Способ экспрессии dacs/daocs активности в клетках еsснеriснiа coli

Способ экспрессии dacs/daocs активности в клетках еsснеriснiа coli

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Использование: /енетич еская инженерия , рекомбинантная технология получения ферментов. Сущность изобретения: способ экспрессии DACS/DAOCS активности в клетках E.coli предполагает трансформацию штамма E.coli K12 Im109 плазмидой с последующим отбором клонов, экспрессирующих данную активность. 12 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/52

ГОСУДАРСТВЕННОЕ. ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4613456/13 (62) 4355306/13 (22)17.02,89 (23) 03.03.88 (46) 30.08.93. Бюл. N 32 (31) 021836 (32) 04.03;87 (33) US (71) Эли Лилли энд Компани (0Я) (72) Томас Доминик Инголиа, Стефен Виатт

Квинер, Сьюллен Мэри Сэмсон и Пол Латер Скэтрад (! !3) Изобретение касается способа экс- прессии ДНК последовательностей, которые кодируют активности деацетоксицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспорин С синтетазы, (DAOCS) катализируют реакцию, в которой из пенициллина N образуется деацетоксицефалоспорин С (DACC), и очень часто рассматривается как экспандаза (увеличитель объема). Деацетилцефалоспорин С синтетаза (DACS) катализирует образование деацетилцефалоспорина (DAC) из

DACC, реакция гидроксилирования. Эти реакции являются критическими этапами в биосинтезе очень важных антибиотиков, таких, как цефалоспорины, из

Cephalosporium acremonium и 7с-метоксицефалоспорины из Streptomyces clavuiigerus.

Соединения ДНК, используемые в способе данного изобретения, кодируют 0АОС и DACS в одиночной открытой рамке считывания. Транскрипция этой открытой рамки считывания с последующей трансляцией полученной информационной PHК (mPI-IК) приводит к получению одиночной полипей« . Ы 1838413 А3 (54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ DACS/DAOCS

АКТИВНОСТИ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA

СО!! (57) Использование: Генетическая инженерия, рекомбинантная технология получения ферментов. Сущность изобретения: способ экспрессии DACS/DAOCS активности в клетках Е.coli предполагает трансформацию штамма Е.coli К12 Im109 плазмидой р!Т507 с последующим отбором клонов, экспрессирующих данную активность. 12 ил. тидной цепи, которая обладает как DAOC-, так и DACS-активностями.

Соединения ДНК, которые кодируют активности DACS/DAOCS, были выделены из геномной ДНК Cephalosporium acremonium.

Продуцирование Е.coli активности

0АОСИОАСЯ катализируют образование

DAOC из пенициллина Nu DAC и DAOC, Сырые клеточные экстракты этих трансформантных Е.со!! по настоящему изобретению проявляют активности DAOCS/DACS без какой-либо предварительной активационной обработки. Заявленный способ экспрессии в Е.coli обеспечивает эффективное средство получения больших количеств активного фермента DAOCS/DACS. Этот фермент DAOCS/DACS полезен не только для продуцирования DAOCS и DAC, но также и для расширения спектра пенициллинов иных чем пенициллин N и для гидроксилирования цефалоспоринов иных чем DAOC для образования новых.

ДНК соединения. отвечающие настоящему изобретению, образованные от геномной ДН К Cephaios porium ac rem onium, 1838413 в высокой степени гомологичны в своей нук- На фиг,1 показана рестрикционная и леотидной DAOCS последовательности сое- функциональная карта плазмиды р1Т503; на динениям ДНК, кодирующим активность фиг,2 — рестрикционная и функциональные

DAOC и/или DACS в других продуцирующих карты, производные и взаимосвязь плаэмид цефелоспорин организмах. таких как 5 pKENUJ (101), рВ R322(102) и 103, промежуStreptomycesclavuligeries. Ввиду этой гомо- точных плаэмид в построении плазмиды логии отвечающие настоящему изобрете- pCZR336; на фиг.3 — рестрикционная и фуннию соединения ДНК, кодирующие кциональные карты, производные и взаимоОАС$/DAOCS, могут быть мечены и исполь- связь плазмид 103, 104 и 105, зованы для отбора геномных библиотек ор- 10 промежуточных плаэмид в построении ганизмов, которые продуцируют плазмиды pCZR336; на фиг.4 — рестрикционцефалоспорин С или аналогичные соедине- ная и функциональные карты, производные ния на присутствие либо ДНК, кодирующей и взаимосвязь плазмид pKEN021 (106 и 107)

DACS, либо ДНК, кодирующей ОА0С. Мно- и рКЕ (101), промежуточных плазмид в погие организмы включают ДНК,.кодирующую 15 строении плаэмиды pCZR336; на фиг.5 — реактивность ОАС$ DAOCS, которая может стрикционная и функциональные карты, быть идентифицирована и выделена с ис- производные и взаимосвязь плаэмид ptrp пользованием соединений ДНК, отвечаю- ЕО 50ch GH800 (108), pBR 322 (102 и щих настоящему изобретению. PNM575), (109), промежуточных плазмид в

Отвеча(ощие настоящему изобретению 20 построении плазмиды pCZR 336: на фиг.6— соединения ДНК, кодирующие рестрикционная и функциональные карты, ОАС$/DAOCS, были выделены в сочетании производные и взаимосвязь плазмид срегуляторнымипоследовательностями,ко- pNM 575 (109), pKEN021 (107) и pNM702 торые контролируют транскрипцию и в ко- (p1101), промежуточных плаэмид в понечном итоге выражение активностей 25 строении плазмиды pCZR336; на фиг.7 — peDAOCS/DACS. стрикционная и функциональная карта

Настоящее изобретение включает так- плазмиды p1i08, промежуточной плазмиже регуляторные сигналы гена ды в построении плаэмиды pCZR336; на

DACS/DAOCS, расположенного у 3 -конца фиг. 8 — рестрикционная и функциональкодирующей области гена DACS/DAOCS 30 ные карты, производные деривитизации и

Cephalosporium aeremonium, Эти 3 -g,регу- взаимосвязь плазмид рЕ110, р1110А, и ляторные последовательности кодируют pL110C и бактериофагов m13 и пр18, транскрипционную терминацию и полиаде- m13T с3 и pL 1108, промежуточных векнилированиетРНК,исигналы процессинга, торов в построении плаэмиды pCZR336; гена DACS/DAOCS. 35 на фиг. 9 — рестрикционная и функциональОАС-диацетилцеф(1лоспорин С ная карта плазмиды р1Т160; на фиг.

