ттт ccA ccc лтс ccT cTA

1 I ° \11 1 11 °

TAC AAA CGT CCC ТАС CCA CAT (1) 5

l3) 5

20

TCT CCT 3 CTG TCC СГС 3

I I

GAC ACC CCC 5

СТА

I I

СAT

ATG TTC CCA GCT ATG TCT (4) 5

ОГ

l0

t I

TAC AAG CCT CCA TAC AGh (0) 5 Атс сст ттт ccc ccT ATG TGT

I ° с I

Э TAC CGA AAA С СС ССЛ ТАС ACA

ТСТ CGT с \ I а а

ЛСЛ ССЛ 5

15

CTG ТСС CTC

11 11 Фю а а

GAC AGG CAG

R1 является последовательностью ДНК, которая кодирует транслируемый стоп-сигнал, который представляет собой где А является деоксиаденилом;

ЭО

5 TAA

Э АТТ

3 5 ТЛС 3

5, 3 ЛТС 5, и(н

) 5 TCA

Э ACT

Э

Векторы настоящего изобретения могут :: связывания следующих Xbal-H Al линкербыть сконструированы путем независимого 40 ных последовательностей ДНК: а) 5 CTAGAGCGTATTAATA ATG AAA CCC AAT TCT ATC

tltt 1 1 Ю 1 тссслтллттлт тлс ттт ссс ттл лсл тлс ссс ттс ссА ссс лтс тсс ттс тсс ссс стс

11 ° 111 IСI 111 \ 1 111 Ю

CGG AAG CCT CCG TAC AGC АЛС ACC CCG GAC

TTT GCC AAC CCT CTGCT 3

1 I IIIIIII

ААА CGG TTG CCA С . 5

b) 5 CTAGACCGThTThhTh6 ATG TTT CCA GCC ATG CCТ с Ф 1 I I I II I I I I I

Э TCCCAThhTTAT ТАС AAA GCT ССС ТАС ССА

CTA TCT GCT CTG ТТТ ССС AAC ССТ CTGCT 3

111 II I I I \ I I ° 111111

ChT ACA CCh GAC hAA CCC ÒÒG ССЛ С 5

CTAGAGGGTATTAATA ATG ТТТ CCA GCT ATG TCT

1 ° I I I I 1 Ф I I \ 1 1 I С I I С 1 С

TCCCATAATThT TAC ллл сот CGA TAC AGA с) 5

Э

CTA ТСТ ССТ CTG ТТТ CCC AAC CCT GTGCT 3

I I I t I t I I f \ I 1 С I I I \ I I

СЛТ АСЛ CCA СЛС ААА CCG TTG CGA С 5, на фиг,10 — карта сайта рестрикции плазмиды pCZ112; на фиг,11 — синтетический ген тимозин альфа 1, на фиг.12 — flpoтокол синтеза нуклеотидного фрагмента

Т15, на фиг,13 — протокол конструирования г)лазмиды рНп а1; на фиг.14 — протокол конструирования плазмиды pH17h4A1. на фиг.15 — протокол конструирования плазмиды рН1104, G — деоксигуанилом;

С вЂ” деоксицитидилом;

Т вЂ” тимидилом;

R — последовательностью ДНК, которая кодирует аминокислоты 9 (лейцин) по 191 (фенилаланин) бычьего гормона роста;

Селективный автономно реплицирующий рекомбинантную ДНК вектор экспресии в соответствии с изобретением состоит из неконтролируемого репликона и транскрибируемой и транслируемой активиру)ащей последовательности, которая находится в рамке считывания гена, который кодирует биоактивное производное бычьего гормона роста, причем ген является

1838412

TCT CTG TCC GGC CTG TTT GCC

hGA GAC hGG CCG GhC ЛЛЛ ССГ.

Зо

3 ллс сст GTGcT

ТТГ CGA С

35 стс ттт ссс ллс сст стсст з

I I II 3!

GAc ллл cGG ттс cGA c 5 ло

ТсТ стс тсс стс стс ттт Gcc

hÑË СЛС ЛСГ СЛС .ЛС АЛЛ Ссс

)о. Алс сст стсст ттс cch c 5 з, GGc cTG ттт ссс Ahc сст стсст! II LII II I I t I

CCG GAC Ahh ССС TTG CGA С

5О

5

n) зо тст сто тсс ссс сто ттт Гсс

ЛСЛ GAC ЛСС ССС ГЛС ЛЛЛ ССГ ллс сст стсст 3

t ттс cGA c 5

)о

35 во фрагменты примерно 10.2 kb BamHI-Xbal и 0,6 kb BamHI-Hgl AI плазмиды pCZ101.