10 — рестрикционная и функциональ 1 1 ная карта плазмиды pCZRLU; на фиг. 11 — рестрикционная и функциоDACS-деацитилцефалоспорин С синте- 40 нальная карта плазмиды pCZR336; на таза, ферментная активность, которая ката- фиг.12 -- рестрикционная и функциолизирует конверсию DAOC в DAC. нальная карта плазмиды plT507.

ОАОС-деацетоксицефалоспорин С нн, 0 Последовательность ДНК гена

45 DACS/DAOCS (гена зкспандаза/гидро1 1 н ивов к; ! лиза)

ОН а

co,Он 20 30 .. (40

5 A(C 1"ГС ТЛС ГГЛ ГЛА ТТА ЛСГ (Т! GCA (:ГЛ 1ТС (-AT ССС С(Г! (1 С (,О 70 Яа 90 (ЛС (ЛТ СЛС;GA ССЛ T((; ЛГС AT> CAT ATT. СТС (ТС ГГЛ A(:С ЛЛ(1 AAC

100 Т(й 20 130 !40

СЛС ЛЛС Л(!A ЛСТ СGiA Г(С (ТТ CTT Л!С ATT CGT TGA ГАЛ &AC ТТС ЛГЛ

10 1э0 1(0 170 180 li30

AGA СЛС ТСС TGG (ГГГ ТЛ(: /(AT ГС 1 ЛСЛ Т С Л(:С ТС (С(:С ГСС AAG (;CT

200 210 220 230

GAG ((G AA(CAG ((C (ТС ЛСТ TAC ((С TAA СTA GCA (;ТТ СТГ ГАЛ AAA

2 0 2. >(! 260 270 280

15 (1(1Л (ГГТ С (; Г (:(1 С (. (Г1 Л Л(1 CTA С СЛ С СТ (i G G С ГТ Т(1Л ((Л Г A 1 Л ГХ! ЛТЛ

1838413

320

АТС ГТС з тсс тот

3lO

СТC А(:Т (;« Ь

36о (.«.Л С(;С ГАС. 410

ACT ТСC AAG

ТН31 5! .((LYS

Т(А ЛТС

7О (.ЛА (! I (4 2() ((т(. ттт

ЧЛ1. РНЕ с! с ссс

VAI. PRO

5 о

rAG crc с1Ц !.EU

470 (i(.(«iA(i

A l.A Ь IЛ!

450 46 3 AG СТС CTC А(С !.Х5 VAE. 1.ЕЦ ТНИ

440 слс слс Гтс ААГ«

ASP ASP r.EU I.YS

ГСС Ь"! С

ALA VAL

25 о

СЛС САС

ASP ASP. и;с «.,«;c ." Ей «" !.Х

«5

А1С ГТС ! 1.Е РИЕ

ACC АСС тнк тнв

49

Алс с(т

IYS GLY зо

510 52

САС АСС ССС СТС GTC

GLU SER С1Х I.EV VAL

5оо

ТЛС ТТС А С

1 YR I EU TllR

55О (:. С ACG TGC (;ш тнк cYs

560 ьтт сАс ттт

VA L AS P P l lF

«сс ат

AI.А AI(C

57(3 .МС ГГА

ASH GLY

ТТС ААС

ГНЕ I.YS

1О

CGT ААС

ARG А511

590 600 6

Алс Асс ссс стс AcG cTc Gcc GAc

1.Х5 Л«1С А!.À VAI. Т!П(1.Е0 AI.A ASP

65 70

640 650 («(.С CTC СЛС TGG GAG AGC ACC GCC

ALA 1.Е0 GI.U TRP 01.Ц SER ПИ ALA

80 .85

690 700 тсс слс fAc AcG TGc ГАС тсс

5ей Asp тхй 5ек TllR cYs тхк sER

95 100

620

Ccc crc

А1,А .ЕС (3n ттс тст

РНЕ SER

660 670

G1C «;TC ACC ГАС

ЧА!. VAL ТНН С.Ы )О

ССГ. GGC

AIeG с1л

680

АРС ТАС

LYs тхи

71о

АТС,GGC АТС GGC

1(ЕТ GLY II.Å GLY

105

АСС GGC тнк GLY

?90 ссж стт тол слл

340 ттс (:тс ТГс слс

CAA AAC (..AC AG(:

5Зо

САС CAC АСС TCG

ASP i!IS TlIR HER

Асс GAG GAG GAG

SER GLlJ GLU GLU бо

3А0 с(, лч: г.гт

Алс ттг ГГТ

4««О

АТС A/(: Л«С

"Ет ззо стт ААА

3ЯО

Азс сст

430 сст стс

AIeG 1Ец

1О х-лаяв

720 730, .740 /50 . 760

GGC АЛ(. CTG 1 ГС СС(i ЛЛ(. Ссс Г1(С 1 ТС (AG сЛС G l C TG(; CAG GЛС.. АС

GLY ASH LElJ РНЕ Р%) ASI! ДК ((1.Х PRE С!ЛЯ ASP VAI. 1Й1 GEM ASI TYR

110 : 115 (20

- 770 . 780 . /90 800 810 ттс GAc и с А Г тА. GG«: ccA (.(. с AAG САт (.Тс Г(G сс«: ссс (и стс

Р((е л >1 ARri иЕт l fR, ((LY А! А л!.A !.Х5 А5Р vhl. AI.A АНГ .I л и1. I.! .ц

125 130 . 135

820 83О R40 850 860

AAC ТСТ (iT(i (3СС .И .С СС(1 Ст« . (3СС Ь(зG « АС (3ЛС ATT СЛТ (АС ТТС (i"! C

AsM sER чл1; (1х ALA PRQ (еО АI.À G!.Y С1.ц А5Р 11.е /««51 AgP Рне vAI.

1/ 0 145 ., 150"

870 88Î 890 900 910

GAG (c GAT сГс с «. стс (:я; с А c(iG ГАс ттс ссс CAA С G ccG Гль

GLV YS A5Р Р!(О f.EII I.ЕИ ARG I.I;U АИС TYR РИЕ РВО GLU ЧМ 1 !(О СI.U

155 160 р,. 165 1 /0

920 930 940 950

GAC CGC ЬТС Gf C GAA GAG GAA ССС С1 C CGC А1 (1 GGA ССС САС 1 AC «1AC

Л5Р А(((ю ЧА1 Л!.Л Gl.«! GI.U С!.Н I leO 1.!;Ц ARG (!ЕТ GLY PRO Н S ТYR

20 17 j . 180 185

960 . 970 980 990 .1000

СТЛ СС АСС АТС ACG СТС GTC LAC САС.ACA GCC тсс (iCc AAc (ьС TTC

1.ЕЦ SFR TIIR fI.E THR LEU НАС HIS (I.N Т1(К Af.À CYS А(.Л АЯ С!Л РНЕ

190, 195 200

1838413

1010 1020 1030 1040 1050

G f G AGC CTG CAG ТСГ СЛС СТС GA(((Л ((AA 1 ТС СТС GAC CÒÑ CCG АСС

VAL SER LEU (ЬЛ CYS (11Л2 VA(. ASP (ЬЛ СIЛ2 I lll; VAE. ASI 1.EU Pl(O ПИ

205 210 215 .. 1060 1070 1080 1090 1100

СТС С(С GGC GCC АТ(1 GTC GT(: Т(С TGC GGC GCG GTC GGC ACC CTG GCC .LEU PRO GLY ALA НЕТ VAI. VAI. PIIE CYS GI,Y ALA VAL GLY 1 НИ ЬЕ(1 ALA

220 225 230

1110 1120 1130 1140 1150

ACG GGC GGC AAG С 1 (: AAG ((!С ССС AAG CAC ГСС GTC AAG ТОТ ССС GGG

TliR GLY GLY !ЛБ VAI. ЬЛБ ЛЬА 1 ВО 1.YS IIIS ARG VAL LYS . IER PRO GI.Y

235 240 245 250

1160 1170, 1180 1190

ССС САС СЛС (:GC GT(: GGC AG(. ACC CGC ACG fCG AGC Gfc ТТС ТТС СТС

ARG ASP С1Л1 ARG VAI. СЬ1 . - ЕIt SER ARG ТНИ SER ЗЕВ VAI. Р11Е РНЕ E-EU

255 ?60 265

1200 1210 1220 1230 1240

CGG CCG AAG ССС СА(; ТТС Л((: TC AAC СТС CAG CAG TCG AGG GAG TGG

ARG PRO ЬЯЯ PRO ASI PIIE ЫЕ11 1ПЕ ASH VAL ЯЛ СЬ11 SER AltG GLU 1В1

270 275 280

1250 1260 1270 1280 1290

GGT ТТС AAC (1С СЫ: ATC (.(:(; TCG GAG CGC ACG ACG TTC AGG GAG TGG

GLY РНЕ ASH VAL AR(; I LE РИ() БЕЕ CLU ARC ТНН TIIR РНЕ Л1(С GLU TRP

285 290 . 295

40

Х-7108

1300 l 110 " 1320 1330

CTT (;CC ССС ААС ТАТ СТГ АЛО. ЛТС (СС АСС (ЛТ ААС СГС ССС Г>СА

1.Е(1 (!Я С1Л ЛБ11 TYR VÀI. ЮБ ИЕf Alt(Al(G AS! 1ЛБ PRO АЬА ALA

300 305 . 310

1350 . 1:3(0 1370 1380 сАс (сс (Гт G rc ccc яс сс1 ссс (ст стс тст Acr. CCA сст сст

С!ЛЭ AI.А ЛЬА VAL РК(2 А1.A AE.Ë ALA РКО УА1. Sl;R IHR hl.A АI.A 1 ВО

315 320 . 325

14(20 1410 1420 1430

10 ССC ACT ТАС (СЛ АГ(. ССГ. CGA TC(АСТ ЯАТ ААА Т(:Т AC(С(1Л GTT

ALA 1 НИ

1440 1450.. 1460 14 70 1480

GAA САЛ AAA ТТС CCC TAT ААЛ TTG.СТЛ AA 1 TTT TAA AAC AÑË AAG

1490 1500 1510

1 5 (AG TGT САА GAG ТТТ САА СТТ TCA A-3.

GCG

AIA

ЛТЛ

I l.Е

330 (.AT где А — деоксиаденил; G — деоксигуанил;

С вЂ” деоксицитидил: Т вЂ” тимидил; ALA— группа аланина; AGR — группа аргинина, ASM — группа аспарагина; ASP — группа аспарагиновой кислоты; CyS — группа цистеина; GLN — группа глутамина; GLU— группа глутаминовой кислоты; GLY— группа глицина; HIS — группа гистидина;

lLE — группа изолейцина; LEU — группа лейцина; LYS — группа лизина; МЕТ—

18384!3

1О

20

40

55 группа метионина; РНŠ— группа фенилаланина; PRO — группа пролина: SER — группа серина; THR — группа треонина; TRP — группа триптофана; TYR — группа тироэина; VAL — группа валина.

Показанная последовательность ДНК содержит примерно 63 G и С и кодирует полип с рассчитанным молекулярным весом 36, 462 дальтон и измеренным молекулярным весом -40.000 дальтон, . Указанная последовательность может быть синтезирована обычным образом путем модифицированнго фосфоротриэфир. ного способа с использованием полностью защищенных деоксирибонуклеотидных блоков. Такие способы синтеза хорошо из. вестны и логут осуществляться в соответствиИ -с методикой Stakura и др, .1977ã.