Полученные в результате плазмиды обозначают соответственно как плазмиды

pCZ1920, pJRI и рАТ2, они содержат транслируемую и транскрибируемую активирующую последовательность липоп ротеинового гена Е. coll (Nakamura and Inouye

1979, Cell 18:1109) при считывании каркаса кодирующей последовательности для биоактивного производного бычьего гормона рОста; соответственно размещенный транслируемый стоп-сигнал; и репликон неконтролируемого роста. Клетки, трансформированные плаэмидами

pCZ1920, pJR1 и рАТ2 соответственно, экси рессируют М ЕТ-LIS-CLY-ASPN-SER-М ETALA-бГР, МЕТ-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R u

МЕТ-бГР, где

МЕТ является метионином, 20

LI S — лизином, *) 5 сслсс лтс слт GAT ллс ттт ссс сст ATG тст

t тсс тлс стл стл ттс ллл Gcc сГА тлс лсл сто тсс ссс стс ттт Гсс ллс сст стсст з !

GAc hGG ccG Ghc ллл cGG ттс cGA c 5

4 ь) cchch ATG ттс ссА сст лтс тст стл тст сст

3 TGT тлс ллГ ССт CGA TAC AGA GAT AGA CCA

cGAcc ATG GAT ттт ccG GcT ATG тст стс тсс

1 тсс тлс стл ллл ссс ссл тлс лсл слс лсс

CGATC ATG GAT ТТТ CCG GCT ATG TCT CTG TCC тлс тлс cTA AAA Gcc ссл тлс AGA слс AGG ссс стс ттт ссс ллс сст GTGcT з

I 1 I t I I

CCG GAC AAh CGG ттС CGA c

I где А является деоксиаденилом, G — деоксигуанилом, С вЂ” деоксицитидилом, Т вЂ” тимидилом, 45 во фрагменты примерно 10 kb EcoRIBamHI и примерно 0,6 kb Ватн!-Hgl А! плазмиды pCZ101 и фрагмент примерно

0,29 kb EcoRI-Clal плазмиды pNM608. Полученные в результате плазмиды, обозначен- 50 ные соответственно как плазмиды pCZ112, рАТ1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 и

pCZ156, содержат транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность триптофанового гена Е. coll 55 (HallewelI and Emtage, 1980, Gene 9:27) в рамке считывания кодирующей последовательности для биоактивного производного

Gl Y — глицином, ASPN — аспарагином, SER — серином, ALA — аланином, РНŠ— фенилаланином, PRO — пролином, бГР— природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейся с N-терминального (первого) фенилаланина.

R является природной аминокислотг ной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейся с шестой аминокислоты (лейцина) от N-терминала.

Карта сайта рестрикции каждой из плазмид pCZ1920 и pJR1 представлена на фиг.9.

Дополнительные плазмиды, которые также входят в область настоящего изобретения, могут быть сконструированы независимо связыванием следующих линкерных последовательностей ДН К Тац)+! 9) Ai: е) 5 сслсс лтс стт ттт ссс ссг лтс

3 TGG тлс CAA AAA GGC CGA тлс

f) 5 cGAcc ATG TTT ссс сст лтс

3 тсс тлс ссл ллл асс ссл тлс

g) 5 СГЛТА АТС СЛТ ТТТ ГСГ GCT ATG

3 TAT TAC CTA AAA GGC CGA TAC бычьего гормона роста; соответственно помещенный транслируемый стоп-сигнал и неконтролируемый репликон, Клетки, трансформированные плаэмидами pCZ112, рАТ1, pASP1, pASP2, рС2154, pCZ155 и

pCZ156, соответственно экспрессируют

MET-ASP-ASP-LYS-бГР, МЕТ-бГР, METASP-бГР, МЕТ-ASP-бГР, MET-НА(-бГР, МЕТ-ALA-PHE-PRO ALA MET-SER-IEU-SERНА1 -б ГР и MET-ASP-бГР,;де

МЕТ является метионином, ASP — аспарагиновой кислотой, LEU — лейцином;

SER — серином.

PRO — фенилаланином, LYS -лизином. НА1 — валином, ALA — аланином, 1838412

40

50

55 б ГР является природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейся с аминокислоты 9, лейцина; бГР является природной аминокислотной последовательностью, начинающейся с

N-терминального„(первого) фенилаланина.

Карта сайта рестрикции иллюстративной плаэмиды pCZ112 представлена на фиг.10, Плазмида рС2101 исходного материала содержит примерно 10,8 kb и сконструирована лигацией фрагмента примерно 0,6 kb

Xbal-BamHI плазмиды pNM789B в подобным образом переваренную плазмиду

plM-1 -АЗ. Последняя плазмида, которая содержит транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность липопротеинового гена Е. coii, а также и репликон неконтролируемого роста, может быть получена из Е, coli K12 RV308/plM-1, АЗ, штамма, депонированного и составляющего часть постоянно хранящейся коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс. Штамм является доступным как предпочтительный источник и хранилище плазмиды под регистрационным номером