Science 198:1056 и с методикой и др., 1978 г., Proc. Nat. Acad. Scl„USA, США, 75, 5765.

Кроме того, особенно предпочтительный способ описан в работе Hsiung и др., 1963 г., hiucleic Acid Research 11, 3227 и в работе

Narang и др., 1980 r., Methods in Enzymology .68, 90. Кроме способов, описанных в справочных руководствах данная последовательность ДНК может быль синтеэирована в автоматизированном синтезаторе ДНК, так6м как Sfstec 1450А или ABS (Appiied

Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster

Citv, ХА 94404) 380А, синтезаторы ДНК.

Ввиду вырожденности генетического кода, который является результатом нали- чия более чем одного кодона для большинства аминокислотных групп и трансляционного стоп-сигнала, последовательность аминокислот указанного фермента DACS/DAOCS может быть кодирована множеством других последовательностей ДНК. Так как эти альтернативные последовательности ДНК будут кодировать ту же поСледовательность аминокислот, отвечающую настоящему изобретению, то данное изобретение будет охватывать также и эти альтернативные последовательности и способы, в которых используются эти альтернативные последовательности.

Ввиду различного числа видов

Cephalosporium и даже различных штаммов в пределах одного вида существуют генетические .варианты ДНК, кодирующей

DACS/DAOCS, отвечающей настоящему изобретению. Эти генетические варианты включают основные последовательности

ДН К и аминокисЛоты, гомологичные соединениям, отвечающим данному изобретению, и кодируют белки с аналогичной, если не полностью идентичной, активностью, но несколько отличаются от фактических соединений, отвечающих данному изобретению. Эти генетические варианты эквиваленты также соединениям, отвечающим настоящему изобретению, и могут использоваться в способах данного изобретения.

Отвечающие настоящему изобретению соединения ДНК, кодирующие активность

DACS/DAOCS, выделены из штамма

Cephalosporlum acremonlum, общеизвестного как штамм Brotzu, который имеется в коллекции культур американского типа, Роквилл. Мерилэнд, где он хранится под номером АТС 11550. Геномная библиотека общей геномной ДНК штамма Brot;u была построена в бифункциональном космидном векторе pKCz462A (существующим в Е.coll

К12 под номером ййй1 В-15973) и была исследована на наличие последовагельностей, гомологичных ряду иэ 32 рл".лич11ых деоксирибоолигонуклеотидов, Этот ряд раэличных деоксирибоолигонуклеотидов был построен сотласно информации. полученной от частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonlum

ОАС$/DAOCS и на основе знания этого генетического кода, Были идентифицированы различные векторы, которые гомологич11ы одному или нескольким из 32 различных деаксирибоолигонуклеотидов. Пас "e,n:пательность ДНК раскрывает, какие векторы кодируют фермент С. acielilon fur

DAC$/DAOCS, После идентификации векторов, которые кодируют фермент DACS/DAOCS, был выделен рестрикционный фрагмент 7 кб

BamHl, включающий ген DACS/DAOCS и он был вставлен в коммерчески доступную плазмиду риС8, образуя плаэмиду р!Т503, которая затем трачсформируется в клетки хозяева К12 lA221. Эти трансформанты

Е.coli К12 lA221/plT503 были депонированы и составили часть коллекции культуры Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (NRRL) Пеория, IL

61604, под номером NRRL В-18170. Рестрикционная и функциональная карта плазмиды

plT503 представлены на фиг.1.

Плазмида р!Т503 может быть выделена из Е.coll К12 lA221 способом, описанным в примере 1, и используется в качестве исходного материала для построения плазмиды

plT507, которая обеспечивает высокую степень выражений активности 0АС$ DAOCS в Е.со!!. Порядок проведения операции для построения плазмиды plT507 представлен в примере 2 (смотри 2К), и включает сшивку кодирующего 2,2 кв Sstl-BamHI

DACS/DAOCS рестрикционного фрагмента плаэмиды р!Т503 с 5,8 кв NDel-BamHl фраг1838413

40

5 -C ATATG-3

1111 )

55 кентом плазмида pCZR336 и синтезированным фрагментом 60 Ьр SstT-Ndel.

Плазмида pCZR336 включаетЛр1 промотор, трансляционную активирующую последовательность, оператор с 1857, первую функциональную единицу наследственности (."пистрон"), кодирующую- небольшой пептид, который предшествует представляющему интерес гену, и последовательность

ДНК, кодирующую производное LGH (гормон роста человека). При низкой температуре, составляющей примерно 30 С, белок, экспрессируемый с использованием плазмид pCZR336 и р1Т507, является активным и способен подавлять активность промотора

Лр1, но при повышении температуры примерно до 42 С белок с 1857 инактивируется, промотор иницйирует транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей LGH (pCZR336) или DACS/0AOCS (plT507). Рестрикционная и функциональная карта плазмиды pCZR336 представлены на фиг,2.

Плазмида plT507 включает тот же первый цистрон с.1857 ген; промотор Лр1 и трансляционную активирующую последовательность, что и плазмида pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена DACSg)AOCS от плазмиды р!Т503 вместо кодирующей последовательности

1GH, Рестрикционный фрагмент — 2,2 кв ,Sstl-BamHl плазмиды р1Т503 включает .большую часть кодирую1цей последовател ьности DACS/DAOCS; ос>тальная часть этой кодирующей последовательности соде1>жится в синтезированном фрагменте 60

bp Ndel-Sstl с йебольшой модификацией последовательности ДНК дикого типа, что облегчает последующук> работу, Распознавательная последовательность рестрикционного фрагмента Ndel, которая представляет собой

3 -GTATAС-5 включает 5 -АТС-3

1It .

3-ТАС-5, которая кодирует аминотерминальную метионильную группу

DACS/DAOCS. Плазмида р1Т507 построена таким образом, что промо-.-opkpL и трансляционные активирующие последовательности располо>кены так, что вызывают э кспрессию ДН К, кодирующую

DACS/DAOCS. Рестрикционная и функциональная карта плаэмиды р1Т507 представлены на фиг.12. В примере 2 описывается построение плазмиды plT507 более подробно, 5

При температуре примерно 42ОC Е.coll

К12 1М109/рlТ507 выражает высокий уровень активности 0ACS/DAOCS, приближающийся к 15 $ от общего клеточного белка. Сырые клеточные экстракты от этих трансформантов Е,со11 К12 IM109/plT507 способны катализировать конверсию пенициллина N в 0АОС и 0АС, в то время как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток Е.coli К12 IM109 не могут катализировать эту конверсию, Данный способ анализа и результаты анализа реакции конверсии представлены в примере 3.

Многие штаммы Е,соН К12 включают активность эндогенной цефалоспориназы, вероятно, кодированной локусом ampC. По этой причине желательно осуществлять частичную очистку полипептида

OAOCS/0ACS таким образом, чтобы достигалась оптимальная активность

OA0CS/DACS, Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕ-тривакрила для отделения активности эндогенной Е.co i цефалоспориназы от желаемой активности 0AOCS/DACS. Пример такого типа частичной очистки описан в примере 3.

Другой возможностью использования частичной очистки для исключения вредных влияний цефалоспориназы является использование штамма, дефектного в продуцировании данной активности. Один такой штамм Е,coli К12 А85892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером

ИЛИ В-18096, Плазмида р1Т507 является эффективньил средством продуцирования больших количеств DACS/DAOCS в Е,со11. Ввидутого что Е.coli р1Т507 продуцирует

DACS/DAOCS в количествах, прибли>кающихся к 15% от общего клеточного белка, и ввиду того что культивация Е.coli менее сложIlà, чем культивация организмов, которые естественно продуцируют DAOCS и/или DACS, трансформанты Е.cali plT507 могут быть использованы в способе продуцирования DACS/DAOCS после эффективно и более экономично, чем "естественные" продуценты 0АСЯ DAOCS.

0AOCS может быть использована для продуцирования DAOC из пенициллина N в свободной от клеток системе, как описано в примере 3. 0АОС является не только полезным антибиотиком, но также может быть использована в качестве исходного материала для продуцирования таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспоринь! (см. патент США

4307192). Другим очень важным использованием DACS/DAOCS является использова1838413 ние фермента для трансформации пеници.;линов иных чем пенициллин N в новые цефалоспориновые производные, Плаэмида р!Т507 особенно предпочтительна для обеспечения экспресии

DACS/DOCS в Е.со!! не только ввиду высоких уровней этой экспресии, достигаемых при использовании данной плазмиды, но и ввиду отобранного маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы рекомбинантной ДНК кодируют Р-лактамазу таким образом, что клетки, содержащйе . этот вектор, могут расти в присутствии не. которых /3-лактамовых антибиотиков, таких как ампициллин. Однако если желательно использовать свободный от клеток экстракт, содержащий 0АС$ DAOCS для целей построения Р-лактамов, то нежелателен экстракт, который содержит активность

Р-лактамаэы. Так, плазмида р!Т507 не кодирует P-лактамазу в качестве маркера, и использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, который не реагирует с Р-лактамами.

Способ экспрессии DACS/DAOCS и относящийся к нему вектор, отвечающий настоящему изобретению, не ограничиваются определенным отобранным маркером. Специалисты в данной области знают, что многие маркеры пригодны для использования . на векторах экспрессии DACS/DOCS, Такие маркеры представляют гены, которые придают резистентность к канамицину, хлорамфениколу или к другим антибиотикам.

Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Культура Е.coll K12 !

А221/рт503 и выделение плазмиды р!Т503.

Лиофил Е.coli K12 !А221/р!Т508 был получен из Северных региональных научноисследовательских лабораторий, Неория, шт.Иллинойс, который имеет порядковый номер NRRL В-13170. Этот лиофил был непосредственно использован как "культура" в описанной ниже процедуре.

1 л питательного бульона L (10 г триптона, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащего 50 мкгlмл ампициллина, инокулировали культурой Е.со!!.

Клеточные осколки удаляли иэ раствора путем центрифугирования при вращении центрифуги со скоростью 25000 об/мин в течение 40 мин в роторе SW27 (Beckman, 7360 N, Lincoln Ave. Lincolnwood, J I., 60646).

Поверхностный слой зкстрагировали буферным фенолом. В этот раствор вводили примерно 30,44 г CSCI и 1 мл раствора этилбромида концентрацией 5 кг/мл, затем этот раствор доводили до объема 40 мл и

: 1981, I. Bact. 145:654 — 656), Плазмида

pKENLU могла быть получена из Северного

45 регионального научно-исследовательского

50 ет ген Е,coli Ipp см. Nakamura and Jnouye 1979 r., Celi 18. 1109-1117).

В плазмиде pKEN021 рестрикционный

5

30 декантировали в ультрацентробежную трубку (Бекмана) VTi50. Эту трубку герметически запаивали. раствор центрифугировался s роторной центрифуге VTi 50 при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч, Полученная плазмида, визуализированная ультрафиолетовым светом, была выделена и затем помещена в трубку Ti75 и роторную центрифугу (Бекмана), где осуществлялось центрифугирование со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч. Любое необходимое регулирование объема осуществлялось с использованием раствора TES. содержащего

0,761 гlмл CSCI, Затем плазмидная полоса снова выделялась, экстрагировалась насыщенным солью изопропанолом с целью удаления этилбромида и разбавлялась (1;3) буферным раствором ТЕЬ. Q рас вор вьодили 2 объема зтанола и затем е о ич;у" г" вали при -20 С в течение ночи. !!лазмида

ДН К, гранулировалась путем цен грифу ирования данного раствора в роторнои центрифуге SS34 (Servall) n течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 о /мин.

ДНК плазмиды pit503, полученная :. ким образом, 1 мг суспензировалась в i л. буферного раствора TE (10 ммоль Трис-НС1, рН 8 и ммоль ЕДТА) и хранилась при-20"С.

Рестрикционная функциональнч -лп,г:плазмиды piT503 представлены на qn r. i.