ИВВИ3 В-15733. Исходный материал плазмида pNM789B происходит из плазмиды

pKEN111 в соответствии со стадиями, иллюстрированными и описанными на фиг.1—

8 и в примере I ниже. Плазмида рКЕ111 может быть получена из Е, coli К12

СС620/pKEN111 штамма, депонированного и являющегося частью постоянно хранящейся коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеория, Иллинойс. Штамм является доступным как предпочтительный источник и хранилище плазмиды под регистрационным номером МВВ1 8-15011. Плазмида

pNM789B также содержит транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность липопротеинового гена

Е.coli и, кроме того, кодирующую последовательность, включающую соответственно расположенный, транслируемый стоп-сигнал, для конденсированного протеина, включающего бГР и девятичленный полипептид у бГР N-терминала. Лигирование последовательности, кодирующей конденсированный протеин, содержащийся в фрагменте Xbai-BamHI, к соответственно расщепленной плазмиде plM-1 -АЗ приводит в результате в вышеупомянутой плазмиде pCZ101 исходного материала.

Исходный материал плазмиды рМ608 содержит примерно 4,6 kb и сконструирована путем лигации фрагмента EcoRI-Cial плазмиды рН17 Л4Л1 в EcoRI-Clal — пере5

30 варенную плазмиду рВ,322. Плаэмида рН17 Ь4 Л1 может быть сконструирована в соответствии с методикой примера 5 ниже, Иэ-за множественности сайтов рестрикции

Та 1 в плаэмиде рН17 h4 Ë1 желаемый фрагмент EcoRI-Tagl лучше всего может быть генерирован субклонированием фрагментов рН17 Л4 Л1 EcoRI-Hpal u Hpal-Tagl., Плазмида pNM608 содержит Е. coll триптофан транскрибируемую активирующую последовательность и, следовательно. является полезной для конструирования в изобретении.

Специалисты в данной области должны знать, что различные линкеры ДНК, описанные выше, являются важными компонентами изобретения. Эти последовательности могут быть удобно синтеэировзны с помощью модифицированного фосфор-триэфирного метода, использующего полностью защищенные дидеоксирибонуклеотидные строительные блоки. Такие методы синтеза хорошо известны на данном уровне техники и могут быть осуществлены по существу в соответствии с методикой Итакуры и др„

1977, Science, 198; 1056; и Крив с сотр., 1978, Pro, Nat, Acad, USA 75:5765. Кроме того, особенно предпочтительный способ описан в Hsiung et al„,1983. Исследование нуклеиновых кислот 11:3227, и Narang ec ai., 1980.

Методы вэнзимологии 68:90. Линкеры коди-. руют транслируемую активирующую r ocëåдователъность и также аминокислоты, составляющие первый участок (N-терминальную область) вышеупомянутых производных бГР. Остальная кодирующая последовательность бГР (включая соответственно расположенный. транслируемый стоп-сигнал) и также транскрибируемая активирующая последовательность могут быть обеспечены лигацией соответствуащего фрагмента плазмиды pCZ101. Такие лигации приводят в результате к иллюстративным плазмидам экспрессии производно;,.

ro бычьего гормона роста изобретения. „. I

Деления фрагмента рестрикции примерно 900 пар оснований ВзсЕ11 плазмиды

pCZ101 с последующей перециркуляриза-. цйей приводит в результате в плазмиде

pCZ103. BstE11 делеция не оказывает воздействия на область кодирования бГР в плазмиде pCZ101, Используя плаэмиду

pCZ103 вместо плазмиды pCZ101 в вышеупомянутых конструированиях получают в результате подобные плазмиды, но меньше

900 пар оснований. Производные бГР, экспрессируемые этими происходящими из

pCZ103 плазмидами, следовательно, являются идентичными производным, экспрес1838412

10 сируемым происходящими иэ рС2101 их дубликатами.

Итак, используя фрагменты рестрикции плазмиды pCZ103 примерно 9.3 kb BamHIXbai и примерно 0,6 kb BamHI-Ho Al вместо фрагментов рестрикции плазмиды pCZ101 примерно 10,2 kb BamHI-Xbal и примерно

О,:6 kb BamHI-Hgi Al a вышеупомянутых конструированиях из плаэмид pJ1 и рАТ2 получают в результате конструкцию производных плазмид р.1К1.3 и рАТ2.3 соответственно. Используя фрагменты рестрикции плаэмиды pCZ103 примерно 9,3 kb

Вап Н!-Есор! и примерно 0,6 kb BamHI-Hgi

AI вместо фрагментов рестрикции плазмиды pCZ101 примерно 10,2 kb BamHI-EcoRI u примерна0,6 kb ВamHI-Hgi Al в вышеупомянутых конструированиях из плаэмид рАТ1, рМР1, pASP2, pCZ154, рС2155 и pCZ156 получают в результате конструкции производных плазмид рАТ1.3, pASP2.3, pCZ154.3, pCZ155.3 и pCZ156.3 соответствен но. Изрбретение никоим образом не ограничивается использованием конкретной транскрибируемой активирующей последо вательностью, так как выбор определенной последовательности не является критическим для работоспособности изобретения. . Транскрибируемые активирующие последовательности, которые могут быть заменены ранее описанными липопротеиновой и триптофановай активирующими последовательностями, включают, но не ограничиваются Е, coli лактознай (lac), бактериофаговой ilPz0z и бактериофаговой

APE(0$ транскрибируемыми активирующими последовательностями. В дополнение к этому одна или несколько транскрибируемых активирующих последовательностей, или их частей, могут быть использованы совместно, такие как, например, trp u tac или тас транскрибируемые активирующие последовательности, Все вышеупомянутые последовательности были охарактеризованы ранее и могут быть сконструированы или синтетически или иэ известных плаэмид.