П р и м е.р 2. Построение плазмиды р!Т507.

А. Построение плазмиды pKEN021 и выделение ее рестрикционного фрагмента

-5,1 кв Xbal-Вап1Н!.

В данном разделе примера описывается выделение рестрикционного фрагмента

5,1 кв Xbal-BamHI ïëàçìèäû pKEN021(I06 на фиг.4). Ллазмида pKEN021 получена от плазмиды рКЕМШ (101 на фиг.2 и дополнительное описание приведено в работе Lee u др., 1981 г„146, 861-866. и bviebel и др„ центра (NRRL), служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Иллинойс, 61604, Е.coli СС620, порядковый номер NRRI 15011.

Плазмидл pKENUJ имеет рестрикционный фрагмент 2,8 кб EcoRI, который включафрагмент 650 п.о. EcoRI-Sall плазмиды рВ

322 был заменен генной последовательностью Е.coll Ipp, Эти генные последовательности Ipp включают фрагмент 462 (Aiu), расположенный перед первым триплетом кодирующей последовательнссти !рр. Этот

1838413

35

50 фрагмент 462 п.а.. содержит промотор, 5 нетранслируемую зону и сайт, связанный с рибосомой.

Уникальный рестрикционный сайт ХЬа! расположен в пределах сайта связывания с рибосомой в 16 пл, передтрансляционныминициирующи л метиониновым кодоном.

Сайт рестрикции РЧОП, находящийся.на

105 п.о. выше от трансляционного концевого кодона кодирующей последовательности

ipp, заменен на сайт рестрикции BamHI пу. тем ввода синтеэирбванной связующей лолекулы ДН К (5 -CCGGATCCGG-3

Collaborative Research inc., 128 Spring

Street, Lexington, Maccaryceme 02173). Кодирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность, соответствующая 3 нетран" слируемой зоне информационной РНК, следует за сайтом BamHI, Плаэмида pEN021 включает также некоторые независимые последовательности на 850 п.о., расположенные ниже гена !рр в хромосоме E.coli.

Как показано на фиг.2-4, плазмида

pKEN021 образована от плазмиды pKENlH следующим образом. Примерно 50 мкг плазмиды pKEN (101 на фиг,2) рестрицировалась

25 единицами фермента H pall (если нет других оговорок, рестрикционные ферменты и определения единиц соответствуют New

England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, Maccarycemc 01915) в 300 мкл буферного раствора IX Hpal (10 ммоль, Трис, HCI, рН

7,4; 10 ммоль MgCI ммоль КС!; и 6 ммоль

Р-меркаптоэтанола) при 37 С в течение 2 ч.

Смесь экстрагировалась двукратно 300 мкл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50, извлеченная водная фаза повторно осаждалась 2.5 обьемами этанола и 0,1 объемом 3 моль, адектата натрия (NaOAc).

Гранула ДНК растворялась в 100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционировалась на 57 полиакриламидном геле (соотношение акриламид:бис составляло

29:1 во всех полиакриламидных гелях за исключением тех случаев, где оговорено oco6o). Этот гель окрашивался в растворе, содержащем 0,5 лкгlмл этилбромида, и виэуализировалась ДНК полоса в длинноволновом ультрафиолетовом свете.

Ограничительный фрагмент 950 ор Hpall был изолирован и извлечен из геля путем электроэлюирования в диализный мешок, После экстракции смесью фенол /СНС!з и осаждения этанолом извлеченная ДНК (2,5 мкг) растворялась в 25 мкл TEN (10 ммоль

NaCI; 10 ммоль трис. HCI, рН 7,4 и л ммоль натрийэтилендинитролететраацетат (ЕДТА).

Г!римерно 2 мкг фрагмента 950 п,о.

Нра!! переваривалось рестрикционным ферментом Alul в 200 мкл буферного раствора iXAiul (50 мМоль NaCI; 6 мМоль Трис. HCt, рН 7,6; 6 мМмоль MgCI>; 6 мМоль Р-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционировалась 6 k-oM полиакриламидном геле и фрагмент 462 Alul извлекался и очищался как описано выше.

Фрагмент 462 bpAtul (1 мкг) растворялся в

10 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы (66мМольТрис, HCI, рН7,6; 10мМоль MgClg

10 мМоль дитиотрентол и 0,4 мМоль ATP), содержащего 150 пикомолей фосфорилированного связующего звена EcoRt (5 -GGAATTCC-3 иэ Cotlaborattve Research) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы. Посла инкубации при 4 С в течение 16 ч смесь нагревалась при 65 С в течение 10 лин и затем разбавлялась до 100 мкл таким образом, что имела состав буферного раствора IX icoRI (100 мМоль трис. HCI, рН 7,2; 50 мМоль NaCI; 10 мМоль М9С!2 и 6,ммоль Р-меркаптоэтанол), содержащего 40 ед, фермента EcoRi, По прошествии 2 ч выдержки при 37 С образец экстрагировался смесью фенол/СНС!з и осаждался этанолом. Затем ДНК растворялась в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК лигазы, содержащего Т4 ДНК лигазу и 0,1

t4Kã обработанной щелочной фосфатазой, вываренной с EcoRI плазмйды рВВ322 (102 на фиг.2), llocne сшивки при 4ОС в течение

16 ч полученная в результате ДНК использовалась для трансформации обычным образом (Е, Coli К12 НВ101 КВВ1 -15626).

Трансформанты отбирались на агаровых пластинах, содержаы их 12 мкг/ лл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции, как описано в работе Birnboim and

0oty, 1979 год, Nucleic Acids Research 7;

1513-1523, Была выбрана плазмида (103 иа фиг.2), содержащая фрагмент 466 Ьр XbalBarn Hl и использование в качестве исходного материала для следующего описанного этапа.

Примерно 2 мкг этой плазмиды (103 на фиг.3) расщеплялось 2 единицами фермента

HInd Ill в 50 мкл буферного раствора IX Hind

III (60 мМоль NaCI; 10 мМоль Трис. HCI, рН

7,4; 10 мМоль МоС! и 6 мМоль /3-меркептоэтанол) в течение 1 ч при 37 С. После того как реакционная смесь экстрагировалась смесью фенол/СНС!з и осаждалась зтанолом, ДНК растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеазы iX (300 мМоль NaCI; 30 мМоль NaOAc, рН 4,25; и 3 мМоль ZnCI2), содержащего 200 единиц нуклеазы Sl (Miles

Laboratories 30 W. 475, N.Aurora Road, NaperviIle, Jtl. 60566). По прошествии 1 ч

1836413 выдержки при 15 С реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС!э и

ДНК осаждалась этанолом. Вываренная с

Hirid ill, обработанная нуклеазой ДНК растворялась в 10 мкл буферного раствора Т4

ДНК лигазы, содержащего 20 пикомолей фоСфорилированных связующих звеньев

Harn Hl (5 -CCGGATCCGG-3 из Collaborative

Research) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы. После 16 ч выдержки при 4 С реакционная смесь нагревалась при 65 С в течение 10 мин с

10 целью инактивации лигазы и затем разбавлялась до 100 мкл с целью получения буферного раствора IX Bam HI (150 мМоль NaCI;

20мМоль Трис, HCI, pH 8,0; 10мМоль МдС(2 15 и 6 MMoflb меркаптоэтанол). содержащего

20 единиц фермента Баm Нi. Посл 2 1 выдержки rfpf! 37 С смесь подвергалась,очистке на 1",ь-ом агарозно, f enе, Это. Ге.,;, окрашивался этилбромидом, и более круп- 20 ный фраг1лент (- 4,5 кв) извлекался путем вырезания полосы этого фрагмента из Геля, эл10ирования этОГО фраг1лента после замораживания агароэного кре1лнезема и последующей очистки путем экстракции с1лесью 25 фенол/СНС(з и Осаждения этанолом. Желаемый фрагмент может быть также выделен из агарозного геля с использованием мемб- . раны NA45(Schleicherand Schuell) согласно рекомендации изготовителя. 30

Извлеченный фрагмент имеет липкие концы и его растворяли в 20 мкл буферного раствора лигазы Т4 ДНК, содержащего лигаэу Т4 ДНК. По прошествии 16 ч выдержки

4ОС ДНК использовалась для трансформа- 35 ции Е. coli K12 HB101 (NRR (.Б-15626).

Трансформанты отбирались на стойкость к ампициллину (Арй1 при 100 мкг!мл и на чувствительность к тетрациклину (TeS) при 10 . мкг/мл, Некоторые плазмидь1, полученные 40 согласно описанию Birnboim из колоний

ApR TcS, исследовались на отсутствие сайта

Hind llI и на присутствие единственного сайта Ва т1 Hl. Последовательное расщепление EcoRI, Sall приводило к образованию 45 двух меньших фрагментов, размером 466 п.о. и 305 п.о. и значительно более широкого фрагмента, Была выбрана плазмида (104 на фиг.3) с.этими характеристиками, затем она была модифицирована для превращения 50 сайта EcoRI, расположенного выше промотора Ipp, в сайт Hand lli.

Эта модификация сопровождалась первым частичным расщеплением 2 мкг плазмиды (104 на фиг.3) в 100 мкл буферного 55 раствора IX EcoRI с ферментом EcoRI, Реакция прекращалась при инактивации нагреванием при 65 С и экстра ции смесь фвнол/СНС з реакционной смеси, Осуществлялось осаждение ДНК этанолом. Гранула

ДН К растворялась в 200 мкл буферного раствора нуклеаэы IX, содержащего 1000 ед/мл нуклеазы Sl, и инкубировалась при 12"C f3 течение часа, Реакция прекращалась путем экстракции смесью фенол/СНС!з и ДНК осаждалась этанолом. Гранула ДНК снова суспензировалась в 10 мкл буферного раствора Т4 ДН К лигазы, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного связующего звена Hind И (5 -ССААССТТСС-5, (иэ

СОИаЬогабче Research) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы.

После 16 ч выдержки при 4 С смесь нагревалась в течение 10 мин при 65 С, раэбавлялась до 150 мкл с получением композиции буфера IX Hind Ill,ñîäåðæàùåãî

10 единиц фермента Hind iii, инкубиравалась в течение 2 ч при 37"С и затем фрaêöè1 огГР В. 16C.

Самая крупная полоса (зквивале111ная линейной полной длины плазмиде) извлекалась обычным образом, оч11щалась, растворялась в 20 мкл буферного раствора

Т4 лигазы, содержащего Т1 лигазу, инкyб11ровалась в течение 16 ч при 4 С и испол1-зовалась для трансформации Е. co!i IB i 01 (ЧЯР Ы-15626). Трансформант ApR, со;..ижащий плазмидную ДНК, анализира1а: ".ë

flocp дством рестрикц1лонного а11ал1 »" БРла отобрана плазмида (105 на фиг.3) с фрагментом 500 вр EcoRI-Н ".d III. Э1а плазмида затем была использова11а как вектор клонирования зоны 3 гена 1рр.

Примерно 2 мкг этой плазмиды (105 ffa фиг.4) вываривалось в 50 мкл буферного раствора IX Sall (150 мМоль NaCI; 6 мМоль Трис

HCI, рН 7,9; 6 мМоль Mg Clz и 6 мМоль Р-меркаптоэтанола) с 2 единицами фермента Sail в течение 1 ч при 37 С. Затем реакцио;1ная смесь разбавлялась до 150 мкл с получе1fèем композиции буферного раствора Багл I ll, содержащего 2 единицы фермента Багп Н1, После 1 ч выдержки при 37"С добавляли пр1.1лерно 2,5 единицы щелочной фосфатазы, смесь инкубироваггась при 65 С в течение 1 ч. Данны: продукт экстрагировался смесью фенол/СНС!з, осаждался этанолом, растворялся в TEN и использовался как вектор клонирования для фрагмента Ipp 3.