В определенных вариантах, описанных здесь, репликация плазмиды определяется термоиндуцирующимся репликоном неконтролируемого роста, описанным как в британской патентной публикации N. 1557774, так и в Uhlin et al„1979, е е 6:91. При температурах ниже 30 С, в частности 25 С, репликон поддерживает относительно низкое число копий, примерно 10- 15 копий на клетку, При повышении температуры до 37 С контроль числа копий теряется и плазмиды, содержащие репликон, амплифицируются до 1000-2000 копий на клетку. Конкретный рЕпликон неконтролируемого роста, приве25

35

45

50 ляет собой полезную первую стадию в

5

20 денный здесь в качестве примера, содержится в ранее описанной плазмиде р1М-1 АЗ исходном материале. Специалисты в данной области должны понимать. что изобретение не ограничивается использованием какого-либо конкретного репликона неконтролируемого роста или мутанта числа копий. Другие репликоны. вызывающие безудержный рост или большое число копий, могут быть получены путем соответствующей селекции или могут быть сконструированы в соответствии с процедурой, описанной в Международной публикации N W082/02901. Такие репликоны могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, которые также входят в область изобретения.

Клонирование генов в векторы, содержащие репликон неконтролируемого роста, приводит в результате к индуцированию L1 потере контроля числа копий, к сильному увеличению скорости синтеза белка и сопутствующему образованию до настоящего времени неизвестных и неописанных видов внутриклеточных белковоподобных гранул.

Такие гранулы, которые также входят в изобретение, являются высоко гомогенными по их белковому составу, и, следовательно, отличимы от известных высокомолекулярных агрегатов и инклюэий, которые иногда встречаются в клетках-хозяевах,. содержащих рекомбинантную ДНК. Последние включения являются гетерогенными, обычно содержащими ассортимент клеточных компонентов, таких как нуклеинавые кисло4 ты, углеводы, липиды и пептиды, и содержат только 10 — 20 конкретного белкового продукта. Гранулы изобретения являются высоко однородными по целевому протеиновому продукту, составляющему по крайней мере

50ь, а чаще более 80 гранулы.

Настоящие новые виды гранул могут быть легко выделены из лизатов клеток, они являются стабильными к промывке низкими концентрациями мочевины или детергентов, Промывка удаляет белки, которые связаны. не специфически в грануле, Выделение, которое генерирует высоко специфический активный материал, представочистке чужеродных белков. Все последующие стадии очистки, следовательно, упрощаются. Особенно полезным является тот факт, что компоненты клеточных стенок могут быть легко отделены от гранул.

Полагаем, что образование гранул изобретения изолирует такой чужеродный белок, чтобы не происходило нарушения нормального клеточного метаболизма и nðåæäaâðåìåíí0é гибели клеток, Некото18лб412

25

ЗО

35 генерирования дополнительных оснований 40 в мРНК, Водородное связывание между та-. кими комплиментарными основаниями при50

55 рые белки, такие как человеческий проинсулин, быстро деградируют в Е.coli è не накапливаются. Однако, когда такие белки кодируются в векторах, содержащих репликон неконтролируемого роста, проинсулиновый -белок образует. нерастворимые гранулы, которые защищают первоначально нестабильный белок от протеолитическогоо разложения, Следовательно, образование настоящего вида гранул является полезным не только для накопления нестабильных белков, но также для упрощения процедур выделения и очистки генных продуктов, Многие модификации и варианты настоя щих илл юстративных последовател ьностей ДНК являются возможными, Нап ример, вы рожден ность генетического кода допускает замещение нуклеотидов на всем протяжении областей, кодирующих полипептиды, а также замещения транслируемых стоп-сигналов TAG или TGA не спеАСТ . АСТ циально подтвержденный примером транслируемый стоп-сигнал ТАА . СледоваАТТ. тельно, как определено здесь выше, может быть одной из любых возможных последовательностей ДИК, которые кодируют аминокислоты 9 (лейцин) до 191 (фенилаланин) бГР. Такие последовательности могут быть выведены из.известной аминокислотной последовательности бГР и могут быть сконструированы по следующим традиционныМ синтетическим процедурам. Однако нуклеотидные триплеты должны быть выбраны в соответствии с известными принципами и экстраполяциями, рассмотренными у Цукера и Стейглера, 1981. Исследование нуклеи- новых кислот 9(1):133, чтобы избежать водит в результате к конфигурациям стержня и петли и свертыванию, которое снижает эффективность трансляции. Специалисты в данной области должны понимать, что все описанные выше модификации и вариации могут быть традицйонно синтезированы в полном соответствии с цитированными ранее синтетическими методиками. Следовательно, изобретение никоим образом не ограничивается специально представленными в примерах последовательностями ДНК и плазмидами, Векторы экспрессии и способ изобретения могут быть применены к широкому кругу организмов-хозяев, например, грамотрицательным прокариотным организмам, таким как Escherichia соП, E. co!i

К12 Е. coli К12 RV308, Е. coli К12 НВ101, Е.

coli K12 С600, E. coll K12 С600 Rg-М -, Е. coli

К12 RRI, Е. соИ К12 ММ294 и подобным. Хотя все варианты изобретения являются полезными, некоторые векторы и трансформанты являются предпочтительными, Предпочтительные векторы включают pCZ1920, pJR1, pJ1.3, pCZ112, рАТ1, рАТ1.3, рАТ2, рЛТ1.3, pASP1, pASP1,3. pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156,3, pASP2.З и pASP2, а предпочтительные трансформанты включают Е. coil

К12 RV 308/pJR1, Е. coll К12

RV308/pCZ1920, Е. coll К12 RV308/plRI, Е.

coll K12 RV308/pJRI,3, Е. coll .К12

RC308/рС2112» Е,-соИ К12 RV308/рАТ1, Е, coll К12 ВЧ308/рАТ1 3, Е. cali К12

RV308/pAT2, Е. cali К12 ВЧЗ08/рАТ2.3, Е, coli К12 RV308/pASP1, E. coli К12

RV308/pASP1.3, Е.coll 312 RV308/pCZ154, Е, coll K12 RV308/pCZ" 54.3, Е, соИ К12

RV308/pCZ156, Е. cali К12 RV308/pCZ156.3, Е, coll К12 RV308/pASP2Ç и Е. coll К12

RV308/pASP2. Иэ этой предпочтительной группы особенно предпочтительными являются плазмиды pCZ112, рС2154, pCZ154.3, рСЛ156, pCZ156.3, pASP2.3 и pASP2 и трансформанты Е. coli К12 RV308/pCZ112, Е. coll

К12 RV308/pCZ154, Е. coii К12

RV308/рС2154.3, Е. coli К12 RV308/pCZ156;

Е, coli К12 RV308/pCZ156.3, Е. coli К12

RV308/pASP2.З и Е.coll К12 RV308/ðÀÐ2.

Специалисты в данной област должны знать, что векторы экспрессии изобретения используются для трансформации подходящих организмов-хозяев, таких, чтобы производное бычьего гормона роста зкспрессировалось при использовании стандартных условий ферментации, Продукт. экспрессированный в виде высоко гомогенной гранулы и выделенный рутинными методами из полученного в результате лизата клеток-хозяев, является полезным для повышения молочной продуктивности и обычно для стимулирования роста крупного рогатого скота, Способы использования, введения и подходящие дозировки для крупного рогатого скота известны и описаны в Публикации

Европейского патентного ведомства N

0085036. страницы 7 — 9, приведенной здесь в качестве уровня техники. Следующие примеры далее иллюстрируют изобретение, описанное здесь, Пример 1, Конструирование плазмиды pNM789B.

А. Конструирование плазмиды pKEN021 и ее фрагмента Xbal-BamHI.

В качестве исходного материала используют фрагмент 5,1 kb полученный путем Xbal-BarnHI расщепления плазмиды рКЕКО21(106 на фиг.3). Плаэмида рКЕМ021

1838412 является производной pKEN111 (101 на фиг,1) и далее описана у Ли с сотр., 1981, g

Bact. 1.46; 861-866 и у Цвибеля и сотр„1981, J. 8ас, 145: 654-656), которая внесена в Е. со!! СС620 (NRRL номер хранения 15011) и которая имеет фрагмент примерно 2,8 kb, который содержит липопротеиновый ген Е.

coll. Описание этого фрагмента приведено

Накамура и Иноуе, 1979, Cell18: 1109-1117, В pKEN021 последовательность из 650 пар оснований между единственными сайтами рестрикции EcoRI u Sall pB 322 была заменена последовательностями, взятыми из липопротеинового гена Е, coll.

Последовательность липопротеинового гена (Накамура и Иноуе; 1979) включает фрагмент 462 пар оснований Al и !, идущий вверх от первого триплета (метионин) липопротеинового гена; который содержит промотор, 5 нетранслируемый участок и участок связывания рибосомы. Единственный сайт рестрикции Xbal локализован в сайте связывания рибосом 16 пар оснований перед метиониновым сигналом инициации трансляции. Pvull сайт рестрикции, локализующий 105 пар оснований вверх от концевого кодона трансляции структурального гена, был заменен на сайт рестрикции

BamHI при добавлении синтетического линкера ДНК (5 ССССАТССССЗ, полученного из Коллаборатив Рисерч). Кодирующая последовательность для последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, сигнал окончания трансляции, и последовательность, соответствующая 3 нетранслируемому участку информационной РНК, следуют за BamHI сайтом, Плазмида pKEN021 также включает некоторые периферические по. следовательности 850 пар оснований; не относящиеся к липопротеиновому гену и локализованные вниз от него в хромосоме

Е; coll. Эти последовательности включены как следствйе способов и сайтов рестрикции ферментов, использованных при первоначальном выделении гена.