Для. получения фрагмента 1рр3 10 мкг плазмиды рКЕ (101 на фиг.21 расщеплялись в 200 мкл буферного раствора IX нРа!, содержащего 10 единиц фермента Нра!, в течение 2 ч при 37 С, После экстракции смесью фенол/СНС!з и осаждения этанолом

ДНК растворялась в 10 мкл буферного р,.створа лигазы 74 ДНК, содержащего 20 п«комолая фосфорилированнofo свяэу1оща1о звена Sall(5 -GGTCGACC-3 из Соиаboratlve

Research и Т4 ДНК лигазу, затем инкубиро1838413

2О ваг<ась в течение 16 ч при 4 С. Лигаза инак- тивировалась путем нагревания при 65ОC в течение 10 мин. Полученный материал раэбавлялся до объема 100 мкл и в результате получалась композиция буферного раствора IX, содержащего 10 единиц фермента Sall и и кубировался в течение 1 ч при 37 С, Реакционнагг смесь разбавлялась до

300 мкл, в результате получалась композиция буферного раствора IX Pvull (60 мМоль 10

NaCl; 6 мМаль Трис. HCI, рН 7,5,6 мМоль

MgClz; 6 мМоль )3-меркаптоэтанол), содержащего 10 единиц фермента Pyull. По прошествии 1 ч выдержки при 37 С ДНК фракционировалась на 5 /-ом полиакрила- 15 мидном геле, Примерно 0,5 мкг фрагмента

950 п.о. извлекалась, очищалось и растворялась в+EN, 0,2 микрограмма этого фрагмента раз.. бавлялись в 20 мкл буферного раствора 74 20

ДНК лигазы, содержащего 20 никомалей фосфорилированного связующего звена

Вam Н! (5 -CCGGATCCGG-3, иэ

Collaborative Research) и,2 единицы Т4 ДН К лигазы, затем инкубировапись в течение 25

16 ч при 4 С. Полученная ДНК затем нагревалась в течение 10 мин при 65 С, разбавлялась да абьема .100 мкл с образованием композиции буферного раствора iX Bam Н!, содержащего 20 единиц фермента Bam Hl, 30 инкубированнаго при 37 С в течение 2 ч, затем фракцианиравалась на 5 -ом полиэкрипамиднам геле с целью удаления избытка связующих молекул.

Полученный в результате фрагмент 950 35 п.о. с липкими концами Bam Hl u Sall очи-" щался обычным образом и растворялся в 20 мкл, буферного раствора Т4 ДН К лигаэы, содержащего 0,2 мкг обработанной BamlllSall плазмиды 105 и Т4 ДНК лигазы, После 40 инкубации в течение 16 ч при 4 С ДНК использовалась для трансформации E.coli К12

Н В 01 (К В Е В-15626).

Были получены плазмиды из трансформанта Арй и зти плазмиды анализировались 45 на наличие фрагмента Sall-Bam Hl. Желаемая плазмида (5,2 кв) была обозначена

pKF N 021 (106 на фиг.4).

10 мкг плазмиды pKEN021 расщеплялись при 37 С в 200 мкл буферного раствора 50

Bam Hl, содержащего 10 единиц каждого из ферментов Вагп: п1,и Xbal, в течение часа при 37 С. Желаемая ДНК, обработанная

Xbal-Bam Hl, затем обрабатывалась 2,5 единицами щелочной фос: ратазы в течение 1,5 55 ч при 65 С, экстрагировалась смесь фенал/СНС!з, извлекалась путем осаждения этанолам и растворялась в 50 мкл TEN для последующего использования (107 на фиг.4).

В. Построение плазмиды pNM575, Плазмида ptrp ED50 chGH800 (108 на фиг,5), описанная Martial и др., 1979 г., Science 205:602-607, использовалась в качестве источника ДНК, содержащей часть кодирующей последовательности nGH.

Этот фрагмент мог быть построен методом синтеза или Mor быть получен путем использования метода распознавания, описанного

Goodman и др„1979 г. "Методы в "-нзимологии, 68, 75 — 90,путем изоляции мРНК, кодирующей LGH, из слизистых оболочек человека. Часть LGH плазмиды ptrp ED50ch

GH800 содержит уникальный сайт рестрикции на 6 п,о. ниже трансляционного концевого кодона данной кодир/ющей последовательности. Этатсайт был заменен на сайт Bam III как описано ниже., Примерно 6 мкг плазмиды ptrp ED50

chGHB00 обрабатывалась 6 единицами

Smal в 200 мкл буферного раствора IX Sma (15 мМаль Трис. HCI, pH 3,0; 6 мМоль МЦС!2, 16 мМоль KCI; 6 мМоль / меркаптоэтанол) в течение 1,5 ч при 37"С. После полного вываривания осуществлялась экстракция смесвью фенал/СНС!з, ДНК извлекалась путем осаждения этаналам и затем растворялась в 24 мкл TEN 40 пикомалей фасфорилираваннога связующего звена Bam Hl (Collaborative Research), вводили в 0,5 мкг (0,2 микомаля кон цав) обработан най как указано выше плазмиды в 16 мкл буферного раствора лигазы, содержащего Т4 ДНК лигазу. Смесь инкубировапась в течение 2 ч при 22 С, в течение 16 ч при 4 С и затем в течение 10*мин при 65 С. Липкие концы

Bam Hl образовывались путем обычной обработки ферме«тав Bam Hi, Данный фермент расщеплял последовательность линкера, а также сайт Bam Hl. расположенный в начале;;лонираваннай LGH ДНК последовательности. Данное расщепление приводила к абразовани а фрагмента 691 п,о, с липкими концами Bam Hl, который отделялся на 6%-ом полилакрипамидном геле и затем извлекался обычным образом.

Выделенный фрагмент ДНК сшивался с

0,2 мкг обработанной Bam H I и щелочной фасфатазай плазмидай рВ 322 (фиг,5). По прошествии 16 ч выдержки при 4 С данный материал использовался для трансформации E.coli К12 IA221 (NRR LB-15014) в основном согласно процессу трансформации

Wensink и