Ссылаясь на фиг.1, 2 и 3, плазмида

pKEN021 получена из рКЕМ111 следующим образом: примерно 50 мкг pKEN111 (101 на фиг.1) переваривают 25 ед, фермента рестрикции Hpall в 300 мкл буфера, содержащего 20 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 10 мММ9С!2 и B мМР-меркаптоэтанола, при 37 С в течение 2 ч, Смесь дважды экстрагируют 300 мкл смеси 50:50 фенола и хлороформа и извлеченную водную фазу затем осаждают 2,5 обьемами этанола и 0,1 объема 3М ацетата натрия. Шарик ДНК растворяют в 100 мкл злектрофоретического буфера и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле (акриламид: бис отношение равно 29:1 для

50 всех гелей. за исключением того, гд» отмечено), Гель окрашивают в растворе, содержащем 0,5 мкгlмл этидинийбромида и визуализируют полосы при длинноволновом ультрафиолетовом облучении.Изолируют полосу 950 пар оснований и извлекают из геля электроэлюцией в мешок. После экстракции фенолом/СНС!з и осаждения этанолом извлеченную ДНК (приблизительно

2,5 мк) растворяют в 25 мкл TEN (10 мМ

NaCl, 10 мМ Трис, НС!, рН 7,4 и 1 мМ этилендинитрилтетраацетата натрия (ЭДТА) рН

8,0).

Примерно 2 мкг фрагмента Hpall 950 пар оснований переваривают ферментом рестрикции Alu I в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ NaCI, 6 мМ Трис, HCI (рН 7,6), 6 мМ М9С!2 и 6 мМ р-меркаптоэтанола, в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционируют на 6%-ном полиакриламидном геле и извлекают и очищают описанными ранее способами фрагмент Alul 462 пар оснований.

Фрагмент 462 пар оснований Alul (приблизительно 1 мкг) растворяют в 10 мкл Т4 ДН К лигазного буфера (66 MM Трис. HCI, рН 7,6, 10 мМ MgClz, 10 мМ дитиотрейтола, 0,4 мМ

АТР), содержащего 150 пикомолей фосфорилированного EcoRI линкера (5 GGAATTCC3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 4 С смесь нагревают 10 мин при 65 С и разбавляют до 100 мкл добавлением EcoRI буфера (100 мМ Трис. НCI, рН

7,2, 50 MM NaCI, 10 мМ MgCIz, 6 MM P-ìåðкаптоэтанола) и 40 ед. фермента EcoRI, После 2 ч при 37 С образец удобно экстрагируется фенолом (СНС!з и осаждается этанолом. Затем ДНК растворяют в 20 мкл Т4 ДНКлигазного буфера, содержащего

0,1 ед, Т4 ДНК лигазы и 0,1 мкг pBR322 (102 на фиг.1), которую затем линеаризуют

Есор, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой. После лигации при 4 С в течение

16 ч полученную в результате ДНК используют., чтобы удобно трансформировать Е.

coll штамм К12 НВ101. Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина и изолируют плазмиды из устойчивых колоний путем быстрой щелочной экстракции, описанной у

Бернбойма и Доли, 1979. Исследование нуклеиновых кислот 7: 1513:1523. Отбирают плазмиду (103 на фиг.1), содержащую 466 пар оснований фрагмента Xbal-BamHI, и используют в качестве исходного материала для следующей описанной стадии.

Около 2 мкг этой плазмиды (103 на фиг.2) переваривают 2 ед. фермента Hind !!! в 50 мл Hind !!! буфера (60 мМ NaCI. 10 мМ

Трис. HCI, pH 7,4. 10 MlvJ МЕСЬ и 6 мМ

1838412

/1-меркаптоэтанола) в течение 1 ч при 37 С.

После экстракции фенолом/СНС1з и осаждения этанолом ДНК растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 300 MM NaCI, 30 мМ ацетата натрия, рН 4,25, 1 мМ ZnCIz и 200 ед, Sl нуклеазы (Майлс Лебораториз). После

1 ч при 15 С реакцию останавливают экстракцией фенолом/СНС1з и осаждением этанолом, Полученную в результате ДНК растворяют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного бу- 10 фера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированных BamHI линкеров (5 CCGGATCCGG3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы, После 16 ч при 4 С реакционную смесь нагревают 10 мин при 15

65 С для инактивации лигазы, а затем разбавляют до 100 мкл в BamHI буфере (150 мМ

МаС1, 20 мМ Трис, H CI, рН 8,0, 10 MM Mg Clz, б мМ Р-меркаптоэтанола), содержащем 20 ед. фермента ВагпН1. После 2 ч при 37 С 20 смесь очищают на 1%-ном агарозном rene, Гель окрашивают и извлекают злюцией больший фрагмент (примерно 4.5 kb) после охлаждения, а затем очищают экстракцией фенолом/СНСlз и осаждением этанолом, 25

Извлеченный фрагмент с BamHI липкими концами растворяют в 20 мкл Т4 ДНK лигазного буфера, содержащего 0,1 ед. Т4 ДНК лигазы, После 16 ч при 4 С используют ДНК для трансформации Е, coli НВ101, Транс- 30 форманты отбирают по устойчивости к ампициллину (Ap") при 100 мкг/мл и скринируют на чувствительность к 10 мкг/мл тетрациклина (Tc). Несколько плазмид, полученных по описанной ранее про- 35 цедуре Вирнбойма, из колоний, которые являются AprTcs, были исследованы на отсутствие Hindlll сайта и присутствие единственного BamHI сайта. Последовательный перевар Есой1. Sall дает фрагмент 466 пар 40 оснований и фрагмент 305 пар оснований, Отбирают плазмиду (104 на фиг.2) с этими характеристиками l1 затем модифицируют для превращения EcoRI сайта, локализованного выше Ipp промотора, в Hind ill сайт рестрикции.

Переваривают 2 мкг плазмиды (104 на фиг.2) в 100 мкл Есор буфера с 0,2 ед. EcoRI в течение 10 мин при.37 С. Реакцию останавливают нагреванием в течение 10 мин 50 при 65 С, а затем после экстракции фенолом/СНСlз осаждают ДНК этанолом, растворяют в 200 мкл Sl нуклеазного буфера, содержащего Sl нуклеазу в количестве 1000 ед,/мл и проводят реакцию при 12 С в тече- 55 ние 1 ч, Реакцию останавливают экстракцией фенолом/СНС1з и осаждением этанолом. Полученную в результате ДНК ресуспендируют s 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфо4 рилированного Hind III линкера (5 CCAAGCTTGG3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После 16 ч при 4 С смесь нагревают 10 мин при 65 С, разбавляют до 150 мл в Hind lll буфере, содержащем 10 ед,: фермента Hind ill, инкубируют

2 ч при 37 С, а затем фракционируют на

1%-ном агарозном геле. Самую большую полосу (эквивалентную единственному отрезку плазмиды) обычно извлекают и очищают, растворяют в 20 мкл Т4 лигазного буфера. содержащего 0,2 ед. лигазы, инкубируют при 4 С в течение 16 ч, а затем используют при трансформации в Е. coll

НВ101. Отбирают трансформанты по устойчивости к ампициллину, изолированные плазмиды анализируют с помощью рестрикционного ферментного анализа. Отбирают плазмиду(105 на фиг.2) с фрагментом ЕсоИHind Ill из 500 пар оснований и используют как вектор клонирования для введения 3 участка Ipp гена.

Переваривают около 2 мкг плазмиды (105 на фиг,3) в 50 мкл буфера Sall рестрикции (150 мМ NaCI, б мМ Трис. HCI, рН 7,9, 6 MM МцС12, 6 мМ Р-меркаптоэтанола) с 2 ед. Sall в течение 1 ч при„37 С, а затем разбавляют в 150 мкл буфера BamHi, содержащего 2 ед. BamHI. После 1 ч при 37 С прибавляют 2,5 ед. щелочной фосфатазы и продолжают инкубирование в течение 1 ч при 65 С. Материал экстрагируют фенолом/СНС1з, осаждают этанолом, растворяют в TEN и используют в качестве клонирующего вектора для Ipp Т-фрагмента, Для получения фрагмента, содержащего область 1рр 3, переваривают 10 мкг pKEN

ill (101 на фиг.3) в 200 мкл H pal буфера (20 мМ KCI, 10 MM Трис. HCI, рН 7,4, 10 MM

MgClz и б мМ /3-меркаптоэтанола) с 10 ед.

Hpal в.течение 2 «37 С, После экстракции фенолом/СНСlз и осаждения этанолом. растворяют ДНК в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного . Sall линкера (5 GGTCGACC3, из Коллаборатив Рисерч) и

2 единицы Т4 ДНК лигазы, а затем инкубируют 16 ч при 4 С. Лигазу инактивируют при нагревании при 65"С в течение 10 мин. Полученный в результате материал разбавляют в 100 мл. в Sall буфере, содержащем 10 ед, Sall, и инкубируют 1 «37 С, затем разбавляют в 300 мл в Pvuli буфере (60 мМ

NaCI, б мМ Трис. ICI, 7,5, 6 мМ М9С12, 6 мМ

/З-меркаптоэтанола), содержащем 10 ед. рестриктивного фермента Pvulll. После 1 ч при

37 С ДНК фракционируют íà 5%-ном полиакриламидном геле. Извлекают примерно

0,5 мкг фрагмента 950 гар оснований, очищают и растворяют в TE. Разбавляют 0,2 мкг

1838412 фрагмента в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного ВатН! линкера (5 ССООАТСССОЗ, из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДН К лигазы, а затем инкубируют 16 ч при 4 "С. Полученную в результате

ДНК загем нагревают в течение 10 мин при

65 С, разбавляют в 100 мкл BamHI буфера, содержащего 20 ед. Вагп Н!, инкубируют при

37 С в течение 2 ч, а затем фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле, чтобы удалить избыток линкерных молекул, Полученный в результате фрагмент 950 пар оснований, имеющий BamHI u Sall липкие концы„очищают традиционным способом и растворяют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего как 0,2 мкг клонирующего вектора, описанного ранее, и 0,2 ед. Т4

ДНК лигазы. После инкубирования в течение 16 ч при 4"С используют ДНКдлятрансформации в Е. соИ К12 НВ101, Получают плазмиды из устойчивых к ампициллину трансформантов и традиционно анализируют Sall-BamHI фрагмент. Описанную плазмиду (примерно 5,2 I.b) обозначают

pKEN021 (106 на фиг.3).

Переваривают 10 м

/ м е р к а п то э т а н о л а) . и <-. п о л ь з у я 1 0 е д.

ВагпН!, в течение 1 ч, затем 10 ед. Xbal в течение евое 1:i при 37 С.. Желаемую переваренную Xbal-BamHI ДНК затем обрабатыван)т 2.5 ед щелочной фосфатазы в течение

1,5 ч при 65 С экстрагируют фенолом

/CHCla, собирают при осаждении этанолом и растворяют в 50 мкл TEN для дальнейшего использования (107 на фиг.3).

Б. Конструирование плаэмиды pNM575.

В качестве источника фрагмента ДНК, содержащего кодирующую последовательность для участка гена человеческого гормона роста используют плазмиду

pt rpED50chGH800 (108 на фиг.4) описанную

Мартиалом с со,р. 1979, Science 205:602607, Этот фрагмент также может быть сконструирован синтетически (Итакура с сотр.

1988-и Кри с сотр. 1978) или может быть получен с использованием известных методик, описанных Гудманом с сотр, 1979; Методы в Знзимологии 68;75-90, путем выделения MPHК, кодирующей человеческий гор 10Н роста, из гипофиза человека.

Участок гена человеческого гормона роста плазмиды ptrpED50chGH800 содержит единственный Smal сайт рестрикции 6 пар оснований ни>ке от кодона окончания трансляции гена. Зтот сайт был заменен на сайт

BamHI при использовании следуюв1ей процедуры: переваривают 6 MKr плазмиды 6 ед, Smal в 200 мкл буфера Smal рестрикции (15 мМ Трис. HCI, рН 8,0, 6 мМ MgCI„, 16 л1М KCI и 6 MM /3-меркаптоэтанола) в течение 1.5 ч при 37 С, После окончания переваривания

5 проводят экстракции фенолом (СНС!з и извлекают ДНК осаждением этанолом, затем растворяют ее в 24 мкл TEN, Прибавляют 40 пикомолей фрагмента фосфорилированного ВагпН! адаптера (Коллаборатив Рисерч) к

10 0,5 мкг(0,2 пикомоля концов) переваренной выше плазмиды к 16 мкл лигазного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы. Смесь инкубируют 2 ч при 22 С, 16 ч пои 4 С и затем 10 мин при 65 С. Генерируют BamHI

15 липкие концы путел традиционного переваривания BamHI регтрикционным ферментом. Фермент расщепляет линкерную последовательность, а также BamHI сайт, локализованный у начала клонированной последовательности ДНК человеческого гормона роста. Зто дает фрагмент 691 пар оснований с липкими BaniHI концами, который выделяют на 6%-ном полиакриламидНоМ геле, а затем извлекают обычным

25 способом, Извлеченный фрагмент ДНК лигируют (используя 0,2 ед. Т4 ДНК лигазы в

20 мкл буфера в описанных ранее условиях) с 0,2 мкг переваренной BamHI и обработанной шелочной фосфатаэой рВ 322 (102 на фиг,4). После 16 ч при 1 С материал испогьзуют для трансформации в Е.coli штамм

JA221/NRRL NB-15014 по существу в соответствии с процедурой трансформации Венсинка с сотр. 1974, СеИ 3:315-325. Отбирают

35 трансформанты на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, а затем изолируют обычным способом плазмиды и идентифицируют их с помощью анализа рестрикционными ферментами и гель-элект40 рофореза. Желаемые плазмиды, обозначенные как pNM575 (109 на фиг.4), содержат BamHI фрагмент приблизительно

700 пар оснований, и амплифицируют их обычным способом для дальнейшего ис45 пользования, В. Конструирование плазмиды pNM702, Последовательность ДНК зрелого человеческого гормона роста содер..кит сайт

РпоД11, который имеет 47 пар оснований от первого нуклеотида. Переваривают 25 мкг